材料和试剂

A. HEK293细胞的培养
1. 1.5 mL Eppendorf管（对角线，目录号：02-023-0100）
2. 无菌过滤移液器吸头：
10 µL（Greiner Bio-One，蓝宝石，目录号：772353）
100 µL（Greiner Bio-One，蓝宝石，目录号：774353）
1,250 µL（Greiner Bio-One，蓝宝石，目录号：778353）
3. 96孔板（µClear，Greiner Bio-One，目录号：655090）
4. 15 mL Falcon管（ VWR，目录号：734-0451）
5. LUNA可重复使用的细胞计数载玻片（Logos Biosystems ，目录号：L12011）
6. 无棉垫的高压灭菌一次性玻璃巴斯德移液器（VWR，目录号：HECH40567001）
7. 无菌、单独包装的血清移液器：
5 mL移液器（ Sarstedt ，目录号：86.1253.001）
10 mL移液器（ Sarstedt ，目录号：86.1254.001）
8. 10％胎牛血清（FCS，Sigma-Aldrich，目录号：F0804）
9. 1％青霉素/链霉素（P / S，Sigma-Aldrich，目录号：P0781-100ML）
10. Dulbecco's Modified Eagle Medium 高葡萄糖（DMEM，Thermo Fisher，Gibco，目录号：41965062）
11. 试剂容器（VWR，目录号：613-1175）
12. Flp -In T-Rex HEK293细胞（人胚肾293，Invitrogen，目录号：R78007）
13. 聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4832-50mL）
14. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水粉（DPBS，Sigma-Aldrich，目录号：D5652）
15. 10×胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T4174）
16. 台盼蓝（Logos Biosystems ，目录号：T13001）
17. DMEM 培养基完全（Gibco，目录号：41965039）（参见配方）
18. DPBS（见食谱）
19. 胰蛋白酶-EDTA 溶液（见配方）

B. HEK293细胞的转染
1. 质粒：
pCS2+HyPer7-NES [ addgene : 质粒 #136467 (Pak 等。 , 2020) ]
pCS2+MLS-HyPer7 [ addgene : 质粒 #136470 (Pak 等。 , 2020) ]
2. 聚乙烯亚胺（PEI）（ Polysciences ，目录号：23966-1）
3. 聚乙烯亚胺(PEI) 1 mg/mL （参见食谱）
4. Dulbecco's Modified Eagle Medium medium-pure（DMEM，Thermo Fisher，Gibco，目录号：41965062）（参见食谱）

C. 在 HEK293 细胞中诱导 DAO 的表达
1. 强力霉素（DOX）（AppliChem，目录号：A2951,0005）

D. H 2 O 2测量
1. D-丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：338-69-2）
2. L-丙氨酸生化（ Applichem ，目录号：A3690,0100）
3. H 2 O 2 （Sigma-Aldrich，目录号：216763-100ML）
4. 最小媒体（见食谱）：
NaCl （Roth，目录号：7647-14-5）
氯化钾（罗斯，目录号：7447-40-7）
氯化镁2 （罗斯，目录号：2189.2）
氯化钙2 （默克，目录号：23.891.000）
HEPES （VWR，目录号：7365-45-9）
葡萄糖（CIL，目录号：110187-42-3）
10％胎牛血清（FCS，Sigma-Aldrich，目录号：F0804）

设备

A. HEK293细胞的培养
1. 层流罩 II 级（ENVAIR eco）
2. CO 2培养箱（新不伦瑞克省）
3. 真空泵（实验室）
4. 显微镜（ motic AE2000）
5. 多道移液器 (VWR)
6. 细胞计数器 - LUNA-II（Logos Biosystems，目录号：L40002）
配备的细胞培养实验室，包括例如 II 级层流罩 (ENVAIR eco)、用于培养细胞的 CO 2培养箱（培养设置为 37 °C 和 5% CO 2 ）、用于去除培养基的真空泵无菌玻璃巴斯德移液器、显微镜、细胞计数器和冷却离心机。

B. HEK293细胞的转染
除了 A。
1. 涡流振荡器

C. H 2 O 2测量
1. Cytation 3（安捷伦、 BioTek ）
CO 2控制
喷射系统（可选）
390LED Rev H （Agilent， BioTek ，目录号：1225009）
roGFPsmall 过滤器块ex.390 em 。 525 Rev D （Agilent， BioTek ，目录号：1225108）
465LED Rev I（Agilent， BioTek ，目录号：1225001）
GFP过滤器块ex。 469时。 525 Rev I （Agilent， BioTek ，目录号：1225101）
2. (Poburko ) 的 HEPES 缓冲液 (HBSS) 溶液等。 , 2011)] (见食谱)
3. 完整的最小培养基 [来自(Poburko ) 的 HEPES 缓冲液 (HBSS) 溶液等。 , 2011)] (见食谱)

软件

1. 氧化还原比分析 (RRA) [MD Fricker 博士， https ://markfricker.org/77-2/software/redox-ratio-analysis/ (Fricker, 2016) ]
2. R ( https://www.r-project.org/ )
3. 工作室（ https://www.rstudio.com/ ）

程序

该过程的概述如图 1 所示。

图 1. HyPer7 测量协议中的步骤示意图。
将细胞接种在 96 孔板中。我们描述了两种不同的实验，一种是评估添加外部推注 H 2 O 2时的反应（实验 A），另一种是由 DAO 局部产生H 2 O 2 （可选实验 B）。数据是在Cytation 3 自动多孔显微镜装置上获取的，该装置允许在 5% CO 2存在的情况下在 37 °C 下培养细胞。数据采集后，必须对数据进行处理（原始数据分析），然后进一步分析以供呈现。

A. HEK293 细胞的培养（第 1 天）（见注 1 ）
Flp -In T-Rex HEK293 细胞在含有 FCS 和青霉素/链霉素抗生素混合物的高葡萄糖 DMEM 培养基中培养。 HEK293 细胞在 100 毫米培养皿上在 10 毫升 DMEM 培养基中培养，直至 90% 融合。对于所描述的实验，HEK293 细胞被镀在 100 μL 的 DMEM 培养基完全的聚-L-赖氨酸涂层的 96 孔板上。
1. 将 96 孔板从包装中与聚 L-赖氨酸一起转移到表面消毒的层流罩 II 级。
2. 取一个 10 mL 移液器，滴加聚-L-赖氨酸，直到表面完全覆盖。让它在室温下静置 5 分钟。
3. 使用 1 mL 移液器小心取出聚 L-赖氨酸，因为它最多可以重复使用五次。将涂层的 96 孔板转移到 37°C 和 5% CO 2的培养箱中，让它干燥至少 1 小时。
4. 在 37 °C 和 5% CO 2的培养箱中，在 10 mL 的 DMEM 培养基中培养 100 mm 培养皿中的 HEK293 细胞，直到它们达到 90% 的融合。
5. 将无菌 DMEM 培养基完全、无菌 DPBS 和无菌胰蛋白酶-EDTA 转移到表面消毒的层流罩 II 类。将所有溶液预热至 37°C。
6. 播种前，将涂层的 96 孔板转移到层流罩。用预热的 DPBS 仔细清洗盘子三遍。
7. 将盘子转移到层流罩。
8. 使用高压灭菌的一次性玻璃巴斯德吸管和真空泵取出介质。
9. 使用血清移液器和移液器男孩在盘子边缘加入 5 mL 无菌 DPBS，仔细清洗细胞。
10. 使用高压灭菌的一次性玻璃巴斯德吸管和真空泵去除 DPBS。
11. 使用 1 mL 无菌过滤器吸头将 1 mL 无菌胰蛋白酶-EDTA 添加到细胞上。
12. 在 37°C 和 5% CO 2下孵育培养皿5 分钟，直到细胞分离。用手掌轻弹盘子。
13. 将盘子转移回层流罩，并使用 5 mL 血清移液器添加 4 mL 的 DMEM 培养基。
14. 使用 5 mL 血清移液器和移液器男孩将细胞单一化。
15. 将细胞悬浮液转移到 15 mL Falcon 管中，并将 20 μL 这种细胞悬浮液转移到 1.5 mL Eppendorf 管中进行计数。
16. 使用细胞计数器或血细胞计数器使用台盼蓝的小等分细胞悬浮液确定细胞浓度。
17. 稀释细胞悬浮液，使它们的浓度为 4，000 个细胞/100 μL。在此解决方案中，每口井需要播种 100 μL。总体积取决于所需的井数。尽量避免因蒸发而播种外井。
18. 使用储液罐、无菌过滤移液器吸头和多通道移液器播种稀释的细胞悬液。
19. 在 37°C 和 5% CO 2的培养箱中孵育板。

B. HEK293 细胞的转染（第 2 天）（见注释 2和3 ）
播种后的第二天，用感兴趣的传感器转染细胞。如果使用相同的传感器转染更多孔，则在1.5 或 2 mL Eppendorf 管中制备转染预混液（取决于孔数）。
1. 将无菌 DMEM 中纯和无菌 DMEM 培养基完全转移到表面消毒的层流罩 II 类。将所有溶液预热至 37°C。
2. 解冻质粒以及聚乙烯亚胺[PEI (1 mg/mL)]。
3. 将 0.05 μg /孔的质粒 DNA 与 10 μL /孔的 DMEM 培养基混合，室温孵育 5 分钟。
4. 孵育后，加入 0.15 μL /PEI（最终浓度为 1 μg/mL），涡旋 10 s。在室温下孵育转染混合物 10 分钟，以确保形成转染复合物。
5. 将种子 96 孔板转移到层流罩。
6. 将 40 μL /孔的 DMEM 培养基完全添加到转染溶液中。
7. 在每口井中加入 50 μL 的质粒转染溶液。
8. 在 37°C 和 5% CO 2的培养箱中孵育板。

C. 诱导 HEK293 细胞中 DAO 的表达 [第 3 天；仅当使用诱导系统时（实验 B）]（见注 4 ）
诱导线粒体靶向 DAO ( mtDAO ) 的蛋白质表达，该 DAO 使用Flp -In T-Rex 系统稳定转染。 DAO与 D-丙氨酸反应会产生 H 2 O 2 。它不与 L-丙氨酸反应。
1. 将无菌 DMEM 培养基完全转移到表面消毒的层流罩 II 级。将所有溶液预热至 37°C。
2. 解冻强力霉素 (DOX)。
3. 使用无菌过滤器吸头制备 1 mL 的 DMEM 培养基，使用 DOX 1:100 稀释（从 1 mg/mL 库存，最终浓度 10 μg/mL）。
4. 将 96 孔板转移到层流罩。
5. 将准备好的 DOX 溶液转移到水库中。
6. 使用无菌过滤移液器吸头和多通道移液器将 10 μL 的此溶液添加到 96 孔板的每个孔中。
7. 在 37°C 和 5% CO 2的培养箱中孵育板。

D. H 2 O 2测量（第 4 天）（见注 5 ）
测量 HyPer7 对添加 H 2 O 2的反应（实验 A），或者是否通过用 D-丙氨酸或 L-丙氨酸处理来表达 DAO（实验 B）。
1. 在启动Cytation 3 之前检查过滤器。HyPer7 在 390 nm (±9) 和 469 nm (±17.5) 的激发水平下测量。
2. 2将Cytation 3预热到 37 °C ，并相应地设置测量协议。实验 A：60 分钟稳态（每 2 到 3 分钟获取一张图片）；手动注入/添加 30 µL H 2 O 2 （初始实验范围为2.5–20 µM H 2 O 2终浓度）； 60 分钟测量（每 1 到 1.5 分钟采集一张图片）；手动注入/添加 20 µM H 2 O 2 （以完全氧化 HyPer7 传感器）；和 30 分钟测量（每 1 到 1.5 分钟获取一张图片）。
实验 B：60 分钟稳态（每 2 到 3 分钟获取一张图片）；手动注射/添加 30 µL D/L-丙氨酸（初始实验范围为 1 –8 mM D-丙氨酸终浓度）； 60 分钟测量（每 1 到 1.5 分钟采集一张图片）；手动注入/添加 20 µM H 2 O 2 （以完全氧化 HyPer7 传感器）；和 30 分钟测量（每 1 到 1.5 分钟获取一张图片）。
4. 制备 H 2 O 2 （实验 A）和 D-丙氨酸和 L-丙氨酸（实验 B）稀释液。考虑到由于每口井中已经存在 50 μL 的完整最小培养基（含 10% FCS），将进一步稀释。
5. 2 O 2 、D-丙氨酸或 L-丙氨酸稀释液为注射系统注入底料。
6. 将 96 孔板转移到工作台上，并在所有空外孔中加入蒸馏水 (dH 2 O)，以防止介质蒸发。
7. 取出将要测量的孔的介质。不要从将在白天晚些时候测量的孔中取出介质。使用这些Cytation 3 设置，可以在同一测量中测量多达 18 个孔。
8. 在每口井中加入 50 μL 的完整最小介质（含 10% FCS）。
9. 将 96 孔板放入Cytation 3 中，然后开始为每个孔设置信标。
10. 设置信标并保存设置后，开始测量。
11. 添加10-30 µL 的处理溶液。不要减少体积以确保溶液能够正确混合。

数据分析

在本协议中，我们描述了比率传感器 HyPer7 的使用。使用大约 405 和 488 nm 处的两个激发峰，可以评估传感器的氧化还原状态，从而间接评估其周围 H 2 O 2的水平。在这些峰值处形成强度比可减少由传感器浓度差异导致的误差（Pak 等人，2020 年）。可以使用 Excel 等标准软件分析数据。对于单细胞数据的浪费量，我们采用了一个半自动化的软件包， RRA（氧化还原比分析）程序（Fricker，2016）。使用 R 进一步分析从此程序导出的数据。
1. 作为分析的第一步，我们使用 RRA 程序提取两个通道和每个单细胞的荧光强度。为此，将图像加载到 RRA 中，并堆叠一个井的所有图像。由于 469 nm 通道更亮，请务必先选择此通道，然后选择 390 nm 通道 ( roGFPsmall )；它将改善对齐。
2. 选择感兴趣区域 (ROI) 并对齐图像。这是必要的，以确保细胞随着时间的推移位于完全相同的位置，并且可以正确提取它们的信号。
3. 要去除背景噪音，请继续“高级比率分析”模式，并过滤背景。
4. 然后，选择 ROI 中存在的每个单元格，并将数据导出为 excel 文件。
5. 作为第二步，我们在 R 中执行下游分析。将 excel 文件加载到 R 中，您将在其中清理数据并删除潜在的异常值，例如浮动死细胞。这些异常值很容易识别为具有 + 6000 和× 10 x比率值的 ROI 。
6. 合并重复的数据，并计算所有测量的单个细胞的平均值。
7. 使用 ggplot2 将每个单元格单独表示为点，并将计算的平均值表示为一条线。通过这种方式，我们可以看到单个细胞反应的异质性，以及细胞群的平均值。
8. 导出图表。

笔记

1. 细胞接种：细胞以低密度接种，以确保以 70% 的融合度在单细胞基础上进行测量。重要的是要对本实验中使用的不同细胞系的生长速度进行评分，以调整第 1 天的细胞接种。细胞密度通常会影响细胞对所应用的处理的处理（例如，更多的细胞可能更多与较低的数量相比，快速从介质中去除 H 2 O 2 ）。如果在测量当天细胞过于密集，这可能会导致测量期间出现更多浮动细胞，从而妨碍正确的自动数据分析。出于同样的原因，我们还建议在 96 孔板中预涂多聚 L 赖氨酸以增加细胞附着。在比较多个实验时，重要的是播种相同数量的细胞，同时转染，并以类似的方式进行实验。
2. 转染：我们总是在转染后 48 小时进行测量。这个时间可以变化，因为瞬时转染的传感器通常可以检测到长达 5 天。高转染效率对于随后的单细胞测量很重要。
3. 该协议中使用的成像参数（390 和 469 nm）不是最佳的。传感器激发峰的最大值在 405 和 488 nm；但是，使用的市售过滤器最适合我们使用的Cytation设置。
4. 针对不同隔室的传感器：生物传感器可以在基因上针对不同的（子）隔室，包括胞质溶胶（具有核输出信号的设备）、线粒体基质和膜间隙 (IMS)、线粒体外膜和质膜以及细胞核。对于每个定位，必须从头开始建立传感器测量。例如，像 IMS 这样的“小”隔间可能只包含少量传感器分子，因此只会产生很小的荧光信号（尤其是 405 nm 通道的荧光信号）。此外，传感器可逆性的机制通常依赖于酶的存在。在 HyPer7 的情况下，传感器直接被 H 2 O 2氧化，但需要通过硫氧还蛋白系统进行还原。因此，如果该系统在所选隔室中的数量不足，则结果可能会受到影响。相反，生物传感器的表达也可能影响其当地环境。对于 HyPer7，必须考虑到它在“检测”到 H 2 O 2 时会清除H 2 O 2 ，因此它可能会干扰氧化还原信号。
5. 诱导型表达系统：可以使用诱导型表达系统代替瞬时转染。我们经常将生物传感器的瞬时表达与mtDAO系统等基因工程工具的可诱导稳定表达结合起来。仔细滴定这些遗传工具的表达水平（使用不同的表达时间和 DOX 量）并确认（如生物传感器）它们的正确定位非常重要。为了确认工程工具的功能，建议直接评估其功能。在 mtDAO 的情况下，与HyPer7 共转染至线粒体基质并添加 D-丙氨酸可作为对照。
6. 测量：
a. 最小介质：我们经常观察到有色介质（例如，含有酚红的介质）对测量的强烈干扰。为确保不受干扰，我们使用最少的介质。这种培养基也可以很容易地适应实验方案的其他需求，例如培养具有不同营养来源的细胞或从这些营养物质中消耗细胞。
b. 传感器：对于多路复用/多参数测量方法，在同一个细胞内组合不同的生物传感器将非常有趣。这也将有助于探索在单细胞测量中观察到的细胞之间的强烈异质性。然而，重要的是要考虑不能组合具有相似荧光光谱特征的生物传感器。
c. 稳态测量：与大多数 H 2 O 2传感器一样，评估 HyPer7 的稳态可能需要很长时间。由于细胞与含氧介质接触，传感器最初氧化程度更高。培养基中氧气的损失会降低 HyPer7。通常在 40 分钟后达到稳定的信号。这种稳态信号通常对应于几乎完全还原的 HyPer7，表明实验最常用于评估氧化损伤。
d. 传感器响应的异质性：在评估单个细胞时，我们观察到细胞之间的生物传感器响应存在很强的异质性。一方面，这需要在单细胞水平上呈现结果，并且需要用许多细胞进行实验，以表明实验的可靠平均值。它还表明，多参数实验最好在同一细胞内使用不同的传感器进行，以识别相关性。

食谱

1. Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 培养基完全
将 10% 胎牛血清 (FCS) 和 1% 青霉素/链霉素 (P/S) 添加到一瓶新鲜的高葡萄糖 DMEM 中。
储存于 4 °C 并在使用前预热至 37 °C。
2. Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中等纯
不添加胎牛血清 (FCS) 和青霉素/链霉素 (P/S)。储存于 4 °C 并在使用前预热至 37 °C。
3. Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)
a. 根据制造商的说明，将一瓶 DPBS 粉末溶解在双蒸水 ( ddH 2 O ) 中。
b. 通过高压灭菌消毒。
c. 储存于 4 °C 并在使用前预热至 37 °C。
4. 胰蛋白酶-EDTA溶液
a. 用无菌 PBS 稀释 10× 胰蛋白酶-EDTA 溶液 1:10。
b. 储存于 4 °C 并在使用前预热至 37 °C。
c. 等分试样可以在-20 °C 下冷冻。
5. 聚乙烯亚胺(PEI) 1 毫克/毫升
a. 2 O中溶解 PEI 。
b. 在搅拌的同时，加入 HCl 将 pH 值增加到 7.0。
c. 无菌过滤溶液。
d. 在 -20 °C 下以小等分形式储存，以便短期储存；在-80 °C 下长期储存。
6. (Poburko ) 的 HEPES 缓冲液 (HBSS) 溶液等。 , 2011)]
a. 蒸馏水中的140 mM NaCl、5 mM KCl 、1 mM MgCl 2、2 mM CaCl 2、20 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。
b. 储存在 4°C。
7. 完整的最小培养基 [来自(Poburko ) 的 HEPES 缓冲液 (HBSS) 溶液等。 , 2011)]
a. 蒸馏水中的140 mM NaCl、5 mM KCl 、1 mM MgCl 2、2 mM CaCl 2、20 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。
b. 添加 10% FCS；等分试样可以在-20 °C 下冷冻保存。
c. 将最小介质的等分试样预热至 37°C。

致谢

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) 资助 JR 实验室的研究 (RI2150/2-2 – 项目编号 251546152, RI2150/5-1 – 项目编号 435235019, CRC1218 / TP B02 – 项目编号 269925409, 和 RTG2550/1 – 项目编号411422114）。该协议用于以下原始研究论文（Hoehne 等。 , 2022) 。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

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