材料和试剂

质粒和载体
1. LentiCas9-Blast（ Addgene ，目录号：52962）
2. Cas9-reporter [pKLV2-U6gRNA5（ gGFP ）-PGKBFP2AGFP-W]（ Addgene ，目录号：67980）
3. psPAX2（ Addgene ，目录号：12260）
4. pMD2.G（ Addgene ，目录号：12259）
5. pEGFP-N3（ Clontech ，目录号：6080-1）
6. LentiGuide -Puro Brunello激酶组文库（ Addgene ，目录号：1000000082）

细胞培养、转染和转导
1. 6孔板（Greiner，目录号：657160）
2. T175烧瓶（Greiner，目录号：658170）
3. 15 mL管（Falcon，目录号：734-0452）
4. 0.45 µm 过滤器（Millipore，目录号：SLHA033SS）
5. Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM， Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：41966-052）
6. Iscove改良的 Dulbecco 培养基（IMDM， Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：12440-061）
7. 聚乙烯亚胺，线性（PEI， Polysciences ，目录号： 24313-2)
8. HEK293T-17（ATCC，目录号：CRL11268）
9. Namalwa （DSMZ，目录号：ACC24）
10. 冷冻管（Costar，目录号：430488）
11. 嘌呤霉素（ Invivogen ，目录号：ant-pr-1）
12. 杀稻瘟菌素S 盐酸盐（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：R210-01）

细胞培养基补充剂（使用前添加；参见食谱）
1. 胎牛血清（FBS）（ HyClone ，目录号：SH30071.03）
2. L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：59202C）
3. 青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）

文库扩增
1. 94 × 16 mm 板（Greiner，目录号：633181；如果需要，可以使用其他尺寸）
2. Endura TM电感受态细胞（ Lucigen ，目录号：60242-1）
3. 琼脂（BD，目录号：214010）
4. 氨苄青霉素（Sigma，目录号：A5354）
5. 核键 Xtra midi prep kit（ Macherey -Nagel，目录号：740420.50）
6. LB（BD，目录号：240230）
7. 含有抗生素的 LB 培养基（见配方）
8. SOC 培养基（见配方）
9. D-葡萄糖（Merck Millipore，目录号：1083371000）
10. 含有抗生素的琼脂板（见食谱）

附着力
1. 96孔高结合平底板（Greiner，目录号：655061）
2. 人血浆纤连蛋白（FN）（Sigma-Aldrich，目录号：F2006）
3. 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P6282）
4. 牛血清白蛋白组分V（BSA）（Roche，目录号： 10735094001)
5. 依鲁替尼（ SelleckChem ，目录号：S2680）
6. 山羊 F（ab'）2 抗人 IgM（Southern Biotech，目录号：2022-14）
7. Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
8. 多通道移液器储液罐（Corning，目录号：4870）
9. 25％戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：354400）
10. 结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）
11. 乙醇（Merck Millipore，目录号：1009831000）
12. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fresenius Kabi ，目录号：M090001/13）
13. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
14. 20% 乙醇中的 0.5% 结晶紫（见配方）
15. 0.5 M EDTA，pH 8.0（见配方）

基因组 DNA 分离
1. Quick DNA mini prep kit（ Zymo Research，目录号：D3024）
2. Qubit 广泛试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32850）

PCR 和二代测序
1. Phusion TM高保真 DNA 聚合酶（包含 5 × HF 缓冲液）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：F530S）
2. 10 mM dNTP 混合物（Sigma-Aldrich， 71004-3）
3. 10 µM PCR1 条形码正向引物（Sigma-Aldrich，表 1、2）
4. 10 µM PCR1 反向引物（Sigma-Aldrich，表 1）
5. 10 µM PCR2 正向引物（Sigma-Aldrich，表 1）
6. 10 µM PCR2 索引反向引物（Sigma-Aldrich，表 1、2）
7. 琼脂糖（Meridian Biosciences，目录号：BIO-41025）
8. 溴化乙锭（EtBr）（Sigma-Aldrich，目录号：E1385）
9. NucleoSpin凝胶和 PCR 净化试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号：740609.250）
10. Qubit 高灵敏度试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32851）
11. Tris碱基（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
12. 乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
13. PhiX Control v3（Illumina，目录号：FC-110-3001）
14. TAE 缓冲液（见配方）
15. 琼脂糖凝胶（见食谱）

表 1. 引物 PCR1 和 PCR2
PCR1 正向和 PCR2 反向引物中的 NNNNNN 被表 2 中列出的所需条形码/索引替换。

表 2. PCR1 和 PCR2 引物的条形码/索引

设备

1. 12孔多通道移液器（Eppendorf Research，目录号：4926000069）
以给定速度释放流体的电子多通道可能会引起人们的兴趣，尤其是当大量 96 孔板用于屏幕时。我们使用了Picus 1200（Sartorius，目录号： 735491)
2. 分光光度计（ CLARIOstar Plus，BMG Labtech）
3. 荧光显微镜（Olympus Lifesciences）
4. FACSCanto II (BD 生物科学)
5. 37 °C，5% CO 2培养箱（细胞培养）
6. 电穿孔系统（Bio-Rad，Gene Pulser）
7. 37 °C 培养箱（细菌）
8. 100 毫升锥形
9. 微量离心机（海蒂诗，MIKRO 220R）
10. 离心机 (Hettich, ROTINA 420)
11. Vortex ( Heidolph , Reax Top)
12. 量子比特（ ThermoFisher ）
13. 热循环仪 ( Westburg , Biometra 高级）
14. 凝胶电泳系统（LKB 电源；CBS 科学）
15. 测序仪（Illumina，HiSeq2000）
16. -80 °C 冰箱
17. -20 °C 冰箱

软件

1. FlowJo （BD 生物科学； https: //www.flowjo.com/ ）
2. Perl ( https://www.perl.org/ ) 或 Python ( Anaconda) ( https://www.anaconda.com/ )
3. R ( https://www.r-project.org/ )
4. RStudio（ https://www.rstudio.com/products/rstudio/ ）
5. DESeq2 R-package ( http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/htmL/DESeq2.htmL ) ( Love et al., 2014 ) 和/或MAGeCK (仅在 Linux 中) ( https://sourceforge .net/p/mageck/wiki/Home/ ) (李等。 , 2014 )

程序

A. 设置粘附试验
注意：为了选择合适的细胞系和筛选的最佳条件，应进行几次小规模粘附试验以确定哪种细胞系显示出最佳的粘附能力（未刺激或刺激后，取决于筛选的目的），哪些粘附分子和相应的配体适合筛选分析，哪些刺激适合筛选，应该使用什么浓度和孵育时间等。
示例：BCR 控制的整合素介导的Namalwa细胞与纤连蛋白的粘附

1. 在 4°C 下用 100 μL 含有 2.5 μg/mL 纤连蛋白的 PBS 涂上 96 孔高结合板，或在 37°C 下涂上含有 1 mg/mL PLL 的 100 μL PBS 15 分钟。 PLL 应涂在单独的板上。有关粘附实验的布局示例，请参见图 2。
a. 为了优化涂层（粘附基材）和刺激物（如果适用）的浓度，对受刺激和未受刺激的细胞进行滴定实验。使用太高的浓度可能导致高基础/非刺激粘附（图 3A，U2932）和/或难以抑制的强烈刺激粘附（图 3C）；使用太低浓度的涂层或刺激物会导致粘附力太弱，从而降低检测的灵敏度。
b. 如果可用，请携带一种针对粘附的抑制剂作为阳性对照。在我们的案例中，采用依鲁替尼处理的细胞来确定纤连蛋白和 αIgM 的浓度，其中未刺激（无 αIgM）和未处理（无依鲁替尼）细胞几乎或未粘附，而刺激（使用 αIgM）和未处理（无依鲁替尼）细胞表现出强烈的粘附力，可被依鲁替尼有效抑制（图 3C）。对于Namalwa ，最佳浓度为 2.5 µg/mL 纤连蛋白和 100 ng/mL αIgM。
c. 除了纤连蛋白，其他细胞粘附分子及其配体也可用作涂层（例如， VCAM-1、ICAM-1、选择素、钙粘蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白）（图 3D）。我们使用纤连蛋白，因为我们与该分子具有很强的粘附性，并且它与几种不同的整合素结合，而例如 VCAM-1 主要与整合素 α4 β 1结合（Takada 等。 , 2007) 。
2. 用 100 μL 的 PBS 清洗水井两次。
3. 在 37°C 下，在无血清培养基中用 100 μL 的 4% BSA 阻塞水井至少 1 小时。
对于Namalwa细胞，我们使用 IMDM 作为培养基和进行粘附试验。
4. 在无血清培养基中将细胞在 1% BSA 中孵育 1 小时在 37 °C 下，细胞密度为 1.5 × 10 6 / mL。如果使用抑制剂，请将您感兴趣的抑制剂添加到该培养基中。根据需要调整与抑制剂预孵育的时间段。
5. 为您的细胞添加所需的刺激物，每孔板 100 µL 细胞（= 1.5 × 10 5 个细胞/孔）。在 37°C 下孵育 30 分钟（图 2）。根据需要调整刺激的潜伏期。
a. 对于Namalwa细胞，我们使用 100 ng/mL αIgM 或 50 ng/mL PMA 作为刺激物。与纤连蛋白一样，将这些浓度调低以防止粘附过强或过弱。
b. 如果可能，我们建议在感兴趣的路径中采取相对远端的刺激。由于生存能力/适合度细胞也会影响它们的粘附能力，敲除损害细胞适应性的基因也会降低细胞粘附，无论其在粘附调节中的作用如何。下游刺激起到控制细胞适应性（和粘附能力）的作用。在这里，我们使用 PMA 作为远端刺激，它是 PKC 和CalDAG -GEF 的激活剂（图 1）。
c. 每个刺激的孵育时间可能不同。例如，对于趋化因子诱导的粘附，最佳孵育时间为 2 或 5 分钟。
d. 一些刺激物，如趋化因子，在添加可溶性物质时不会最大程度地诱导粘附。这些分子需要在步骤 A1 中与粘附分子共涂。
6. 用 100 μL 的温暖 1% BSA 在无血清培养基中清洗纤连蛋白涂层板，方法是将液体从板中粉碎，在组织上擦干，然后轻轻添加新培养基以去除非粘附细胞。
7. 重复步骤 A6，直到 (1) 未包被的孔是空的，(2) 刺激的效果最大（即，最大数量的刺激细胞和最小数量的未刺激细胞保持贴壁），和 (3) 效果抑制剂最大。写下达到这一点所需的洗涤次数，因为这是筛选过程中洗涤次数的指示。
8. 在无血清培养基中去除 1% BSA，并通过在 PBS 中添加 100 μL 的 10% 戊二醛来固定细胞。对于 PLL 板，无需洗涤或去除细胞，在 PBS 中添加 67 μL 的 25% 戊二醛。在室温下孵育 10 分钟。
9. 用 PBS 洗涤两次。
10. 在 20% 乙醇中加入 100 μL 的 0.5% 结晶紫。在室温下孵育 45 分钟。
11. 用 H 2 O 彻底清洗板以去除过载结晶紫。
12. 加入 100 μL 乙醇以洗脱结晶紫。在室温下孵育 30 分钟。
13. 在分光光度计上测量 570 nm 处的吸光度。
14. 通过首先减去非特异性粘附引起的吸光度来确定粘附率，如在未涂覆的 4% BSA 封闭孔中确定的那样，然后将其除以在 PLL 涂层孔中确定的最大吸光度。

图 2. 板布局粘附试验。
评估抑制剂对粘附的影响的粘附试验设计示例（一式三份）。 PLL 涂层应该在单独的板上。

图 3. 滴定实验附着力。
Namalwa和 U2932 细胞粘附到涂层板上。用指定浓度的刺激物刺激细胞和/或用 100 nM依鲁替尼预处理。 (一) Namalwa和 U2932 细胞被允许粘附在涂有不同浓度 FN 的板上。尽管高浓度不影响Namalwa细胞的未刺激粘附，但 U2932 细胞显示未刺激粘附增加。因此，对于 U2932 细胞，FN 的最佳浓度为 0.25 µg/ mL。 (乙) 允许Namalwa细胞在不同的时间范围内粘附在涂有 2.5 µg/mL FN 的板上。对于 αIgM 和 PMA，30 分钟的粘附表现出最强的粘附。 ( C)依鲁替尼预处理可防止低浓度 αIgM 诱导的粘连和对低浓度 VCAM-1 的粘连，而当使用较高浓度的 αIgM 或 VCAM-1 时，这种作用基本消失。最佳浓度为 100 ng/mL 的 αIgM 和 600 ng/mL 的 VCAM-1，尽管较高的浓度会导致受刺激粘附相对于未受刺激粘附的倍数变化增加。 ( D)对于 CXCL12α 诱导的 VCAM-1 粘附，25 ng/mL CXCL12α 达到最佳粘附，反映了在较高趋化因子浓度下由于受体脱敏/下调而刺激趋化因子受体的典型钟形曲线。对于 αIgM，我们在增加浓度时没有观察到钟形曲线。 *P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001； ns：不显着；双向 ANOVA 与 Tukey 的未刺激与刺激条件的多重比较测试。

B. 选择感兴趣的细胞系
选择合适的细胞系，应考虑以下几个方面：
1. 细胞系应可与 sgRNA 库一起转导。
转导性较差的细胞系，我们建议使用双载体系统，在两个单独的构建体中包含 Cas9 和 sgRNA，而不是在同一构建体中包含 Cas9 和 sgRNA 的单载体系统。双载体 sgRNA 构建体的载体大小（约 10 kb）明显小于单载体 Cas9/gRNA 构建体（约 15 kb)，从而提高文库的转导效率。
2. 细胞应充分粘附（参见 A 部分）以达到一定的屏幕功率：
a. 如果目标是识别参与基础/非刺激粘附的基因，我们建议使用基础粘附尽可能高的细胞系，即使经过五次以上的洗涤步骤。
i. 使用粘附性差的细胞系的缺点是，为了保持 sgRNA 文库粘附后的复杂性，用于筛选的细胞数量和需要进行的粘附测定的数量要高得多。
ii. 使用在低数量后分离的细胞系的缺点（例如， 3) 洗涤步骤的主要特点是筛选的敏感性低：只识别全有或全无的基因，而不是中间粘附诱导剂。例如，如果某个基因的敲除会导致一个经过十次洗涤后正常分离的细胞系在八次洗涤后发生分离，则该基因将不会在另一个经过三次洗涤后分离的细胞系中被识别；该细胞系的检测灵敏度太低。由于大多数信号通路可能显示（部分）冗余，因此至少五个洗涤步骤将增加识别基因的机会。
b. 如果对受刺激的粘附感兴趣，我们建议使用显示最小基础粘附（接近于零）和刺激后粘附增加至少 2 倍的细胞系。在理想情况下，与识别参与基础粘附的基因一样，刺激后粘附的细胞比例尽可能高，即使经过五次以上的洗涤步骤。
我们通常观察到 sgRNA 的分布是平均值的 1.5 倍，因此如果基础粘附为 30%，而受刺激的粘附高 2 倍（60%），即使是完美的 dropout 也只能从云中略微下降在 MA 图中。由于完全退出的机会很小，大多数信号通路显示（部分）冗余，刺激后粘附至少增加 2 倍将增加通过筛选识别基因的机会。

C. 获取感兴趣的 sgRNA 文库的质粒库
注意：您可以自己设计（和构建）sgRNA 文库，也可以从分销商处获得（例如， Addgene ）。现在很多公司都提供定制设计的寡核苷酸库，你可以自己克隆成载体，或者完全克隆定制库。如果您自己设计文库，请包括针对必需和非必需/非表达基因的对照 sgRNA。此外，确保库中包含已知的粘附性正负调节剂。对于我们的 BCR 控制的粘附筛选，我们确保已建立的粘附调节剂 BTK、SYK 和 PI3K (PIK3R1)（图 1）存在于我们选择的文库 Brunello激酶组文库中。

D. 生成表达 Cas9 的细胞系
注意：如果使用单向量库或已经有稳定的 Cas9 表达细胞系，请直接进入 E 部分。
1. 获取您感兴趣的 Cas9 表达载体。我们使用lentiCas9-Blast，因为我们的sgRNA文库包含嘌呤霉素作为选择标记。这是优选的，因为它允许在有限的时间内（大约三天）选择转导的细胞。
2. 生产含有 Cas9 表达载体的慢病毒。
a. 板 1 × 10 6 HEK293T-17 细胞在 2 mL 中的 6 孔板中孵育 24 小时。 24 小时后，细胞应贴壁并达到 80% 融合。
使用 DMEM 作为 HEK293T-17 的培养基。
b. 将 2 µg LentiCas9-Blast、1 µg psPAX2、0.5 µg pMD2.G 和 0.1 µg pEGFP-N3 与 8 µg PEI 混合在 400 µL 无血清 DMEM 中。
注意： pEGFP-N3 的使用是可选的；我们只添加它来检查HEK细胞的转染效率。
c. 在室温下孵育 15 分钟。
d. 小心地将转染混合物添加到 HEK293T-17 细胞中，并在 37°C 下孵育 16 小时。
e. 使用荧光显微镜检查 HEK 细胞中的 GFP 表达。如果 > 50% 的 HEK 细胞为 GFP 阳性，则用新鲜培养基更换培养基，并在 37°C 下孵育 24 小时。
f. 从 HEK 细胞中取出病毒上清液，用 0.45 μm 过滤器过滤以去除细胞碎片。
g. 直接使用病毒（步骤 D3）或将等分试样储存在 -80 °C。
3. 通过将病毒添加到您的细胞中，转导带有 Cas9 表达载体的细胞系。
a. 确保您感兴趣的细胞的密度与其指数增长相适应。
b. 如果您的转导效率较低，您可以考虑在病毒转导过程中添加聚凝胺。但是，在我们的细胞中，聚凝胺具有轻微毒性，因此首先检查聚凝胺本身的作用并进行活力滴定实验。
c. 我们以 1:2 的稀释度添加我们的病毒，以获得尽可能高的感染复数 (MOI)。在此转导过程中发生的感染次数越多，Cas9 表达就越高，因此 Cas9 活性可能就越高，您的细胞系就越有效地产生您想要的敲除。如果使用的细胞系对如此高浓度的病毒是有毒的，或者如果您的病毒数量稀少，也可以使用较低的稀释度。
4. 杀稻瘟素存在下培养细胞7 天来选择转导细胞。使用未转导的细胞作为对照。
5. 使用 Cas9 报告器检查 Cas9 的功效。我们使用了 pKLV2-U6gRNA5( gGFP )-PGKBFP2AGFP-W 慢病毒构建体，它导致 BFP、GFP 和靶向 GFP 的 sgRNA 的表达。
a. 在步骤 D2 中产生 Cas9-reporter-lentivirus。
b. 如步骤 D3 所示，用病毒转导表达 Cas9 的细胞和作为对照的亲代细胞。
与步骤 D3c 一样，我们以 1:2 的比例添加病毒，以获得尽可能高的 MOI，从而获得最强的报告基因效果。当您的细胞具有高转导效率、病毒数量有限或高浓度病毒对您的细胞有毒时，可以使用较低的稀释度。
c. 六天后，通过流式细胞仪检查 GFP 和 BFP 表达来验证 Cas9 的功效。这六天是让细胞诱导 GFP 敲除所必需的。如果与记者的转导成功，则亲代细胞为 GFP 和 BFP 阳性（图 4；绿色）。如果所有表达 Cas9 的细胞都具有活性 Cas9，则这些细胞将仅是 BFP 阳性，因为报告结构中的 sgRNA 会导致 GFP 缺陷（图 4；蓝色）。如果少于 90% 的 Cas9 表达细胞显示出活性 Cas9（例如，图 4 中的 Granta-519），您可以考虑增加杀稻瘟素浓度以提高选择压力或再次使用 Cas9 慢病毒转导细胞。

图 4。 Cas9 报告基因检测。
Cas9 报告基因检测的一个例子，其中亲本和表达 Cas9 的细胞没有红色和黄色的 Cas9 报告基因，同时是 GFP 和 BFP 阴性。在绿色中，描绘了用 Cas9 报告基因转导的亲代细胞，它们都是 GFP 和 BFP 阳性的。蓝色部分描绘了用 Cas9 报告基因转导的 Cas9 表达细胞，主要是 BFP 阳性，表明有效的 Cas9/gRNA 介导的 GFP 敲除。象限中描绘的百分比描述了每个象限中带有 Cas9 报告基因（蓝色）的 Cas9 细胞系的百分比。在Namalwa中，Cas9 在 62/(62+1) = 98% 的细胞中具有活性，而在 Granta-519 中只有 48/(48+20) = 70% 的细胞含有活性 Cas9。

E. 慢病毒 sgRNA 文库生产
注意：成功筛选的一个主要决定因素是在整个筛选过程中保持文库的复杂性。对于 dropout 筛选，这意味着在筛选的每个步骤中（例如，在扩增文库后、嘌呤霉素选择后、粘附后、DNA 分离后等），所有 sgRNA 在您的样本中平均应代表 > 1,000 倍，以保证屏幕有足够的（统计）能力。对于包含 6,204 个独特sgRNA的 Brunello激酶组库，这意味着在筛选的每一步中，至少应存在6.2 × 10 6 个菌落/细胞。
1. 放大 sgRNA 库。
a. Endura TM电感受态细胞中以 1.8 kV电穿孔 0.1 – 1 µg 质粒库。
b. 使Endura TM细胞在 37°C 下在 1 mL SOC 介质中恢复 1 小时。
c. Endura TM细胞中取出 1 μL，并在 100 μL LB 中连续进行 4 次 10倍稀释（1:10 3 、1:10 4 、1:10 5和 1:10 6 ）。用 50 μg/mL 的氨苄青霉素将这四种稀释液放在琼脂板上，并在 37°C 下将板倒置过夜。
注意：琼脂板倒置孵育，以减少过夜孵育期间琼脂中水分的蒸发。
d. 稀释剩余的 999 μL Endura TM细胞，并在 37°C 下孵育过夜。
e. 计算琼脂板上的菌落数。
f. 如果琼脂板上存在足够的菌落（至少 100 个，但最好是库中存在的唯一 sgRNA 数量的 1000 倍），请根据制造商的协议对 400 mL 的 LB 进行质粒 DNA 分离。根据细菌培养物的光密度使用多个列。在我们的例子中，我们通常使用四列NucleoBond Xtra midi 准备套件。
我们建议在 -80 °C 下储存您图书馆的主库存，以供将来图书馆扩增，而不是放大连续生产的库存。这可以防止通过扩增错误累积 sgRNA 组成的随机变化。
2. 产生包含在步骤 D2 中的库的慢病毒，但 HEK293T-17 细胞在五个 T175 培养瓶中而不是 6 孔板中生长。包装混合物应相对于培养瓶的表面积（6 孔板 = 9.6 cm 2 ）按比例放大。收获病毒上清液后，将病毒分装在冷冻管（用于滴定）和 15 mL 管（筛选分装）中，并储存在 -80°C。
由于您的病毒质量会随着每个冻融循环而降低，因此不要立即开始病毒滴定（F 部分），而应先冷冻病毒。这样，用于筛选的病毒将具有相同数量的冻融循环，因此可能与用于滴定的病毒具有相同的质量。

F. 慢病毒 sgRNA 文库滴定
注意：为了最大限度地增加单次整合的细胞数量并限制病毒转导所需的细胞数量，细胞应以 0.3 的 MOI 进行转导。要确定您的病毒批次的功效和要添加到细胞中的病毒数量，请先进行滴定测定。
1. 将 1 mL 的 Cas9 表达细胞系置于 6 孔板中，密度是在没有（嘌呤霉素）选择的情况下，细胞在测定结束时不会过度生长的密度的 2 倍。板足够的孔，以允许测试所有所需的条件（图 5）。
2. 解冻病毒的等分试样并制备所需的病毒预稀释液。在我们的案例中，我们对病毒进行了 1:32、1:16、1:8、1:4 和 1:2 的预稀释，并在每孔中向细胞中添加 1 mL，测试最终浓度为 1:64，直到1:4。如果您的细胞系具有更高的转导效率，您可以考虑测试例如 1:200 到 1:12.5 的病毒稀释度。孵育 24 小时。
注意：通常，24 小时足以让细胞对嘌呤霉素产生抗药性。然而，在某些情况下，细胞可能需要长达 48 小时才能产生抗药性。
3. 在板的后半部分添加适当浓度的嘌呤霉素，以选择转导细胞。孵育 48 小时。
如果合适的嘌呤霉素浓度未知，需要提前进行嘌呤霉素滴定实验。
4. 通过流式细胞仪测量细胞密度和活力，并计算在嘌呤霉素条件与非嘌呤霉素条件下，30% 的细胞在何种病毒浓度下仍然存活。这将是筛选期间使用的所需病毒浓度（即， MOI 为 0.3）。

图 5. 板布局病毒滴定。
在 6 孔板中设计病毒滴定测定的示例。所描绘的布局重复执行。

G. 用于筛选的文库的病毒转导
1. 扩展您的细胞，以保证以大约 0.3 的 MOI 获得足够数量的感染细胞，以保持文库的复杂性。我们建议进行三个独立的转导，在整个筛选过程中将它们作为单独的重复样本保存，以提高筛选的统计能力，从而提高识别相关蛋白质的机会。
a. 与执行病毒滴定的 6 孔板相比，我们经常观察到 T175 的转导效率较低。为了保证维持所需的库复杂性（1,000 ×覆盖率），我们建议转导比计算更多的细胞，如果可能的话，以补偿预期降低的转导效率。
b. 由于在 MOI 为 0.3 下转导后我们需要至少 6.2 × 10 6 个转导细胞，因此我们转导了 6.2 × 10 6 /0.3 + 一点额外 = 24 × 10 6 细胞。
一点额外的大小取决于您的转导效率的标准偏差。为了确保保持库的复杂性，根据 MOI 计算，我们转导的细胞比所需的至少多 10%。
2. 将您的细胞分装在 T175 培养瓶中，使您的细胞的密度与其指数增长相适应。为未转导的嘌呤霉素选择控制准备一个额外的烧瓶。
3. 解冻并汇集足够的病毒等分试样以转导所有烧瓶。
4. 除嘌呤霉素选择控制外，将病毒添加到每个烧瓶中，并孵育 24 小时。
5. 添加适当浓度的嘌呤霉素以实现未转导细胞的完全细胞死亡并孵育 48 小时。
6. 让细胞从嘌呤霉素选择中恢复，直到细胞以可接受的存活率（低于标准培养存活率的 10%）和增殖率（均接近亲代细胞）生长，直到存活细胞的数量足以建立所有条件。
允许恢复至少六天，以允许有效的基因敲除。

H. 附着力筛
1. 汇集每个复制的所有转导细胞。
2. 对于每个重复，为预粘附参考样品取一个细胞等分试样。
该等分试样应包含至少 1,000 倍的库中独特 sgRNA 的表示。如果可能，我们建议即使在提取基因组 DNA (gDNA) 后也增加此细胞数量以保持文库的复杂性，因为 gDNA 提取的效率通常为 50 % – 70%。
3. 例如， 600 × g 3 分钟）将参考样品的等分试样沉淀，吸出上清液，并在每个样品的 200 μL PBS 中重新悬浮。将这些样品储存在 -20°C，直到收集到所有选定的样品。
4. 使用剩余的细胞进行粘附测定，如步骤 A1 – A6。
a. 用纤连蛋白涂上适当数量的 96 孔板的所有孔（图 6），但在角孔中添加未刺激的细胞或用抑制剂预处理的细胞，作为洗涤次数的对照。尽管使用了大量的板和时间效率低的工作量，但我们没有将粘附测定扩大到例如 6 孔板（或培养皿），因为高结合 6 孔板不可用，并且因为用 96 孔板在整个表面上以相等的力（严格度）洗涤是可行的，但不能用 6 孔板。
b. 对不同的刺激使用单独的板，以便能够分别收集细胞。
5. 大量洗涤后（步骤 A6），加入 100 μL 的 5 mM EDTA/PBS 以分离所有贴壁细胞并孵育 10 分钟。对于某些细胞类型，胰蛋白酶可能比 EDTA 更有益。
6. 收集贴壁细胞。
7. 用 100 μL 的 PBS 清洗一次盘子，并将其添加到 5 mM EDTA/PBS 悬浮液中，并带有贴壁细胞。
8. 如步骤 H3 中的颗粒状样品。

图 6. 板布局粘附测定屏幕。
使用角落中的水井作为控制井来确定粘附测定期间所需的洗涤次数。这些对照孔要么包含未刺激的细胞，要么包含与抑制剂预孵育的细胞，所述抑制剂对粘附具有确定的影响。

I. 基因组 DNA 分离
1. 例如，根据制造商的协议，使用 Quick DNA mini prep kit 从细胞颗粒中提取基因组 DNA。
2. 测量每个样本的 DNA 浓度，例如根据制造商的协议使用 Qubit 宽范围试剂盒和 Qubit 荧光计。

J. sgRNA 插入片段的 PCR 和新一代测序
1. 对于每个样品和水对照（无 DNA）的第一轮 PCR 扩增反应（图 7），准备以下：1 µg gDNA、10 µL 5 × HF 缓冲液、1 µL 10 mM dNTP、1 µL 10 µM PCR1 条形码正向引物、1 µL 10 µM PCR1 反向引物、0.5 µL Phusion 聚合酶和 H 2 O 至 50 µL。为每个样品使用不同的条形码正向引物。
a. 这可以针对使用的任何筛选库大小进行放大。一个典型的人类二倍体细胞含有 6 pg DNA，因此，我们每个样品使用 40 个反应/40 µg DNA，这代表 6.7 × 10 6 个细胞，保持 sgRNA 文库的覆盖率 (>6.2 × 10 6 )。
b. 如果处理的样本超过 12 个，也可以在第二轮 PCR 中应用条形码。
c. 我们建议也对 sgRNA 文库进行测序，以评估文库的初始分布。为此，请在一个 PCR 反应 (50 µL) 中使用 1 ng 库质粒。
d. 适用于lentiGuide -Puro 和lenti-CRISPRv2 主链的引物列于表1 和表2 （Evers 等。 , 2016) 。
2. 运行以下协议：（1） 98 °C 30 秒； (2) 98℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 21个循环； (3) 72℃ 5分钟； (4) 保持在 4°C。
3. 汇集 PCR 反应。
4. 如果处理超过 12 个样本，则使用 PCR1 的产品设置第二轮 PCR 反应（图 7），使用不同的索引反向引物：2 μL 的汇集 PCR1 产品，10 μL 的 5 × HF 缓冲液，1 μL 的 10 mM dNTPs、1 µL 10 µM PCR2 正向引物、1 µL 10 µM PCR2 索引反向引物、0.5 µL Phusion 聚合酶和 34.5 µL H 2 O（最终体积为 50 µL）。
5. 运行以下协议：（1） 98 °C 30 秒； (2) 98°C 30 s、60°C 30 s、72°C 1 min 15个循环； (3) 72℃ 5分钟； (4) 保持在 4°C。
6. 将 4 µL 的每个 PCR2 产物（包括 H 2 O 对照）涂在 2% 琼脂糖凝胶上，以检查样品中是否存在适当大小的产物 (589 bp) 以及 H 2 O 中是否不存在任何产物（无DNA）对照（参见图 8 示例）。
7. 根据制造商的协议，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。如果引物二聚体带突出，首先将完整的 PCR 产物应用到 2% 琼脂糖凝胶上，并从凝胶中分离出适当的带。
8. 根据制造商的协议，使用 Qubit 高灵敏度试剂盒和 Qubit 荧光计测量每个样本的 DNA 浓度。
9. 汇集所有样品的等摩尔量。
10. 根据制造商的协议，在 Illumina 下一代测序仪上运行样本。
a. 对于使用包含 6,000 个 sgRNA 构建体的库生成的具有 9 个条件的屏幕（粘附前样品和粘附后两个刺激样品，均一式三份），我们需要 5.4 × 10 7 个读数。这可以在单个HiSeq X 泳道上轻松实现（预期读取数约为 3 × 10 9 ）。建议添加 30% PhiX ，因为初始核苷酸的变化有限。
b. 条形码/索引引物可以根据您喜欢的序列设备设计进行调整，例如TruSeq设计，并且可以与RNAseq样品一起运行。

图 7。用于测序文库制备的 PCR 反应示意图。
(A)第一轮扩增是使用 sgRNA 序列两侧的引物进行的。 PCR1 正向引物添加条形码和 Illumina 测序引物 1，而反向引物添加 Illumina 索引读取引物序列。 ( B)第二轮 PCR 以 PCR1 的产物为模板，在反向引物中添加 P5 和 P7 接头，以及进一步的可选索引。 ( C)最终产物是一个 589 bp 的片段，其中包含在 Illumina 高通量测序仪上进行退火和测序所需的所有元素。改编自Jastrzebski 等。（2016 年）。

图 8。带有 PCR2 产物的琼脂糖凝胶。
589 bp 的 PCR2 产物存在于大多数样品中，而不存在于 PCR1 和 PCR2 的 H 2 O 对照中。第三和第九个样品不合格并重复。

数据分析

注意：所有用于 R、Perl 和 Python 的脚本都可以在公共 GitHub 存储库https://github.com/MFMdeRooij/CRISPRscreen / https://doi.org/10.5281/zenodo.6342853上找到。在这些脚本中，对分析进行了更广泛的解释，而在这里我们只提供简要说明。 Namalwa粘附屏幕的原始数据是可在 NCBI SRA 数据库中以登录号 SRR16971271 获得。
1. 如 GitHub 存储库 (/ CRISPRScreenAnalysis /FastqToCountTable.pl )中所述，从fastq文件生成计数表。简而言之，这个脚本：
a. 对条形码上的读数进行排序（即，每个样本）。
b. 确定指南序列并计算唯一指南。
c. 将计数表与库的引用表对齐。
对于条形码确定，允许存在一个错配；对于指导序列确定，不允许出现错配，但允许最多移动三个核苷酸。这些变化是由合成 PCR 寡核苷酸中的插入缺失引起的。或者，您可以订购突变较少的 HPLC 纯化的 PCR 引物。
2. 执行 DESeq2 分析（爱等。 , 2014)和来自MAGeCK管道(Li et al. , 2014)的 αRRA，如 GitHub 存储库 (/ CRISPRScreenAnalysis / CRISPRScreen ) 中所述 Analysis.R ) 以获得指导和基因水平的统计数据。这种分析可以包括非信息性折叠变化的收缩，这使得它不同于标准的 MAGeCK分析。该脚本生成指南和基因输出表，例如复制、分散和 MA 图（参见图 9 中的示例）。
a. （合成）致死性筛选中命中的中值倍数变化通常高于粘附性筛选中的中值变化，因为在致死性筛选中，样本通常在 10 次细胞分裂后进行比较。如果事件（细胞凋亡/细胞周期停滞）发生在两次细胞分裂之后，这种效应会被放大 8 次以上的细胞分裂（因此 2 8 = 256 倍耗尽）。在失去粘附筛选中，细胞分裂不会放大事件。尽管如此，粘附丧失筛选提供了足够的能力来识别参与粘附的蛋白质（de Rooij 等。 , 2022) 。
b. 要确定细胞活力是否影响您的测定，请并行执行杀伤力筛选或通过将预粘附样本的读取计数与文库分布进行比较来定义（强）活力基因（显着：FDR < 0.1 DESeq2，然后是 αRRA） .如果存在于您的库中， Hart的基本基因等。（2014）也可以使用。
3. (/ CRISPRScreenPlots /VolcanoSplit_GenesOfInterest.py ) 或倍数变化图(/ CRISPRScreenPlot s / GuideFCPlot.py )中所述，通过绘制每个基因的向导的中值倍数变化与 αRRA 消耗和富集分数生成火山图，它绘制了所有指南对感兴趣基因的倍数变化。
4. /CRISPRScreenAnalysis/Quality.pl后跟/CRISPRScreenAnalysis/Quality.R ）检查GitHub 存储库中描述的序列质量或使用 Python (/ CRISPRScreenAnalysis /FastqToCountTable.py )。使用这些脚本，您可以确定每个条形码的 CRISPR 读取数、完美映射到库的读取数、引物二聚体读取数和最丰富的读取数。如果您的文库中不存在这种最丰富的读数，则表明存在 PCR 污染。

图 9。 Namalwa粘附性丧失筛选的 DESeq2 分析示例。
(A) Namalwa屏幕的三个不同复制中的引导分布复制图。 nrc ：标准化读取计数；黑线 y=x;紫线：线性拟合。 ( B)将分散度与每个指南的归一化计数的平均值作图。 ( C) αIgM 刺激的粘附后样本中导向器的 log10 计数相对于 αIgM 刺激的粘附后样本中导向器的 log2 倍变化与 PMA 刺激的粘附后样本的 log2 倍变化作图（水平）样本（垂直）。用黑色描绘了针对 BTK 的指南。

食谱

1. 补充培养基
试剂最终浓度数量
DMEM/IMDM 不适用 500 毫升
FCS 10% 50 毫升
L-谷氨酰胺 (200 毫米) 2毫米 5 毫升
青霉素-链霉素 1% 5 毫升
全部的不适用 560 毫升

2. 0.5% 结晶紫的 20% 乙醇溶液
试剂最终浓度数量
结晶紫 5% 25 克
乙醇（绝对） 20% 100 毫升
H 2 O 不适用 400 毫升
全部的不适用 500 毫升

3. 含有抗生素的琼脂板
试剂最终浓度数量
磅 20克/升 15 克
琼脂 15克/升 11.25 克
H 2 O 不适用 750 毫升
全部的不适用 750 毫升
a. 在 1 L 瓶中对该溶液进行高压灭菌。
b. 冷却至大约 55 °C 。
c. 根据质粒携带的抗生素抗性基因，将适当的抗生素添加到板中。我们使用了 750 µL 的 50 mg/mL 氨苄青霉素（最终浓度为 100 µg/mL）。
d. 每盘倒入约 10 mL。
e. 把你的盘子放在长凳上凝固。

4. 含有抗生素的 LB 培养基
试剂最终浓度数量
磅 20克/升 15 克
H 2 O 不适用 750 毫升
全部的不适用 750 毫升
a. 在 1 L 瓶中对该溶液进行高压灭菌。
b. 冷却至大约 55 °C 。
c. 根据质粒携带的抗生素抗性基因添加适当的抗生素。我们使用了 750 µL 50 mg/mL 氨苄青霉素（最终浓度为 100 µg/mL）。

5. SOC培养基
试剂最终浓度数量
磅 20克/升 5克
D-葡萄糖 20毫米 900.8 毫克
H 2 O 不适用 250 毫升
全部的不适用 250 毫升
生产为 LB，但添加了 D-葡萄糖。

6. 0.5 M EDTA，pH 8.0
试剂最终浓度数量
乙二胺四乙酸 0.5M 186.1 克
H 2 O 不适用 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升
a. 将 186.1 克 EDTA 搅拌到 800 毫升蒸馏水中。
b. 加入 NaOH 溶液将 pH 值调节至 8.0。
c. 用蒸馏水将溶液稀释至 1 L。

7. TAE 缓冲液 (10 × )
试剂最终浓度数量
三碱基 400 毫米 48.4 克
乙酸 (100%) 200 毫米 11.4 毫升
EDTA（0.5 M，pH 8.0） 10毫米 20 毫升
H 2 O 不适用 970 毫升
全部的不适用 1,000 毫升
a. 2 O中溶解 48.4 g Tris-base 。
b. 小心加入 11.4 mL 的 100% 乙酸和 20 mL 的 0.5 M EDTA。
c. 将溶液调整到 1 L 的最终体积。
为了制备 1 × TAE 工作溶液，在 900 mL H 2 O中稀释 100 ml 10 × TAE 缓冲液。

8. 琼脂糖凝胶
试剂最终浓度数量
琼脂糖 2% 3克
TAE 缓冲液不适用 150 毫升
全部的不适用 150 毫升
a. 在微波炉中加热琼脂糖/TAE 缓冲液混合物。每隔 30 秒，取出烧瓶并旋转内容物以充分混合。重复直到琼脂糖完全溶解。
b. 添加 0.5 μg /mL 溴化乙锭。
c. 将凝胶倒入铸造装置中。
d. 让琼脂糖在室温下凝固。

致谢

这项研究得到了荷兰癌症协会 (KWF) 对 MS（目录号：7873，目录号：102750）和 RLB（目录号：12539）的资助，以及来自Lymph&Co和国际华氏巨球蛋白血症基金会 (IWMF ) 的资助)/白血病和淋巴瘤协会 (LLS) 到 MS。该协议改编自de Rooij 等。（2022 年）。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

伦理

该研究不涉及人类受试者或动物工作。

参考

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