材料和试剂

1. 1.5 mL反应管（ Sarstedt ，目录号：72.690.001）
2. 100 mm方形培养皿（ Thermo Scientific，目录号：11349273）
3. HEPES（Fisher Bioreagents，目录号：BP310-1）
4. NaCl（Fisher Chemicals，目录号：S/3161/65）
5. MgCl 2 （Sigma，目录号：63064）
6. DTT（ Melford Laboratories，目录号：D11000）
7. ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
8. 泛素（R&D Systems，目录号：U-100H-10M）
9. NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，迷你蛋白凝胶（Invitrogen，目录号：NP0322BOX）
10. NuPAGE MES-SDS运行缓冲液（20 × ）（Invitrogen，目录号：NP0002）
11. NuPAGE LDS 样品缓冲液（4×）（Invitrogen，目录号：NP0007）
12. β-巯基乙醇（ PanReac AppliChem，目录号：A1108）
13. SeeBlue Plus2 预染色蛋白质标准品（Invitrogen，目录号：LC5925）
14. Pierce TM 20× TBS 缓冲液（ ThermoFisher ，目录号：28358）
15. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
16. iBlot 2 硝酸纤维素转移叠层（Invitrogen，目录号：IB23001）
17. 乙醇（VWR 化学品，目录号：MFCD00003568）
18. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A3294）
19. 奶粉（漫威）
20. 单和多泛素化缀合物， mAb （FK2）抗体（ Ubiquigent ，目录号：68-0121-500）
21. Ub-K63小鼠抗人，克隆：HWA4C4（Affymetrix eBioscience TM ，目录号：14-6077-82）
22. HRP缀合的抗小鼠抗体（Promega，目录号：W4021）
23. Clarity Western ECL 底物（Bio-Rad，目录号：1705060）
24. Clarity Max Western ECL 底物（Bio-Rad，目录号：1705062）
25. 纯化的重组 E1（UBA1a，在还原条件下制备，储存：-70 °C）（Burge 等人，2020）
26. 纯化的重组 E2（UBC2，在还原条件下制备，储存：-70 °C）（Burge 等人，2020）
27. 纯化的重组 E2 变体（UEV1，储存：-70 °C）（Burge 等人，2020）
28. 纯化的重组 E3（GST-BIRC2 或 GST-RNF8，储存：-70°C）（ Ubiquigent ，目录号：63-0015-025 或 63-0021-025）
29. 双泛素，K63连接（储存：-70°C）（ Ubiquigent ，目录号：60-0107-010）
30. 反应缓冲液 (10 × )（见配方）
31. SDS-PAGE 样品缓冲液 (4 × )（参见配方）
32. 1 × TBSt （见食谱）

设备

1. 干式加热器 (Grant QBD1)
2. 蛋白质电泳设备（ XCell SureLock微型电池，EI0001)
3. 蛋白质转移系统（ iBlot 2 Dry Blotting System， Thermo Fisher Scientific）
4. 凝胶摇杆
5. 微孔板振荡器（Grant，PMS-1000i）
6. Chemi印迹成像仪（ ChemiDoc成像系统，Bio-Rad）

程序

A. 二泛素形成测定
1. 在冰上的 1.5 mL 管中制备三种反应混合物，其中含有以下试剂：100 nM E1、2.5 μM E2、2.5 μM E2 变体和 100 μM 泛素，在 50 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl的缓冲液中2、2 mM DTT 和 5 mM ATP，总体积为 40 µL。典型的试剂浓度和体积在表 1 中给出。如果需要受控的反应开始，可以在设置过程中从反应混合物中省略 E1 或 ATP 并添加以启动反应（通过轻轻轻弹试管或用移液管搅拌混合在最后的试剂添加过程中提示）。还应进行三个对照反应，省略 E2、E2 变体或 E2 和 E2 变体，证明二泛素形成不是单独的 E2 或 E2 变体的活性，或来自E1。

表 1. 反应组成
*可排除在 E3 合作分析中
**仅包含在 E3 合作分析中

2. 在 37°C 的干块加热器中孵育反应混合物 0 分钟、30 分钟和 90 分钟。
3. × SDS-PAGE 样品缓冲液 (13.3 µL)停止反应（参见食谱）。
4. 使用干块加热器在 70°C 下加热样品 5 分钟。
5. NuPAGE mini 蛋白质凝胶上以 1 ×的速度运行每个样品 20 µL 使用电泳系统的NuPAGE MES-SDS 运行缓冲液。将 5 μL 的SeeBlue Plus2 预染色蛋白标准品加载到凝胶的单个泳道中，以便对稍后在西方印迹期间检测到的条带进行分子量比较。在 200 V 下运行凝胶，直到最低分子量标记距凝胶底部约 0.25 厘米（约 35 分钟）。如果需要同时分析泛素偶联物和 K63 连接的泛素偶联物，请在每张凝胶上运行两个凝胶，每个反应中的样品为 20 µL。在评估 K63 连接的泛素的存在时，凝胶上应包含 100 ng K63 连接的双泛素样品，当用 Ub-K63 抗体印迹时，这将作为阳性对照。
6. 在室温下在凝胶摇杆上将凝胶在方形培养皿中的 20% 乙醇中孵育 10 分钟。
7. 根据制造商的说明，使用iBlot 2 干式印迹系统和iBlot 2 硝酸纤维素转移堆栈将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在 20 V 下执行传输 1 分钟，然后在 23 V 下执行 4 分钟，最后在 25 V 下执行 7 分钟。

使用 FK2 抗体 ( Ubiquigent )评估泛素缀合物的形成
8. ×中的 5% BSA 覆盖膜以封闭膜 TBSt （见食谱）在 4 °C 的微孔板振荡器上的方形培养皿中过夜。
9. 在 10 mL 的 1% BSA 中以 1:1,000 稀释 1 ×使用单泛素化和多泛素化偶联物mAb (FK2) 抗体 TBSt在方形培养皿中。在 4°C 下在微孔板振荡器上孵育 1 小时。
10. ×洗涤膜 TBSt 10 分钟，室温下，在微孔板振荡器上的方形培养皿中进行3 次。
11. 在 10 mL 的 5% BSA 中以 1:10,000 稀释度应用 HRP 偶联的抗小鼠二抗 1 × TBSt在方形培养皿中。在 4°C 下在微孔板振荡器上孵育 1 小时。
12. ×洗涤膜 TBSt在室温下在方形培养皿中，在以速度 4 运行的微孔板振荡器上 3 次 10 分钟。
13. 根据制造商的说明应用透明西方 ECL 基板。
14. 使用合适的成像系统（例如， ChemiDoc成像系统、Bio-Rad）测量化学发光。

ThermoFisher )评估 K63 连接的泛素缀合物的形成
15. ×中的 5% (w/v) 牛奶覆盖膜以封闭膜 TBST 。在 4°C 的微孔板振动器上的方形培养皿中孵育 1 小时。
16. 将 Ub-K63 小鼠抗体以 1:250 稀释在 5 ml 5% 牛奶中 1 × TBSt在方形培养皿中。在 4°C 下在微孔板振荡器上孵育过夜。
17. ×洗涤膜 TBSt 10 分钟，室温下，在微孔板振荡器上的方形培养皿中进行3 次。
18. ×使用 HRP 偶联的抗小鼠二抗 TBSt在方形培养皿中。在 4°C 下在微孔板振荡器上孵育过夜。
19. ×洗涤膜 TBSt 10 分钟，室温下，在微孔板振荡器上的方形培养皿中进行3 次。
20. 根据制造商的说明应用透明西方 ECL基板。
21. 使用合适的成像系统测量化学发光。

B. E3合作测定
1. 在含有以下试剂的冰上制备 1.5 mL 反应管中的反应混合物：100 nM E1、2.5 μM E2、1 μM E3 和 100 μM 泛素在 50 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl 2的缓冲液中， 2 mM DTT 和 5 mM ATP，总体积为 40 μL。如果相关，还可以包括 2.5 µM 的 E2 变体（例如，当与 E2 一起参与二泛素形成时）。典型的试剂浓度和体积在表 1 中给出。如果需要受控的反应开始，可以在设置过程中从反应混合物中省略 E1 或 ATP 并添加以启动反应（通过轻轻轻弹试管或用移液管搅拌混合在最后的试剂添加过程中提示）。
为了确定观察到的活动是否是由 E3 引起的，应进行四个对照反应，省略 E3、E2、E2 变体或 E2 和 E2 变体。这允许评估在没有 E3 的情况下可能是 E1 和 E2 的结果的任何活动，以及 E3 是否与 E2 或 E2 变体合作，单独或组合工作。
2. °C的干块加热器中孵育反应60 分钟或根据需要进行其他时间。
3. 执行步骤 A3 - A21。

数据分析

FK2 抗体可检测所有泛素结合物，这些结合物在蛋白质印迹上显示为化学发光条带。将这些条带与预染色的梯子进行比较可以确认二泛素的形成。这在图 2A 中可以看出，其中利什曼原虫UBC2 和 UEV1 孵育 30 或 90 分钟导致形成双泛素的清晰条带（UBA1a-Ub 和 UBC2-Ub 复合物也观察到次要条带，因为它们也含有缀合的泛素）。 FK2 抗体还可用于检测底物和/或多泛素化，如 E3 合作测定中所需的（图 3A）。在此示例中，当利什曼原虫UBC2 与人类 E3s BIRC2 或 RNF8 一起孵育时，可以看到多个泛素结合条带。
使用 Ub-K63 抗体进行印迹可以对 K63 连接的泛素缀合物的形成进行具体评估（图 2B 和图 3B）。因此，使用 FK2 和 Ub-K63 抗体评估相同的反应产物能够分析 FK2 抗体检测到的缀合物是否是 K63 连接的。例如，在图 2 中，用 FK2 抗体印迹时观察到的双泛素带（图 2A）在用 Ub-K63 抗体印迹时也观察到（图 2B），表明由 UBC2 形成的双泛素带UEV1 是 K63 连锁的。然而，在 E3 合作试验（图 3）中，UBC2 与 BIRC2 或 RNF8 孵育产生的偶联物由 FK2 抗体（图 3A）检测到，而 Ub-K63 抗体（图 3B）未检测到，这表明这些偶联物不是 K63 连接的。

图 2. 二泛素形成测定。
A) 使用 FK2 泛素偶联抗体进行印迹。 B) 使用 K63 连接的泛素抗体进行印迹。转载自Burge 等人。（2020 年）。

图 3. E3 合作分析。
A) 使用 FK2 泛素偶联抗体进行印迹。 B) 使用 K63 连接的泛素抗体进行印迹。转载自Burge 等人。（2020 年）。

笔记

1. UBA1a 和 UBC2 需要在还原条件下进行纯化以保持催化活性：5 mM β-巯基乙醇包含在用于镍亲和纯化的纯化缓冲液中，2 mM DTT 或 1 mM TCEP 用于尺寸排阻色谱。蛋白质在-70 °C 下储存在含有 2 mM DTT 或 1 mM TCEP 的缓冲液中（注意：在不含还原剂的缓冲液中纯化的 UBA1a 和 UBC2没有催化活性）。避免冻融循环以延长蛋白质的储存寿命。
2. 通过以下凝胶电泳和转移条件的改变实现了成功的测定：首先，在 25 mM Tris 和 192 mM 甘氨酸 pH 8.3 的电泳缓冲液中运行4% – 20% Mini-Protean TGX 凝胶 (Bio-Rad) 上的样品, 在 200 V 下 35 分钟;其次，在使用 Trans-Blot SD 半干转移细胞转移之前，将凝胶、硝酸纤维素膜和滤纸在 25 mM Tris、192 mM 甘氨酸和 10% v/v 甲醇的转移缓冲液中孵育 30 分钟（ Bio-Rad) 在 25 V 下 25 分钟。
3. 如果在 E3 合作测定中发现低活性，请尝试将孵育温度提高到 37°C。

食谱

1. 反应缓冲液 (10 × )
500 mM HEPES pH 7.5
1 M 氯化钠
100 毫米氯化镁2
20 毫米数字地面电视
2. SDS-PAGE 样品缓冲液 (4 × )
95% NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4 × )
5% β-巯基乙醇
3. 1 × TBSt
5% (v/v) Pierce TM 20 × TBS 缓冲液
0.05% (v/v) Tween-20
94.95% (v/v) 去离子 H 2 O

致谢

该协议改编自 Burge 上发表的研究等。（2020 年）。我们要感谢Ubiquigent为 RB 提供了 3 个月的实习，在此期间开发了此协议。这项工作得到了 RB 的医学研究委员会学生奖学金 (MRC MR/N018230/1) 和 JCM 的Wellcome信托基金 (200807/Z/16/Z) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益

参考

1. Andersen, PL, Zhou, H., Pastushok, L., Moraes , T., McKenna, S., Ziola , B., Ellison, MJ, Dixit, VM 和 Xiao, W. (2005)。两种泛素结合酶变体 Mms2 和 Uev1A 对 Ubc13 功能的不同调节。细胞生物学杂志 170（5）：745-755。
2. Burge, RJ, Damianou , A., Wilkinson, AJ, Rodenko , B. 和 Mottram, JC (2020)。利什曼原虫分化需要由 UBC2-UEV1 E2 复合物介导的泛素结合。公共科学图书馆病原体16(10)：e1008784。
3. Hofmann, RM 和Pickart , CM (1999) 。非规范 MMS2 编码的泛素缀合酶在用于 DNA 修复的新型多泛素链组装中的功能。 96 号牢房：645 - 53。
4. Komander , D. 和 Rape, M. (2012)。泛素代码。 Annu Rev Biochem 81：203-229。
5. McKenna, S.、 Spyracopoulos , L.、 Moraes , T.、Pastushok, L.、 Ptak , C.、Xiao, W. 和 Ellison, MJ (2001)。 Ubc13 介导的多泛素化需要泛素和人类 DNA 修复蛋白 Mms2 之间的非共价相互作用。生物化学杂志 276（43）：40120-6 。
6. Pastushok, L., Moraes , TF, Ellison, MJ 和 Xiao, W. (2005)。单个 Mms2“关键”残基插入 Ubc13 口袋决定了人类 Lys63 泛素缀合复合物的界面特异性。生物化学杂志 280（18）：17891-17900 。
7. Wang, S.、Cao, L. 和 Wang, H. (2016)。拟南芥泛素结合酶 UBC22 是雌性配子体发育所必需的，并且可能参与 Lys11 相关的泛素化。 J Exp Bot 67（11）：3277-3288。
8. Wu, PY, Hanlon, M., Eddins , M., Tsui , C., Rogers, RS, Jensen, JP, Matunis , MJ, Weissman, AM, Wolberger , C. 和Pickart , CM (2003)。泛素结合酶家族中的一个保守催化残基。 EMBO J 22（19）：5241-5250。
9. Zheng, N. 和Shabek , N. (2017)。泛素连接酶：结构、功能和调节。 Annu Rev Biochem 86：129-157。