材料和试剂

1. 玻璃基培养皿（玻璃直径 φ12 mm 或 φ27 mm，IWAKI）
2. 由您选择的启动子驱动的 MiniSOG2 构建体，例如 pSP-Neurog::miniSOG2-CAAX。质粒编码 miniSOG2（pcDNA3.1_miniSOG2 T2A H2B-EGFP）（ Addgene ，目录号： 87410）。 miniSOG2-CAAX的DNA序列如表 1 所示。
3. 任意选择的荧光蛋白，由用于识别 miniSOG2 阳性细胞的同一启动子驱动，例如 pSP-Neurog::mCherry-CAAX。 mCherry -CAAX的DNA序列如表 1 所示。
4. Ciona成熟的成年人身上解剖的卵子和精子
5. 天然海水

miniSOG2 -CAAX 和mCherry -CAAX的序列

设备

1. 共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM)，倒置型 (OLYMPUS, Olympus fv1000)
2. 光功率计（HIOKI，光功率计3664）
3. 光学传感器（HIOKI，光学传感器9742）
4. 高速相机（WRAYMER、WRAYCAM-VEX230M）
5. 立体显微镜（OLYMPUS、Olympus SZX12）

软件

1. 奥林巴斯 fv1000 查看器 (OLYMPUS)

程序

1. 将 MiniSOG2 结构与荧光标记一起电穿孔到Ciona受精卵中（Christiaen 等人，2009）。在光消融MN2R和 MN2L的情况下，pSP-Neurog::miniSOG2-CAAX 可用于在 MN2/A10.64 处表达 miniSOG2，而 pSP-Neurog::mCherry-CAAX 可用于标记 MN2 的位置并确定区域激光照射的感兴趣 (ROI) (图 1)。
提示：对于 Ciona，电穿孔应在受精后 30 分钟进行。在胚胎发育到中尾芽 II（St. 22）后，这两种结构都可以观察到（Akahoshi 等人，2021 年）。
2. 将胚胎放在带有天然海水的玻璃培养皿上。
3. 为了评估对目标单个神经元的光消融的影响，在进行激光照射之前，使用连接到立体显微镜的高速相机（200 至 500 fps）对胚胎进行成像。
4. 将您的胚胎置于 CLSM (Olympus fv1000) 下。
5. 设置目标神经元激光照射的 ROI。从标记有荧光蛋白的神经元中选择目标神经元（例如，mCherry。用 559 nm 激光激发 mCherry 的红色荧光）。为避免光消融其他神经元，在进行激光照射之前，请仔细检查 ROI 是否仅限于您的目标神经元。 Olympus 20× 或 40× 油浸镜头均可用作物镜。
6. 使用光功率计和光学传感器测量 440 nm 激光功率密度。优化显微镜中的二向色滤光片或其他光学设备，使激光功率密度至少超过 15 µW/cm 2 。
7. 从胚胎侧面（图1、2）对 ROI 进行 440 nm 激光照射 10 分钟。
提示：每分钟关闭 440 nm 激光并确保胚胎运动不会使 ROI 偏离其原始位置。如果胚胎在照射过程中移动，则再次将 ROI 重置为目标神经元，并重新启动激光照射。

图 1. miniSOG2 转导乔纳胚胎。
pSP - Neurog:: mCherry-CAAX 和pSP- Neurog ::miniSOG2-CAAX 电穿孔的Ciona胚胎 (St. 22)的荧光图像（左）的侧视图。与微分干涉对比 (DIC) 合并的图像显示在右侧面板中。在 MN2 中看到的 mCherry-CAAX 信号用白色箭头表示。激光照射的 ROI 用黄色圆圈表示。

图 2. MiniSOG2 转导的Ciona胚胎在激光照射前后。
pSP -Neurog::mCherry-CAAX 和pSP- Neurog ::miniSOG2-CAAX 电穿孔的Ciona胚胎 (St. 24)的微分干涉对比 (DIC) 合并的荧光图像的侧视图。在 MN2 中看到的mCherry -CAAX 信号用白色箭头表示。激光照射的 ROI 用黄色圆圈表示。剩下;激光照射前。正确的;激光照射后。

8. 作为阴性对照，光消融其他标记的神经元，或仅用mCherry而非 miniSOG2 转导的相同神经元。
9. 照射后 30 分钟，再次用高速相机对照射过的胚胎进行成像。检查它们的行为是否因靶向神经元的光消融而发生任何变化，并将这些变化与作为对照的受辐射胚胎进行比较（视频1 ）。

视频1.对照或miniSOG2转导的Ciona胚胎的行为 b激光照射前后。
对照（ pSP -Neurog :: mCherry -CAAX ）胚胎和miniSOG2 转导（ pSP- Neurog ::mCherry-CAAX 和pSP- Neurog ::miniSOG2-CAAX）胚胎的尾部运动，在激光10 分钟之前和之后辐照。视频是用高速摄像机拍摄的。对照胚胎每30秒发生一次尾部运动，激光照射后没有明显变化。然而，miniSOG2 转导的胚胎在激光照射后变得不动。

致谢

该协议改编自 Makhijani 等人。（2017）和赤星等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

1. Akahoshi, T., Utsumi, MK, Oonuma, K., Murakami, M., Horie, T., Kusakabe, TG, Oka, K. 和 Hotta, K. (2021)。单个运动神经元决定了Ciona早期运动行为的节奏。科学进阶7（50）：eabl6053。
2. Christiaen, L.、Wagner, E.、Shi, W. 和 Levine, M. (2009)。海鞘 Ciona 中转基因 DNA 的电穿孔。 Cold Spring Harb Protoc 2009(12)：pdb prot5345。
3. Makhijani, K.、To, TL、Ruiz-Gonzalez, R.、Lafaye, C.、Royant, A. 和 Shu, X. (2017)。用于活体动物模型系统中选择性单细胞和多细胞消融的精密光遗传学工具。细胞化学生物学24（1）：110-119。