材料和试剂
1. MRC 2孔结晶板（ Swissci ，Hampton Research，目录号：HR3-082）
2. 24孔XRL板（Molecular Dimensions，目录号：MD3-11）
3. 添加剂屏幕（ Hampton Research，目录号：HR2-428）
4. 显微镜盖玻片（Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号：19803）
5. 玻璃毛细管（Charles Super Company，目录号：02-SG）
6. Amicon 8050超滤池（ Amicon ，目录号：UFSC05001）
7. 30 kDa超滤盘（EMD Millipore Corporation， Biomax ，目录号：PBTK04310）
8. 大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：71402）
9. pET-30a（+）载体（ Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：69909）
10. 双色高粱CPR2c基因（ Sobic.006G245400 ）（由Genscript合成）
11. 霉素（IBI Scientific，目录号： IB02120）
12. IPTG（ GoldBio ，目录号： I2481C100）
13. NADP + （Alfa Aesar ，目录号：T23B015）
14. PEG 3,350（ Sigma-Aldrich，目录号： P4338 ）
15. 镍-NTA 树脂（G-biosciences，目录号：786-940）
16. 索引晶体屏幕套件（ Hampton Research，目录号：HR2-144）
17. Luria-Bertani (LB) 培养基（见配方）
18. 裂解/洗涤缓冲液（参见配方）
19. 洗脱缓冲液（参见配方）
20. 羟基磷灰石柱缓冲液 A（参见配方）
21. 羟基磷灰石柱缓冲液 B（参见配方）
22. 最终缓冲区（参见配方）
23. 结晶缓冲液（水晶筛 F12）（见配方）

设备

1. 水晶凤凰（Art Robbins Instruments）
2. ÄKTA pure（ GE Healthcare， ÄKTA pure ，目录号：29014834 ）
3. 450型超声波仪（Branson Ultrasonics，目录号：22-309783）

软件

1. HKL2000 ( https://hkl-xray.com/hkl-2000 )
2. 凤凰 ( https://phenix-online.org/ )
3. 库特（ https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ ）

程序

A. 基因克隆
1. 具有 N 端 6×His 标签且没有天然 N 端疏水膜锚定区 (Δ1-50)的Sorghum bicolor CPR2c 基因 ( Sobic.006G245400 ) 克隆到载体 pET-30a(+) 中进行过表达。

B. 细胞转化
1. 将大肠杆菌Rosetta 2 (DE3) 感受态细胞置于冰上。
2. 将 1 μL质粒 (20 ng/ μL ) 添加到 20 μL感受态细胞中。
3. 在冰上孵育 5 分钟。
4. 热休克 30 秒。
5. 在冰上孵育 2 分钟。
6. 向感受态细胞中加入 80 μL的 LB 培养基。
7. 在 37 °C 下以 220 rpm摇动1 小时。
8. μL的卡那霉素将所有细胞放在 LB 琼脂板上，并孵育过夜。

C. 蛋白质表达
1. 从 LB 琼脂板中挑选一个菌落，在 5 mL 的 LB 培养基中生长，并在 37 °C 下过夜，辅以 50 ng/ μL卡那霉素。
2. °C 下用 50 ng/ μL卡那霉素从 5 mL 培养物中培养 20 mL 的起始培养物。
3. 将 20 mL 的起始培养物转移到 3 L 的 LB 培养基中，含有 50 ng / μL卡那霉素。
4. 在 220 rpm 和 37 °C下摇动，直到 OD 600达到 0.4 – 0.6。
5. 将介质冷却至 25 °C ，并添加 0.5 mM 的 IPTG 进行诱导。
6. °C 下诱导细胞16 小时。
7. × g和 4 °C 下收获细胞10 分钟。

D. 蛋白质纯化
1. 用裂解缓冲液重悬细胞。
2. 将输出控制设置为 9，占空比设置为 90%。将细胞声波 30 秒，然后在冰上休息 5 分钟，直到均匀。
3. 在 34,000 × g和 4 °C 下离心1 小时以去除细胞碎片。
4. 在含有 20 mL 的镍-NTA 树脂的重力柱上加载澄清的裂解液，并用裂解缓冲液预平衡。
5. 用 200 mL 的相同缓冲液洗涤。
6. 用 100 mL 的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。
7. kDa截止膜的Amicon 8050 超滤池对羟基磷灰石柱缓冲液 A进行浓缩液和缓冲液交换。
8. 在羟基磷灰石柱上加载缓冲交换蛋白。
9. 用 100 mL 的 5% 羟基磷灰石柱缓冲液 B 洗涤。
10. 用 10% 羟基磷灰石柱缓冲液 B 洗脱蛋白质。
11. 使用带有 30 kDa截止膜的Amicon 8050 超滤池，将浓缩液和缓冲液与最终缓冲液进行交换。

E. 初始结晶设置
1. 将纯化的蛋白质浓缩至 30 mg/mL，由 CPR 的摩尔消光系数（21.4 mm -1 cm -1 ）确定。
2. 在结晶前加入 1.2 mM的 NADP + 。
3. 使用带有索引晶体屏幕套件的 MRC 2 井结晶板运行 Crystal Phoenix，并在室温（22 °C）下设置。该液滴含有 0.2 μL蛋白质溶液和 0.2 μL筛选溶液。
4. 小晶体在两天内出现在条件 F12（参见食谱中的结晶缓冲液）中（图 1A）。
5. 在盖玻片上混合 1.6 μ L结晶缓冲液、2 μ L蛋白质溶液和 0.4 μ L添加剂屏幕来复制和优化晶体。
6. 在 24 孔板中设置悬滴蒸汽扩散，在水库中使用 0.5 mL 的结晶缓冲液。
7. 针状晶体在 3-5 天内出现添加剂筛选条件 31（1,5-二氨基戊烷二盐酸盐）（图 1B）。

F. 水晶播种
1. 混合 2.4 μL结晶缓冲液、3 μL蛋白质溶液和 0.6 μL添加剂屏幕。
2. 从前一滴中吸出一个针状晶体，放入新的 6 μL结晶滴中，并设置悬滴。
3. 大晶体在一周内出现（图 1C）。
4. 每隔三天将盖玻片转移到装有 0.5 mL 30% (v/w)、40% (v/w) 和 50% (v/w) PEG 3350 的水库中，以进行连续脱水。
5. 在 50% (v/w) PEG 3350 中平衡两天后，将脱水晶体快速冷冻在液氮中进行 X 射线衍射。

图 1. SbCPR2c 晶体的优化。
(A) 从筛选的命中 [索引条件 F12 (参见配方中的结晶缓冲液)] 中获得的晶体。 (B) 通过添加剂溶液优化从悬滴中获得的晶体。 (C) 从播种技术中获得的晶体。

G. 数据收集和结构确定
1. 通过使用光束尺寸 100 × 100 μm 、10 秒和每帧 1 度和总共 180 度来衍射光束线上的晶体。
2. 使用 HKL2000 对数据进行索引、集成和缩放。
3. 用适当的模型 [在我们的例子中，SbCPR2b (PDBID: 7SUX)] 用 PHENIX 进行分子替换，运行AutoBuild并用 PHENIX 和 Coot 优化结构。

图 2. 晶体的分辨率从 11.7 Å （非播种悬滴晶体）提高到 4.5 Å （播种晶体）

数据分析

衍射数据使用 HKL2000 进行索引、积分和缩放。在 PHENIX 软件中使用 SbCPR2b 结构（PDBID：7SUX）和 Phaser-MR（全功能）进行分子置换。不对称单元中的分子数是用马修斯系数计算的（马修斯，1975）。然后运行AutoBuild以使用 SbCPR2c 序列构建模型。在使用phenix.refine对 XYZ（倒数空间）、XYZ（实空间）和单个 B 因子进行完全细化之前，完成了刚体细化。各个残留物在 Coot 中进行了精炼。

笔记

1. 结晶和添加剂溶液是专门针对 SbCPR2c 的。有必要初步筛选目标蛋白质的最佳条件。如果晶体形状不佳，使用添加剂屏幕解决方案可以纠正不良晶体边缘。
2. 使用添加剂筛网溶液可能会导致沉淀。放置晶种时，应避免对液滴造成干扰，否则会混合溶液并阻碍晶体生长。

食谱

1. Luria-Bertani (LB) 培养基
试剂最终浓度数量
胰蛋白胨 10克/升 10 克
酵母抽提物 5克/升 5克
氯化钠 10克/升 10 克
dH 2 O 不适用不适用
全部的不适用 1,000 毫升

2. 裂解/洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠 300 毫米 17.532 克
特里斯 50毫米 6.057 克
咪唑 20毫米 1.36 克
dH 2 O 不适用不适用
盐酸 (12 M) 不适用根据需要将pH调节至8
全部的不适用 1,000 毫升

3. 洗脱缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠 300 毫米 17.532 克
特里斯 50毫米 6.057 克
咪唑 250 毫米 17.02 克
dH 2 O 不适用不适用
盐酸 (12 M) 不适用根据需要将pH调节至8
全部的不适用 1,000 毫升

4. 羟基磷灰石柱缓冲液 A
试剂最终浓度数量
KH 2 PO4 5毫米 0.68 克
氢氧化钠不适用根据需要调节 pH 至 6.8
dH 2 O 不适用不适用
全部的不适用 1000 毫升

5. 羟基磷灰石柱缓冲液 B
试剂最终浓度数量
KH 2 PO 4 500 毫米 68 克
氢氧化钠不适用根据需要调节 pH 至 6.8
dH 2 O 不适用不适用
全部的不适用 1000 毫升

6. 最终缓冲区
试剂最终浓度数量
羟基磷灰石柱缓冲液 B 50毫米 100 毫升
dH 2 O 不适用 900 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

7. 结晶缓冲液（水晶屏F12）
试剂最终浓度数量
氯化钠 (2 M) 200 毫米 5 毫升
HEPES (1 M, pH 7.5) 100 毫米 5 毫升
dH 2 O 不适用不适用
PEG 3350 (50%, m/v) 25% (w/v) 25 毫升
全部的不适用 50 毫升

致谢

原始研究得到了 NSF (CHE-1804699, MCB-2043248) 和 Murdock Charitable Trust (CHK) 的资助。这项研究使用了先进光源（光束线 5.0.2 和光束线 5.0.3）的资源，它是美国能源部科学用户设施办公室，合同号为。 DE-AC02-05CH11231。该协议源自原始研究论文(Zhang et al., 2022b) 。

利益争夺

没有竞争利益。

参考

1. Abergel , C. (2004)。通过蛋白质晶体的快速干燥显着改善了 X 射线衍射。 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60（第 8 篇）：1413-1416。
2. Bergfors , T., Rouvinen , J., Lehtovaara , P., Caldentey , X., Tomme , P., Claeyssens , M., Pettersson , G., Teeri , T., Knowles, J. 和 Jones, TA (1989 ）。里氏木霉纤维二糖水解酶 II 核心蛋白的结晶。分子生物学杂志209（1）：167-169。
3. Caylor，CL， Dobrianov ，I.，Lemay，SG， Kimmer ，C.， Kriminski ，S.，Finkelstein，KD，Zipfel，W.，Webb，WW，Thomas，BR，Chernov，AA，等。 (1999)。蛋白质晶体中的大分子杂质和无序。蛋白质36（3）：270-281。
4. Jensen, K. 和Møller , BL (2010)。植物 NADPH-细胞色素 P450 氧化还原酶。植物化学71：132-141。
5. Haebel , PW, Wichman , S., Goldstone, D. 和 Metcalf, P. (2001)。与电子转运蛋白 DsbD 的 α 结构域复合的二硫键异构酶 DsbC 的结晶和初始晶体学分析。结构生物学杂志136（2）：162-166。
6. Heras, B. 和 Martin, JL (2005)。用于提高蛋白质晶体衍射质量的后结晶处理。 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61（第 9 篇）：1173-1180。
7. Holcomb, J.、 Spellmon , N.、Zhang, Y.、 Doughan , M.、Li, C. 和 Yang, Z. (2017)。蛋白质结晶：避开 X 射线晶体学的瓶颈。目标生物物理学4（4）：557-575 。
8. 马修斯，BW（1975）。 T4噬菌体溶菌酶的预测和观察到的二级结构的比较。生物化学生物物理学报405（2）：442-451。
9. Munro, AW, Noble, MA, Robledo, L., Daff, SN 和 Chapman, SK (2001)。测定人 NADPH-细胞色素 P450 还原酶的氧化还原特性。生物化学40（7）：1956-1963。
10. 菲利普斯，AH 和兰登，RG（1962 年）。肝三磷酸吡啶核苷酸-细胞色素 c 还原酶：分离、表征和动力学研究。生物化学杂志 237：2652-2660 。
11. 罗德斯，G.（2006 年）。第 3 章 - 蛋白质晶体。在：Rhodes, G. (Ed.) Crystallography Made Crystal Clear (第三版)。学术出版社，31-47。
12. Stura , EA 和威尔逊, IA (1991)。条纹播种技术在蛋白质结晶中的应用。 J晶体生长110（1）：270-282 。
13. Timasheff , SN (1995)。蛋白质结构的溶剂稳定化。方法 Mol Biol 40：253-269。
14. Wang, M., Roberts, DL, Paschke , R., Shea, TM, Masters, BSS 和 Kim, J.-JP (1997)。 NADPH-细胞色素 P450 还原酶的三维结构：含有 FMN 和 FAD 的酶的原型。 Proc Natl Acad Scie USA 94(16): 8411-8416。
15. Zhang, B.、Kang, C. 和 Davydov, DR (2022a)。用 FRET 和压力微扰光谱法探索了双色高粱 NADPH-细胞色素 P450 还原酶氧化还原循环中的构象重排。生物学（巴塞尔） 11（4）。
16. Zhang, B., Munske, GR, Timokhin , VI, Ralph, J., Davydov, DR, Vermerris , W., Sattler, SE 和 Kang, C. (2022b)。对来自双色高粱的细胞色素 P450 还原酶的灵活性及其对木质素组成的影响的功能和结构洞察。生物化学杂志 298（4）：101761 。
17. Zhu, DY, Zhu, YQ, Xiang, Y. 和 Wang, DC (2005)。通过动态播种优化蛋白质晶体生长。 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61（Pt 6）：772-775。