材料和试剂

表达菌株选项
1. B95(DE3) Δ A Δ fabR ΔserB _ （朱等，2019）。可应要求提供。
2. BL21(DE3) Δ serB (添加基因# 34929) （Park 等人，2011；Rogerson 等人，2015）
a. 两种菌株都没有任何质粒，它们对所有抗生素都敏感。
b. B95 ∆ A ∆ fabR ΔserB _ 菌株缺乏RF1，因此产生的截短蛋白质很少或不产生。因此，可以使用 N 端纯化标签，而无需担心共纯化截短的蛋白质。当 ( i ) 表达同源多聚体蛋白，(ii) C 端亲和标签阻碍蛋白质功能，(iii) 需要 N 端溶解度增强结构域（例如，SUMO、GST、MBP 等）或(iv) 寻求提高多位点 pSer 掺入的产量。这些细胞生长适中，比 BL21 菌株慢（如下所述），但该菌株的产量至少与 BL21 菌株相当，并且在许多情况下高于 BL21 菌株（Zhu 等。 , 2019) 。
c. BL21 (DE3) ∆ serB 菌株含有释放因子 1 (RF1)，因此会产生截短的蛋白质以及全长磷酸化蛋白质。为避免截短蛋白的共纯化，强烈推荐使用 C 端而非 N 端纯化标签（Rogerson 等。 , 2015) 。此外，对于自组装成同型多聚体（二聚体、三聚体等）的蛋白质，纯化可能会出现问题，因为可能会同时纯化作为组装中亚基的截短形式。当 TAG 密码子靠近 C 端时，这尤其令人担忧。
d. 可以使用 Inoue 方法(Green and Sambrook, 2020)使这些菌株具有化学活性。化学感受态细胞的等分试样可在 -80 °C下储存至少 3 年。不要重新冷冻等分试样。
e. C321 ΔA 菌株是一种不同的 RF1 缺陷型大肠杆菌，已用于重组 pSer 蛋白表达（ Pirman等人，2015 年），生长更慢，与基于 T7 的蛋白表达系统或自动-感应媒体，因此不应与此协议一起使用。

质粒
1. pKW2-EFSep ( Addgene #173897)
用于 pSer 掺入、氯霉素抗性/pBR322 复制起点的机械质粒（Rogerson等人，2015）。 pKW2-EFSep 机械质粒与标准pET / pBad / pGEX载体具有相同的复制起点。因此，由于与 pKW2-EFSep 的起源不相容，这些载体不能用于表达具有 pSer 的靶蛋白。目标蛋白必须从具有不同复制起点的载体（例如 p15a、 CloDF或 RSF）中表达。下面描述的pRBC质粒推荐用于靶蛋白表达。
2. pRBC-sfGFP ( Addgene #174075)
表达带有 C 末端 His6 标签的sfGFP野生型 ( wt ) 对照蛋白(Zhu 等。 , 2019) 。
3. pRBC-sfGFP 150TAG ( Addgene #174076)
与上述相同（包括 C 端 6x-His 标签），除了在 N150 位点包含 TAG 琥珀终止密码子的sfGFP基因。
4. pRBC -[x] 野生型（必须创建）
表达您感兴趣的蛋白质 [x] 或野生型。至少对于初始测试而言，将您的野生型蛋白质克隆到pRBC质粒中是很重要的，以确保它能够按预期表达。
5. pRBC -[x] TAG（必须创建）
您感兴趣的蛋白质 [x] 在 pSer 掺入的预期位点（或多个位点）带有 TAG 密码子。

培养基试剂和材料
1. LB/琼脂培养基（见配方）
2. ZY 媒体（见食谱）
3. 非诱导 ZY 培养基（见食谱）
4. 自动诱导 ZY 媒体（见食谱）
5. SOC 媒体（见食谱）
6. 25 × M-盐（见食谱）
7. 1 M MgSO 4 (见配方)
8. 40% (w/v) 葡萄糖（见配方）
9. 50 × 5052 解决方案（见食谱）
10. 5,000 ×微量金属溶液（可选，参见配方）
11. 胰蛋白胨（例如，VWR，目录号：97063-386）
12. 酵母提取物（例如，VWR，目录号： 97064-368)
13. NaCl（例如，VWR，目录号： 97061-274)
14. 琼脂（例如，VWR，目录号： 97064-336)
15. MgSO 4 · 7H 2 O（例如，VWR，目录号： 97062-134)
16. Na 2 HPO 4 （二碱式钠）（例如，VWR ，目录号： AA13437-30)
17. KH 2 HPO 4 （一元钾）（例如，VWR ，目录号： BDH9268）
18. NH 4 Cl（例如，VWR ，目录号： 97062-050)
19. 钠2 SO 4 或 (NH 4 ) 2 SO 4 （例如，VWR ，目录号： BDH9302 或 BDH9216)
20. α -D-葡萄糖（例如，VWR ，目录号： 97061-168）
21. α -D-乳糖（例如，VWR ，目录号： 36218.A3）
22. 甘油（例如，VWR ，目录号： BDH24388.320）
23. 氨苄青霉素（例如，VWR ，目录号： 97061-442）
24. 氯霉素（例如，VWR ，目录号： 97061-244）
25. 乙醇（例如，VWR ，目录号： 89125-188）
26. 消泡剂B（例如，JT Baker ，目录号： B531-05）
27. 氟化钠（例如，VWR ，目录号： 470302-540）
28. 焦磷酸钠（例如，VWR ，目录号： JT3850-1）
29. 原钒酸钠（例如，VWR ，目录号： BT219470-25G）
30. 标签丙烯酰胺（例如，VWR ，目录号： 101974-086 ）
31. 磷酸酶抑制剂混合物混合物（例如，Sigma，目录号：P2850）
32. Phos -tag琼脂糖树脂（例如，Wako Chemicals，目录号：AG-501）
33. 1.7 mL Eppendorf 管（例如，VWR ，目录号： 87003-294）
34. 100 mm 板（例如，VWR ，目录号： 470210-568）
35. 50 mL锥形管（例如，VWR ，目录号： 89039-656）
36. 250 mL 带挡板的烧瓶（例如，VWR ，目录号： 89095-266）
37. 2.8 L 带挡板的 Fernbach烧瓶（例如 Sigma ，目录号： CLS44232XL)

设备

1. 高压灭菌器能够在 121 °C和 15 PSI 的饱和蒸汽压力下对液体培养基和培养材料进行灭菌。
2. 表达
a. 用于生长 LB/琼脂板的静态培养箱（设置为 37 °C ）（例如，VWR，目录号： 97025-630)
b. 用于培养液体培养物的摇床培养箱（例如，New Brunswick I26R，Eppendorf，目录号： M1324-0004)
i. 摇床应该能够以 200 – 250 rpm的速度旋转
ii. 低于室温 (< 25 °C )的表达式需要冷藏
iii. 摇床板应有夹子以固定 250 mL 和 2.8 L Fernbach烧瓶
c. 光密度 600 nm 分光光度计（例如， Ultrospec 10，Biochrome，目录号： 80-2116-30)
3. 细胞收获
a. 离心机的速度至少为5,000 rcf ，并且能够容纳与培养物大小相称的体积（例如，Beckman Coulter，型号：Allegra 25R）
b. 离心瓶可以承受离心力并容纳为收获细胞而培养的培养物体积。瓶子的类型取决于所使用的离心机和转子。
c. 冷冻机（-80 °C ），如果细胞在蛋白质纯化之前储存（例如，VIP ECO ULT 冷冻机，VWR，目录号： 76305-596）。
4. 42 °C水浴（例如，VWR，目录号： 76308-830)
5. 能够读取 sfGFP 荧光（激发 488 nm/发射 512 nm）的荧光计。手持式荧光计适用于常规荧光读数（例如，来自 Turner Biosystems的PicoFluor ）。

程序

4天表达过程

第 1 天：转型
注意： _
• 每次表达都必须进行新鲜的双质粒转化。切勿冷冻含有质粒的表达细胞；冷冻保存后，细胞会与抗生素一起生长，但不会表达蛋白质。不要顺序转化质粒。
• 要在您的实验室中标准化此协议，请使用sfGFP运行控制表达式首先是wt和 sfGFP-150TAG，以验证您是否可以达到参考表达基准，并确保 TAG 位点的 pSer 抑制功能与模型蛋白的预期相同。下面的协议包含标准 50-mL 测试表达以及 1-L 表达的信息，一旦已知系统正常工作，通常用于目标蛋白。表达量可以根据需要进行缩放。

1. °C的水浴可用。水浴对于确保热激步骤的快速传热很重要。
2. 对于每个表达式，将pKW2 -EFSep 和所需的pRBC质粒各 2 μL添加到 1.7-mL Eppendorf 管中。
a. 这应该是每个质粒约 50–200 ng。
b. 将试管置于冰上 5 分钟以预冷。
3. 解冻 B95(DE3) Δ A Δ fabR的等分试样 Δ serB或 BL21(DE3) Δ serB感受态细胞。
4. 将 50 μL感受态细胞加入到每个装有质粒的试管中，将细胞与质粒轻轻混合，然后放回冰上 30 分钟。
5. °C的水浴中45 秒，对细胞进行热休克。
6. 立即将试管放回冰上，孵育 2 分钟。
7. 添加 1 mL的 SOC 介质。
注意：确保 SOC 未因之前的使用而受到污染。
8. °C下以 >200 rpm 的速度摇动恢复。只需将 Eppendorf 管水平粘贴到振动台上即可很方便。
a. 对于 B95(DE3) Δ A Δ fabR ΔserB ，恢复 120 分钟。
b. 对于 BL21(DE3) Δ serB 细胞，恢复 90 分钟。
注意： B95(DE3) 的恢复时间更长Δ A Δ fabR 由于该菌株的生长速度和新陈代谢稍慢，因此建议使用∆ serB 。
9. 将回收的培养物铺板到适合所选表达菌株的 LB/琼脂/氨苄青霉素/氯霉素板上：25 μ g /mL 氨苄青霉素 + 7 μ g /mL 氯霉素，用于 B95(DE3) Δ A Δ fabR Δ serB和 100 μ g /mL 氨苄青霉素 + 25 μ g /mL 氯霉素用于 BL21(DE3) Δ serB 细胞。
为确保有足够数量的菌落，请铺板所有细胞。为此，以 3000 rcf离心细胞3 分钟，去除顶部 900 μL的上清液，通过轻轻移液器将细胞沉淀重悬于剩余的 100 μL上清液中，然后铺板并铺展完全重悬的细胞。
10. 让板在火焰附近部分打开盖子干燥约 20 分钟（保持无菌），然后在 37 °C下将板倒置孵育过夜。

第 2 天：入门文化
笔记：
• 媒体的体积可以根据所需的表达规模而改变。下面描述的是 50-mL sfGFP测试表达和 1-L 目标蛋白表达的体积。
• 该协议需要隔夜非诱导起始培养物才能达到稳定期。未达到稳定期的起始培养物可能无法在自诱导培养基中适当表达目标蛋白。

1. 在 37 ° C 下从培养箱中取出 LB/琼脂板，并将它们置于室温或 4 °C下一天。
a. ∆ A ∆ fabR应生长约 20–100 个菌落 ΔserB _ 细胞（图 1）。如果没有菌落生长，请检查是否使用了正确的抗生素浓度（25 μg /mL 氨苄青霉素、7 μg / mL氯霉素）。如果使用了正确的浓度，则细胞可能没有足够的能力。
注意：调整该菌株的抗生素浓度以促进在 LB/琼脂平板上的更快生长。这些浓度被选择为与标准菌株一起使用的大约四分之一 (25%)。
b. Δ serB应生长约 100–500 个菌落细胞（图 1）。

pRBC-sfGFP和 pKW2-EFSep 共转化为 B95 Δ A后的代表性 LB/琼脂板 ΔfabR _ Δ serB （左）和 BL21（DE3） Δ serB菌株和在 37 °C 下过夜（约 18 小时）的生长。
请注意，B95 Δ A ΔfabR _ 由于与 BL21(DE3) Δ serB相比，该菌株的转化效率较低， Δ serB菌株含有约 10 倍的菌落。

2. 在一天结束时（〜下午 3-5 点），准备 ZY-NIM 起始培养物：
a. 用适当的抗生素制备 50 mL 的 ZY-NIM。
i. 对于 B95(DE3) Δ A Δ fabR Δ塞尔维亚, 使用50μg /mL氨苄青霉素和13μg / mL氯霉素。
注意：液体培养基中该菌株的抗生素浓度调整为标准菌株使用浓度的大约一半 (50%)。
ii. 对于 BL21(DE3) Δ serB ，使用 100 μg /mL 氨苄青霉素和 25 μg / mL氯霉素。
b. 从过夜的 LB/琼脂平板上刮下几十个菌落，并用它们接种：
i. 对于 ≥ 1 L 的表达：在 250-mL 带挡板的烧瓶中加入 50 mL ZY-NIM 发酵剂。添加 1-2 滴消泡剂 B。
ii. 对于 50 mL 表达：在 15 mL 无菌培养管中加入 5 mL ZY-NIM。
c. °C下以 ~250 rpm 的速度摇动培养起始培养物。

第 3 天：表达
1. 准备表达文化：
注意：强烈建议使用带挡板的烧瓶，以确保为自动诱导培养提供足够的通气。
a. 隔夜 ZY-NIM 应该在一夜之间达到饱和 (OD 600 ~3–8)。如果它没有达到 OD > 3，要么培养物没有生长足够长的时间，要么培养基/抗生素浓度可能不正确。
b. 根据以下配方准备 ZY-AIM。
注意：建议您将所需的所有培养基一次性制作好，然后分装到合适的培养瓶中，以确保所有表达都包含相同的培养基。
i. 对于 1-L 表达：在带挡板的 2.8-L Fernbach烧瓶中制备 ZY-AIM 。
ii. 对于 50-mL 的测试表达：在 250-mL 带挡板的烧瓶中制备 ZY-AIM。
c. 添加抗生素
i. 对于 B95(DE3) Δ A Δ fabR ∆ serB ，使用 50 μ g /mL 氨苄青霉素和 13 μ g /mL 氯霉素。
ii. 对于 BL21(DE3) ∆ serB , 使用 100 μg /mL 氨苄青霉素和 25 μg / mL氯霉素。
d. 添加消泡剂 B：约 5-7 滴用于 1-L 培养物，或 1-2 滴用于 50-mL 培养物。
e. 在 ZY-AIM 培养物中加入 ±1% 的 ZY-NIM 培养物（例如，将 10 mL 加入 1 L，或将 0.5 mL 加入 50 mL）。
2. 在 200–250 rpm 和 37 °C下生长，直到 OD 600为 ~1.5。
BL21 细胞大约需要 3-4 小时，B95 细胞大约需要 4-5 小时。
注意：分光光度计读取 OD 600时的线性范围为 0.1–1.0 ，因此一旦细胞密度超过 1.0，就需要将培养物稀释 5 或 10 倍以准确测量细胞密度。
3. 一次外径600 达到 ~1.5，添加更多消泡剂：1-L 培养物约 5 滴；或约 1-2 滴用于 50 mL 培养物。
4. 根据需要降低温度以实现有效的靶蛋白表达。对于 sfGFP 和 sfGFP-150TAG 表达，培养物可以保持在 37 °C。
a. 对于 B95(DE3) Δ A Δ fabR ∆ serB ，表达式可以低至 18 °C ，但对于“低温”表达式，22–25 °C可能更可取。气温高达37 °C是可以接受的。
b. 对于 BL21(DE3) ∆ serB ，表达式低至 18 °C ，高至 37 °C是可以接受的。
5. 继续以 200–250 rpm 的速度摇动约 16–20 小时。

第 4 天：细胞的表达分析和收获
1. sfGFP 对照蛋白表达分析。细胞达到 OD ~1.5 后大约 16-20 小时；对照培养细胞应明显呈绿色。测量sfGFP 和 sfGFP-150TAG 培养物的OD 600和荧光使用荧光计。由于 sfGFP 发色团的形成需要合成全长蛋白质，因此整个细胞的荧光提供了一种方便的策略来评估 sfGFP TAG 密码子抑制的效率，因此 pSer 掺入。可以使用任何能够检测sfGFP荧光的荧光计测量荧光（ex/ em ：488/510nm）。在荧光测量之前，可能需要在缓冲液中以 1:10 至 1: 100稀释培养物（例如，100 μL培养物 + 1,900 μL PBS用于 1:20 稀释）以获得检测限内的信号荧光计。 OD 600值会因目标蛋白而异。正常值的范围为~2.5 到 15。最终 OD 600值低于 2 表示由于靶蛋白表达导致细胞生长不良或毒性。

测试表达式基准：为野生型 sfGFP 和 sfGFP-150TAG 构造执行 50 mL 测试表达式可确保协议得到正确实施。表 1 中列出的基准产量基于 50 mL 培养体积，完全按照本协议中的描述（37 °C表达温度，ZY-AIM）表示。

1.基于培养荧光的sfGFP -WT 和150TAG蛋白表达产量的基准
拉紧培养荧光# 每升培养物中 sfGFP 毫克数* 外径600
重量 sfGFP B95 9,550 (6,000–10,000) 550 (340–600) 8.0
sfGFP 150TAG B95 2,900 (2,000–3,000) 180 (120–200) 8.5
重量 sfGFP BL21 8,500 (6,000–10,000) 480 (340–600) 11.0
sfGFP 150TAG BL21 1,300 (1,000–2,500) 80 (60–150) 12.1

#括号中所示的范围被认为是正常的，具体取决于日期和试剂制备。这里报告的荧光值是在手持式PicoFluor荧光计 (Turner Biosystems) 上通过将细胞直接从培养物稀释到 PBS (1:20) 中获得的。荧光值是任意的，取决于所使用的荧光计。重要的是 sfGFP-150TAG 和 sfGFP-WT 培养物荧光的相对比例与上述值一致（即 sfGFP-150TAG 蛋白表达培养物的荧光应该是 WT sfGFP 的 1/4 到 1/2） .
*使用纯化 sfGFP 的荧光标准曲线确定sfGFP的产量（以毫克/升计）。

2. 600 > ~2 在 5,000 rcf下离心15 分钟，则通过离心收获细胞。倒出培养上清液并重悬于适当的缓冲液中。
• 缓冲液的选择取决于目的蛋白、下游纯化策略和应用，应由用户决定。
• 在此缓冲液中添加冷冻保护剂 [例如 10% (v/v) 甘油] 有助于最大限度地减少与冷冻对敏感或不稳定蛋白质相关的不利影响。建议在所有纯化步骤中向缓冲液中添加磷酸酶抑制剂（参见配方）。细胞可以在液氮中快速冷冻并储存在 -80 °C 下，或者您可以继续进行纯化。
• 对于通过 TALON 树脂纯化的 His 6标记蛋白，推荐的重悬/裂解缓冲液为 50 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl、10% (v/v) 甘油、5 mM 咪唑、50 mM NaF 、5 mM 钠焦磷酸盐和 1 mM 原钒酸钠。

数据分析

蛋白质磷酸化分析
1. 对于每个表达式，重要的是要确认 pSer 忠实地掺入到目标蛋白中。虽然大肠杆菌不包含在真核细胞中发现的广泛的蛋白磷酸酶网络，但它们确实具有可以在蛋白质表达过程中水解靶蛋白的磷酸酶，从而产生磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物。 pSer 水解的敏感性很大程度上取决于靶蛋白、pSer 掺入位点和培养条件。当在 37 °C 下使用上述方法表达 sfGFP-150TAG 时，纯化的蛋白质应为 90-95% 磷酸化（参见图 2 和 Zhu 等人，2019）。
2. 有几种方法可用于评估纯化目标蛋白的磷酸化状态。
a. Phos - tag 电泳： Phos -tag 凝胶电泳是 SDS-PAGE 的一种改进形式，与非磷酸化对应物相比，磷酸化蛋白质以减弱的电泳迁移率迁移；蛋白质上的磷酸化位点越多，它迁移的速度就越慢，从而可以区分不含、单一和多 pSer 的蛋白质（Kinoshita 等。 , 2006) 。此外，通过测量磷酸化和非磷酸化蛋白质条带的密度，可以定性评估蛋白质磷酸化的百分比。 Phos -tag 的其他优点包括一次评估多个样品的能力，只需要标准的 SDS-PAGE 电泳装置，并且经济。需要注意的是，野生型（非磷酸化）蛋白质必须与磷酸化蛋白质并排运行，以观察电泳迁移率的相对变化。不要在Phos -tag 凝胶上运行分子量标记，因为它们含有与Phos -tag 不兼容的 EDTA 。参见图 2，以及朱等人。 (2019)，例如 sfGFP 对照蛋白 SDS-PAGE 和Phos -tag 凝胶。

Phos -tag 凝胶电泳评估sfGFP磷酸化状态。
上述表达方法在 37 °C下对纯化的 WT sfGFP 和 sfGFP-150pSer 蛋白进行Phos标签（顶部）和 SDS-PAGE（底部）凝胶。因为它们在Phos -tag 凝胶上的迁移方式不同，所以磷酸化和非磷酸化蛋白质可以相互分离，并且可以轻松评估磷酸化蛋白质的比例。在本例中，150pSer-sfGFP 蛋白质样品的磷酸化程度 >90%，仅含有微量的非磷酸化蛋白质，其迁移方式与野生型 sfGFP 蛋白质相同。所有蛋白质在 SDS-PAGE 上迁移相同，表明在Phos标签中观察到的电泳变化是由于磷酸化状态而不是蛋白质大小的差异。将这些样品在标准 Laemmli 缓冲液中 95 o C孵育 5 分钟，然后上样到凝胶上。

b. 质谱：全蛋白质谱 (MS) 可能是确认蛋白质磷酸化的最有说服力的方法，如果设施可用且目标蛋白质适合 MS 分析。
重要提示：胰蛋白酶消化后进行磷酸化蛋白的 MS 碎片分析（即“自下而上”MS/MS 分析）可用于确认 pSer 掺入和掺入位点，但不应用于评估或得出结论关于磷酸化程度。
3. 如果纯化的目标蛋白被部分水解，故障排除提示。
a. 增加纯化缓冲液中磷酸酶抑制剂的浓度，或考虑使用更广泛的磷酸酶抑制剂混合物（例如，Sigma #P2850）。
b. 将表达温度降低至 18–22 °C 。
c. 将表达时间从 16-20 小时缩短到 10-12 小时，但应注意确保培养物达到 OD 600 > 2.5 以获得足够的时间以允许自动诱导和表达发生。这将产生更少但可能质量更好的蛋白质。
d. 通过 0.2 μ m过滤器过滤所有纯化缓冲液，以确保它们清洁且无污染细菌生长。在 4 °C 下进行纯化。
e. 开发纯化策略以将磷酸化蛋白质与非磷酸化蛋白质分离，例如通过阴离子交换色谱法或Phos - tag 琼脂糖树脂（例如 Wako Chemicals #AG-501）。
f. 含有碳-磷键而不是不稳定的氧-磷键的磷酸-丝氨酸的不可水解模拟物。这是一个独特的 GCE 表达系统，其方法论超出了本协议的范围（Zhu 等。 , 2021) 。

食谱

注意：氨苄青霉素抗生素原液可在水中制成 100 mg/mL。氯霉素储备液可在乙醇中制成 25 mg/mL。在 -20 °C 下储存在 1 mL 等分试样中。
1. 磅/琼脂 (1 L)
a. 10 克胰蛋白胨、5 克酵母提取物、5 克氯化钠、15 克琼脂
b. 彻底混合后，在标准液体设置下高压灭菌。
c. 高压灭菌后，轻轻摇动瓶子以确保融化的琼脂混合均匀。
笔记：
i. 将 LB/琼脂瓶存放在 55 °C烤箱中，并根据需要倒入盘子。如果保持无菌状态，LB/琼脂可以以熔融形式储存约 2 周。
ii. 如果没有烤箱，一旦 LB/琼脂充分冷却到可以触摸，就可以将盘子倒入抗生素。板可在 4 °C下储存3 – 5 天。
d. 对于B95(DE3) Δ A Δ fabR ΔserB _ 盘子，使用 25 μ g /mL 氨苄青霉素（用于pRBC质粒）和 7 μ g /mL 氯霉素（用于 pKW2-EFSep 质粒）。
e. 对于 BL21(DE3) Δ serB板，使用 100 μg / mL 氨苄青霉素（用于pRBC质粒）和 25 μg / mL 氯霉素（用于 pKW2-EFSep 质粒）。

2. 起始培养基
ZY 非诱导培养基 (ZY-NIM)，改编自Studier (2005) 。
下表 2 中的每个组件应单独制备和单独灭菌。灭菌后，只要保持无菌状态，每个组件都可以在室温下无限期地单独储存。仅应在室温下和即将使用前混合组分。

表 2. ZY-NIM 配方
100 毫升
中源传媒 94.5 毫升
1M MgSO 4 0.2 毫升
25 × M-盐 4.0 毫升
40% (w/v) α -D-葡萄糖 1.25 毫升
痕量金属溶液 (5,000 × )* 20 µL
氨苄青霉素（100 mg/mL 库存） B95细胞50 μL ， BL21细胞100 μL
氯霉素（25 mg/mL 库存） B95细胞50 μL ， BL21细胞100 μL
*痕量金属不是必需的，但在表达需要金属辅助因子的蛋白质时会有所帮助。

ZY 培养基（1 升）
a. 10 克胰蛋白胨，5 克酵母提取物
b. 高压釜

1M MgSO 4 (50 毫升)
a. 12.3 g 七水盐，加入MilliQ H 2 O 至 50 mL 总体积
b. 高压灭菌器或无菌过滤器

25 × M-盐（1 升）
0.625 M Na 2 HPO 4 （二碱基钠），88.73 g 无水盐
0.625 M KH 2 HPO 4 （一元钾）、85.05 g 无水盐
1.25 M NH 4 Cl，66.86 克
0.125 M Na 2 SO 4 ，17.75 g无水盐
高压釜
注意：如果您没有硫酸钠但有硫酸铵，请使用以下替代配方：
0.625 M Na 2 HPO 4 （二碱式钠），88.73 g
0.625 M KH 2 HPO 4 （二元钾），85.05 g
1.0 M NH 4 Cl，53.49 克
0.125 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 16.52 g
高压釜

40% (w/v) 葡萄糖 (50 毫升)
a. 20 g α -D-葡萄糖，加入MilliQ H 2 O 至 50 mL 总体积e
b. 高压灭菌器或无菌过滤器。

5,000 ×痕量金属（见表 3）

表 3. 微量金属混合物配方
30 mL 原液的量 30 mL 储备溶液的量以制备 50 mL 的 5,000 ×溶液 1 ×培养基浓度
CaCl 2 ·2H 2 O (8.82 g) 500 毫升 4毫米
MnCl 2 ·4H 2 O (5.93 g) 500 毫升 2毫米
ZnSO 4 ·7H 2 O (8.62克) 500 毫升 2毫米
CoCl 2 ·6H 2 O (1.32 g) 500 毫升 0.4 毫米
CuCl 2 (807 毫克) 500 毫升 0.4 毫米
NiCl 2 (777 克) 500 毫升 0.4 毫米
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O (1.45克) 500 毫升 0.4 毫米
Na 2 SeO 3 (1.03 克) 500 毫升 0.4 毫米
H 3 BO 3 (371 毫克) 500 毫升 0.4 毫米
FeCl 3 (486 毫克) 25 毫升 10毫米
用无菌水稀释至 50 mL

3. 表达媒体
ZY-auto 诱导媒体 (ZY-AIM)，改编自(Studier, 2005) 。
下表 4 中的每个组件应单独制备和单独灭菌。灭菌后，只要保持无菌状态，每个组件都可以在室温下无限期地单独储存。仅应在室温下和使用前立即混合组件。请注意，除 50 × 5052 溶液外，所有组分的配方都在上面描述“起始培养基”的部分中。

ZY -AIM 配方
1升
中源传媒 940 毫升
MgSO 4 (1M) 2 毫升
25 × M-盐 40 毫升
50 × 5052解决方案 20 毫升
痕量金属溶液 (5,000 × )* 200 µL
氨苄青霉素（100 mg/mL 库存） B95细胞500 μL ，BL21 细胞 1 mL
氯霉素（25 mg/mL 库存） B95细胞500 μL ，BL21 细胞 1 mL
*痕量金属不是必需的，但在表达需要金属辅助因子的蛋白质时会有所帮助。

50 × 5052 溶液 (500 毫升)
2.5% (w/v) α -D-葡萄糖，12.5 g
10% (w/v) 乳糖，50 克
25% (v/v) 甘油、125 mL 甘油或 250 mL 50% 溶液
注意：乳糖不会立即溶解。在微波炉中加热溶液约 2 – 3 分钟将使溶液充分加热以溶解乳糖。一溶解，乳糖将无限期地留在溶液中。在高压灭菌之前，乳糖必须处于溶液中。
高压灭菌
注意：由于纯甘油的粘度较高，先制备 50% (v/v) 的甘油溶液比较容易，如下所示：
a. 在 500 mL 量筒中加入一个大小合适、干净的搅拌棒。
b. 将 250 mL 的MilliQ H 2 O 添加到量筒中。
c. 放在搅拌板上，开始搅拌量筒中的水。
d. 在搅拌的同时将 100% 甘油慢慢倒入量筒中，直到最终体积为 500 mL。
e. 继续搅拌 5-10 分钟，直到甘油彻底混合。

4. SOC 培养基（每次转化需要 1 mL）
a. 准备以下单独的无菌组件
2 × YT 培养基：每升 16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母提取物、5 g NaCl（高压灭菌器）
40% (w/v) 葡萄糖（见上文）
1 M MgSO 4 （见上文）
b. 将以下内容组合为 50 mL 的 SOC
49 mL 的 2 × YT
450 μ L 40% 葡萄糖（20 mM 终浓度）
500 μ L的 1 M MgSO 4 （20 mM 终浓度）
注意：很容易污染 SOC。我们建议在使用前将其分成 5 × 10-mL 的等分试样，或小批量。如果保持无菌状态，SOC 可以在室温下无限期储存。它也可以储存在-20 ° C ，但要避免反复冻融循环。

5. 用于蛋白质纯化的磷酸酶抑制剂
股票解决方案
a. 1 L 的 1 M NaF （氟化钠）
i. 用 900 mL MilliQ H 2 O 搅拌溶解 42 g NaF 。
ii. 溶解后，调整至 1 L 最终体积。
iii. 该溶液在室温下无限期稳定。
b. 250 mM 焦磷酸钠 pH 7.5 ( NaPPi )
i. mL中溶解 27.7 g NaPPi （二碱基，MW = 221.9）。
ii. 用 5 M NaOH 或 5 M HCl 将pH 值调节至 7.5。
iii. 将总体积调整为 500 mL。
iv. 将 45 mL 分装到 50 mL锥形中，在 -20 °C 下冷冻保存直至使用。
c. 200 mM 原钒酸钠 (Na 3 VO 4 )
i. 将 1.85 g Na 3 VO 4添加到 45 mL 的MilliQ水中并在搅拌下溶解。
ii. 在搅拌下缓慢滴加 1 M HCl，将 pH 调节至 10。加入 HCl 会使溶液变黄，表明形成钒酸盐低聚物。
iii. 通过在微波炉中加热使溶液温和沸腾。煮沸 5-15 秒后，溶液将变得清澈无色。
iv. 冷却（在冰上将加速该过程）直到溶液达到室温。
v. 此时，pH 值可能大于 10。加入少量（几滴，搅拌下）1 M HCl 将溶液调节回 pH 值 10。
vi. 如果溶液变黄，重复步骤 (iii – v)。经过几次煮沸、冷却和调节 pH 值的循环后，溶液应达到 pH 值稳定在 ~10 的点。
vii. 在 -20 °C 下储存活化（无色和单体）Na 3 VO 4 。

工作解决方案
以下列工作浓度将抑制剂原液稀释到您的缓冲液中：
20–50 毫米氟化钠
5–10 mM NaPPi
0.5–1 mM 原钒酸盐

致谢

该协议改编自朱等人以前的工作。（2019 年）。这项研究部分由 GCE4All 生物医学技术开发和传播中心资助，得到国家普通医学科学研究所赠款 RM1-GM144227 以及美国国立卫生研究院赠款 1R01GM131168-01 的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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