材料和试剂

A. 材料
1. 细胞培养皿，直径 100 mm（Corning，目录号：9380H79）
2. 细胞培养皿，直径 60 mm（Corning，目录号：9380H77）
3. 12孔板（Fisher Scientific，目录号：08-100-241）
4. 15 mL离心管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430791）
5. 10 mL移液管（Corning，目录号：4488）
6. 1.5 mL eppendorf管，1.5 mL（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
7. 1,000 µL 蓝色尖端（ Axygen ，目录号：T-1000-B）
8. 200 µL 黄色尖端（ Axygen ，目录号：T-200-Y）
9. 10 µL透明吸头（ Axygen ，目录号：T-300）
10. Eppendorf 移液器（Eppendorf，目录号：2231300002）
11. 电子移液器（ Thermo Scientific，目录号：9501）
12. 0.22 µm 过滤器（Fisher Scientific，目录号：SLGP033RS）
13. 细胞刮刀（Fisher Scientific，目录号：08-100-241）

B. 细胞系和质粒
1. HEK293T（人胚肾293T）细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
2. CHO（中国仓鼠卵巢）细胞（ATCC，目录号：CCL-61）
3. HA-Vangl2 质粒（之前在 Gao 中描述等。 , 2011)
4. His-泛素质粒（之前在 Feng 等。 , 2021)
5. FLAG-Wnt5a 质粒（之前在 Gao 中描述等。 , 2011)
6. FLAG-Ror2 质粒（之前在 Gao 中描述等。 , 2011)
7. Myc-CK1 δ质粒（之前在 Gao 中描述等人， 2011）

C. 抗体
1. 抗HA抗体（Roche，目录号：11867431001，1：5,000稀释）
2. 抗His抗体（Abcam，目录号：ab18184，1：5,000稀释）
3. 抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804，1：5,000稀释）
4. 抗Myc抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-40，1:2,000 稀释度）
5. 抗泛素抗体（FK2）（Enzo Life Sciences，目录号：ENZ-ABS840-0100，1:1,000 稀释）
6. 抗 Vangl2-Phospho-T78/S79/S82 抗体（ ABclonal ，目录号：AP1206，1:1,000 稀释度）
7. 抗 Vangl2-Phospho-S79/S82/S84 抗体（ ABclonal ，目录号：AP1207，1:1,000 稀释度）
8. 抗肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A2228，1：5,000 稀释）
9. 抗 GAPDH 抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-47724，1:5,000 稀释）
10. 山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，HRP（Invitrogen，目录号：31430）
11. 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，HRP（Invitrogen，目录号：31460）
12. 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗，HRP（Invitrogen，目录号：31470）

D. 试剂
1. Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco，目录号：12-800-017）
2. 胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10-099-141）
3. 青霉素-链霉素（PS）（Gibco，目录号：15140122）
4. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25-200-056）
5. 蛋白酶体抑制剂MG132（Abcam，目录号：ab141003）
6. 溶酶体抑制剂氯喹（CQ）（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
7. CK1抑制剂D4476（Abcam，目录号：ab120220）
8. 去泛素酶抑制剂 N-乙基马来酰亚胺（NEM）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23030）
9. 的，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11836153001 ）
10. 磷酸酶抑制剂混合物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：78420）
11. 聚乙烯亚胺（PEI）（Sigma-Aldrich，目录号：765090）
12. Opti-MEM TM I 减少血清培养基（Gibco，目录号：31985070）
13. Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：30210）
14. 蛋白 A/G Plus-琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2003）
15. Tris（ Thermo Scientific，目录号：J75825）
16. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
17. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
18. 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
19. 碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
20. 氯化钾（ KCl ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
21. 磷酸二氢钠（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
22. 甘氨酸（ Affymetrix，目录号：16407 ）
23. 十二烷基硫酸钠（SDS）（ Sigma-Aldrich，目录号：436143 ）
24. 咪唑（ Sigma-Aldrich，目录号：12399 ）
25. 盐酸胍（Sigma-Aldrich，目录号：50950）
26. 4x Laemmli 样品缓冲液（ Bio-Rad，目录号：1610747 ）
27. β-巯基乙醇（Bio-Rad，目录号：1610710）
28. 30％丙烯酰胺/双溶液，29：1（Bio-Rad，目录号：1610156）
29. 过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
30. 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
31. 页面标尺预染蛋白阶梯（ Thermo Scientific，目录号：26616）
32. Immobilon-P 膜（PVDF）（Merck，目录号：IPVH00010）
33. 甲醇（VWR International，目录号：BDH1135-1LP）
34. 2-丙醇（VWR International，目录号：BDH1131-1LP）
35. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
36. IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：18896）
37. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：11332481001）
38. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
39. 脱氧胆酸（DCA）（Selleck Chemicals，目录号：S4689）
40. SuperSignal West Femto最大灵敏度底物（ Thermo Scientific，目录号：PI34096）
41. PBS（见食谱）
42. RIPA 裂解缓冲液（参见配方）
43. 缓冲区 A（见配方）
44. 缓冲 TI（见配方）
45. 缓冲液 B（见配方）
46. 8% 溶解凝胶（见配方）
47. 5% 浓缩凝胶（见配方）
48. WB 运行缓冲液（见配方）
49. WB Transfer Buffer （见配方）
50. WB Blocking Buffer （见配方）
51. WB 洗涤缓冲液（见配方）

设备

1. 37°C，5% CO 2强制空气培养箱（ Thermo Scientific，目录号：4110）
2. 温水浴
3. 超声波细胞破碎仪（Costar，目录号：3513）
4. 干浴（加热器）（VWR International，目录号：SH-1001）
5. 微量离心机（Hitachi，目录号：CT15RE）
6. 摇床（VWR，目录号：97109-890）
7. 转子（VWR，目录号：10136-084）
8. SDS-PAGE凝胶浇注装置（Bio-Rad，目录号：1658008）
9. 蛋白质电泳和印迹仪器（Bio-Rad，目录号：1656019）
10. ChemiDoc MP 成像系统（Bio-Rad，目录号：17001402）

软件

1. Image Lab 6.1 软件 (Bio-Rad)
2. ImageJ (美国国立卫生研究院)

部分 I：用于 Vangl2 泛素化测定

程序

A. 细胞培养、转染和 MG132 处理
°C和 5% CO 2的潮湿培养箱中维持在 DMEM 完全培养基（DMEM 补充有 10% FBS 和 1% PS）中。
1. 在直径为 100 mm 的培养皿中培养 HEK293T 细胞，直到 90% 融合。
2. 以 1:6 的比例将细胞传递到直径为 60 mm 的细胞培养皿中。
3. 在 37 °C 、5% CO 2下孵育细胞约 20 小时，直至 50 % –70% 融合。
4. 在转染前 4 小时更换为 4 mL 的新鲜培养基。
5. 聚乙烯亚胺(PEI) 以 1:4 (µg DNA: µg PEI) 的比例用表达 HA-Vangl2 和/或 His-泛素的质粒转染细胞。对于 60 mm 细胞培养皿，总共转染 4 µg 质粒（2 µg HA-Vangl2 + 2 µg 空载体、2 µg His-泛素 + 2 µg 空载体或 2 µg HA-Vangl2 + 2 µg His-泛素） .
6. 将细胞孵育 12 小时。
7. 转染后 12 小时更换为 4 mL新鲜培养基。
8. 转染的细胞共培养48小时。
9. 将 MG132 添加到 10 μM 的最终浓度，并在收获细胞前孵育 4 小时。

为确保泛素化信号仅来自 Vangl2 而不是其相互作用的蛋白质，泛素化测定在变性条件下进行，使用 2% SDS 裂解缓冲液（Choo 和 Zhang，2009）或 6 M 胍裂解缓冲液（Wang 等人， 2017）。我们提供了两种方法来分析感兴趣的蛋白质的泛素化，因为它们都是常用的，我们在之前的研究中已经验证了它们。因此，这里我们提供了两种检测 Vangl2 泛素化的方法。我们建议读者选择两种方法中的一种来开始他们的实验。

B. 2% SDS变性条件下的泛素化测定
1. 轻轻吸出培养基，并在细胞收获前立即用冷 PBS 冲洗细胞 3 次。
2. 用 100 μL 的 RIPA 裂解缓冲液在 60 mm 培养皿中裂解细胞，其中含有 2% SDS、10 mM去泛素酶抑制剂 NEM、蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在室温 (RT) 下孵育 5 分钟，然后将细胞裂解物刮取并收集到 1.5 mL Eppendorf 管中。
3. 在 95°C 下煮沸 10 分钟。
4. 在 3s ON/7s OFF 时用超声波细胞破碎器进行声波处理，振幅为 30%，直到溶液清澈。
5. 用 9 倍 (900 µL) RIPA 裂解缓冲液稀释上清液，将 SDS 浓度降至 0.2%，使裂解液的最终体积为 1 mL。
6. 在冰上孵育 15 分钟。
7. 16,000 × g离心15 分钟，收集上清液。
8. 通过收集 1/20 的总上清液 (50 µL) 来准备输入样本。在上清液中加入 17 µL含有 10% 2-巯基乙醇的 4 × Laemmli 样品缓冲液。在 95°C 下煮沸 10 分钟。储存在-20 °C，直到用作输入样品。
9. 用抗 HA 抗体在 4°C 下过夜孵育剩余 19/20 的总上清液（950 μL）。
10. 第二天，用冷 PBS 预洗 Protein A/G PLUS-Agarose 珠子两次，然后用冷 RIPA 裂解缓冲液预洗一次。
11. 将 20 μL 的预洗蛋白 A/G PLUS-琼脂糖珠加入上清液中，在 4°C 下进一步孵育 2 小时。
12. 在 RIPA 裂解缓冲液中洗涤蛋白结合的 Protein A/G PLUS-Agarose 珠子四次。每次洗涤时，将 1 mL 的 RIPA 裂解缓冲液添加到珠子中，充分混合，然后孵育 2 分钟。在 2,000 × g 、4 °C 下离心 2 分钟，弃去上清液。
13. 准备免疫沉淀 (IP) 样品。最后一次洗涤后，将 75 µL 缓冲液留在 Eppendorf 管中，并向珠子中加入 25 µL 含有 10% 2-巯基乙醇的 4 × Laemmli 样品缓冲液。在 95°C 下煮沸 10 分钟。储存在 -20 °C，直到用作 IP 样品。

C. 6 M 胍变性条件下的泛素化测定
1. 轻轻吸出培养基，并在细胞收获前立即用冷 PBS 冲洗细胞 3 次。
2. 使用 1 mL 的冷 PBS 收集细胞。将 PBS 中的细胞移取数次，直到它们从培养皿中分离出来，然后将它们移入 Eppendorf 管中。
3. 将细胞分成两个 Eppendorf 管，一个管中总细胞的 1/20，另一管中剩余的 19/20。
4. 在 1,500 × g 、4 °C 下离心 3 分钟以收集细胞的两个单独部分。丢弃上清液。
5. 准备输入样本。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 50 μL RIPA 裂解缓冲液中裂解 1/20 的细胞。在冰上孵育 20 分钟。 4°C 16,000 × g离心15 分钟，收集上清液。在上清液中加入 17 µL含有 10% 2-巯基乙醇的 4 × Laemmli 样品缓冲液。在 95°C 下煮沸 10 分钟。储存在-20 °C，直到用作输入样品。
6. 使用含有 6 M 胍、10 mM NEM、蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 1 mL 缓冲液 A 裂解剩余的 19/20 总细胞（参见配方）。
7. 在 3s ON/7s OFF 时用超声波细胞破碎器进行声波处理，振幅为 30%，直到溶液清澈。
8. 16,000 × g离心15 分钟，收集上清液。
9. 在离心过程中，用缓冲液 A 预洗镍-次氮基三乙酸 (Ni-NTA) 珠子 3 次。
10. 在上清液中加入 20 μL 的预洗 Ni-NTA 珠子，并在 RT 处轻轻旋转孵育 3 小时。
11. 使用缓冲液 A、缓冲液 B 和缓冲液 TI 清洗蛋白质结合的 Ni-NTA 珠子，如下所示。每次洗涤时，向珠子中加入 1 mL 缓冲液，充分混合，孵育 2 分钟，以 2,000 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。
12. 在缓冲液 A 中清洗珠子一次（参见配方）。
13. 在缓冲液 B 中清洗磁珠两次（参见配方）。
14. 在 TI 缓冲液中清洗磁珠两次（参见配方）。
15. 准备下拉 (PD) 示例。最后一次洗涤后，在 Eppendorf 管中留下 75 µL 缓冲液 TI，并向珠子中加入 25 µL 含有 10% 2-巯基乙醇的 4 × Laemmli 样品缓冲液。在 95°C 下煮沸 10 分钟。储存在-20°C，直到用作 PD 样品。

从 B 或C制备样品后，执行以下检测和分析程序。

D. 通过蛋白质印迹 (WB) 进行泛素化分析
1. 设置8% SDS-PAGE 凝胶。
2. 将 SDS-PAGE 凝胶组装到 SDS-PAGE 电泳室中。
3. 用 WB Running Buffer 填充腔室（参见配方）。
4. 将 1 μg 蛋白质阶梯和 30 μg 输入或 IP/PD 样品加载到浓缩胶的孔中。
5. V的分辨凝胶中运行约 120 分钟，以更好地分离蛋白质。
6. 用甲醇冲洗 PVDF 膜 15 秒以进行活化。使用恒定的 300 mA 在 4 °C 下将凝胶转移到 WB Transfer Buffer（参见配方）中的活化膜上 120 分钟。
7. 在 WB Blocking Buffer（参见配方）中封闭转移的膜，在室温下轻轻摇晃1 小时。
8. 在 WB Blocking Buffer（参见配方）中以指定的稀释度稀释一抗。用初级抗体孵育膜，在 4°C 下轻轻摇动过夜。
9. 第二天，在 WB 洗涤缓冲液（参见配方，TBST 缓冲液）中以 RT 5 × 10 分钟洗涤膜。
10. 在 WB Blocking Buffer 中以 1:5,000 稀释度稀释 HRP 偶联的二抗。用二级抗体孵育膜，在 RT 处轻轻摇动 1 小时。
11. 在 WB 洗涤缓冲液（TBST 缓冲液）中以 RT 5 × 10 分钟洗涤膜。
12. SuperSignal West Femto最大灵敏度底物套件中的溶液 A 和 B 以 1:1混合，并使用混合溶液覆盖膜。孵育适当的时间以产生化学发光信号。
13. ChemiDoc MP 成像系统执行图像采集。
14. 使用 ImageJ 编辑凝胶图像，并呈现结果。

数据分析

1. 这是一个具有代表性的结果，显示了 Vangl2 在 2% SDS 变性条件下的泛素化（图 1）。

图 1. 2% SDS 变性条件下 Vangl2 泛素化的检测。
HEK293T 细胞用 HA-Vangl2 质粒转染 48 小时，并在细胞收获前用蛋白酶体抑制剂 MG132 (10 µM) 或溶酶体抑制剂氯喹 (CQ, 25 µM ) 处理 4 小时。在 2% SDS 变性条件下，HA 抗体偶联蛋白 A/G 琼脂糖珠用于 HA-Vangl2 及其共价结合的内源性泛素的免疫沉淀 (IP)。来自输入和 IP 样品的 HA-Vangl2 和内源性泛素用指定的抗体进行免疫印迹。通过总泛素 FK2 抗体检查内源性泛素。 GAPDH 用作加载控制。 HA IP 部分中的 55kDa 条带表示 IgG 重链。这个结果来自冯等。（2021 年）。

2. 这是一个具有代表性的结果，显示了在 6 M 胍变性条件下 Vangl2 的泛素化（图 2）。

图 2. 在 6 M 胍变性条件下检测 Vangl2 泛素化。
HEK293T 细胞用 HA-Vangl2 和/或 His-泛素 (His- Ub ) 质粒转染 48 小时，并在细胞收获前用蛋白酶体抑制剂 MG132 (10 µM) 处理 4 小时。 Ni-NTA 珠用于在 6 M 胍变性条件下拉下 His-泛素及其共价结合蛋白。来自输入和下拉样本的 HA-Vangl2 和 His-泛素通过指定的抗体进行免疫印迹。 GAPDH 用作加载控制。最左边的下拉样本中的波段应该是背景。这个结果来自冯等。（2021 年）。

第二部分：用于Vangl2 磷酸化测定

程序

HEK293T细胞是蛋白质泛素化研究常用的细胞系，在我们的研究中很容易检测到Vangl2泛素化。根据我们的实验经验，Wnt5a/CK1 可以在 CHO 细胞中诱导比在 293 细胞中更强烈的Vangl蛋白磷酸化（在 CHO 细胞中带移更显着），因此我们从 293 细胞切换到 CHO 细胞以更好地证明Vangl磷酸化测定。为了分析 Vangl2 的磷酸化，我们用表达 Wnt5a/Ror2 或 CK1 δ 的质粒转染 CHO 细胞，以诱导 Vangl2 磷酸化（Feng 等人，2021；高等人，2011；杨等人， 2017）。使用 HA 和 Vangl2 磷酸化特异性抗体通过蛋白质印迹分析检测磷酸化。细胞培养、转染、收获、样品制备和蛋白质印迹分析的程序与泛素化测定中的相似。

°C和 5% CO 2的潮湿培养箱中保持在 DMEM 完全培养基（添加 10% FBS 和 1% PS 的 DMEM）中。
1. 在直径为 100 mm 的培养皿中培养 CHO 细胞，直到 90% 融合。
2. 以 1:30 的比例将细胞传递到 12 孔细胞培养板中。
3. 在 37°C、5% CO 2下孵育细胞约 20 小时，直至 50%–70% 汇合。
4. 在转染前 4 小时更换 1 mL 的新鲜培养基。
5. 用表达 HA-Vangl2 和/或 FLAG-Wnt5a/Ror2 和 M yc-CK1 δ 的质粒转染细胞，以 1:4 (µg DNA: µg PEI) 的比例使用 1 mg/mL PEI。对于 12 孔培养板的每个孔，总共转染 1 µg 质粒（0.5 µg HA-Vangl2 + 0.5 µg 空载体、0.5 µg HA-Vangl2 + 0.5 µg FLAG-Wnt5a/Ror2 或 0.5 µg HA-Vangl2 + 0.5 µg M yc- CK1 δ )。
6. 将细胞孵育 12 小时。
7. 转染后 12 小时更换为 1 mL 新鲜培养基。
8. 培养转染细胞48 小时。
9. 轻轻吸出培养基，并在细胞收获前立即用冷 PBS 冲洗细胞 3 次。
10. 收集细胞如下：使用胰蛋白酶分离细胞，并使用 DMEM 完全培养基灭活胰蛋白酶。将细胞移入 Eppendorf 管中进行离心，并使用 200 μL 的冷 PBS 重新悬浮细胞颗粒。
11. 在 1,500 × g 、4 °C 下离心 3 分钟，以收集细胞。丢弃上清液。
12. 准备用于蛋白质印迹的样品。裂解含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 75 μL RIPA 裂解缓冲液中的细胞。在冰上孵育 20 分钟。 4°C 16,000 × g离心15 分钟，收集上清液。在上清液中加入 25 µL含有 10% 2-巯基乙醇的 4 × Laemmli 样品缓冲液。在 95°C 下煮沸 10 分钟。储存在-20°C，直到使用。
13. 通过蛋白质印迹检测和分析 Vangl2 的磷酸化。在 120 V 下运行 8% Tris/Bis SDS-PAGE 凝胶约 2 小时，直到 55 kDa标记带运行到凝胶底部。
14. 使用 HA 和 Vangl2 磷酸特异性抗体进行检测。

数据分析

这是一个具有代表性的结果，表明 Wnt5a/Ror2 和 CK1 δ显着促进磷酸化，尤其是 Vangl2 的过度磷酸化（图 3）。

图 3. Vangl2 磷酸化的检测。
Wnt5a/Ror2 和 CK1δ 在很大程度上促进 HA-Vangl2 的磷酸化。在细胞收获前，用 HA-Vangl2 转染 CHO 细胞和/或用 FLAG-Wnt5a/Ror2 和 Myc-CK1δ 质粒共转染 48 小时，在存在或不存在 CK1 抑制剂 D4476 (100 μM ) 的情况下持续 6 小时。通过指定的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。为了检测 Vangl2 的磷酸化，使用 HA 和两种位点特异性磷酸化 Vangl2 抗体（p-T78/S79/S82 和 p-S79/S82/S84）。肌动蛋白用作加载控制。下黑色、中蓝色和上红色箭头分别表示未磷酸化、基础磷酸化和过度磷酸化的 Vangl2。

食谱_

1. 磷酸盐缓冲液 (PBS)
试剂专注
氯化钠 137 毫米
氯化钾 2.7 毫米
Na 2 HPO 4 10毫米
KH 2 PO 4 1.8 毫米
将 pH 值调节至 7.4。

2. RIPA 裂解缓冲液
试剂专注
Tris [pH 7.4] 50毫米
氯化钠 150 毫米
伊格帕尔 CA-630 1% (v/v)
脱氧胆酸 0.25% (v/v)
安全数据表 0.1% (m/v)
对于细胞裂解，添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（终浓度 1 × ）使用前。

3. 缓冲器 A
试剂专注
胍 6M
Na 2 HPO 4 /NaH 2 PO 4 0.1M
咪唑 10毫米
2 HPO 4 /NaH 2 PO 4缓冲液（混合 93.2 mL 的 1 M Na 2 HPO 4和 6.8 mL 的 1 M NaH 2 PO 4 ），将 pH 值调节至 8.0 。
对于泛素化测定前的细胞裂解，在使用前立即添加去泛素酶抑制剂 NEM (10 mM)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（最终浓度 1 × ）。

4. 缓冲 TI
试剂专注
特里斯 25毫米
咪唑 20毫米
将 pH 值调节至 6.8。

5. 缓冲器 B
Buffer A: Buffer TI 的混合物，体积比为 1:3。

6. 8% Tris/Bis SDS-PAGE 凝胶
8% Tris/Bis SDS-PAGE 凝胶包含下层分离胶 (8%) 和上层浓缩胶 (5%)。

7. 8%分离凝胶
试剂每 10 mL 分离凝胶的体积 (mL)
H 2 O 4.6
30% 丙烯酰胺/双溶液 29:1 2.7
1.5 M Tris (pH 8.8) 2.5
10% SDS 0.1
10% APS 0.1
TEMED 0.006

8. 5% 堆积凝胶
试剂每 2 mL 浓缩胶的体积 (mL)
H 2 O 1.4
30% 丙烯酰胺/双溶液 29:1 0.33
1.0 M Tris (pH 6.8) 0.25
10% SDS 0.02
10% APS 0.02
TEMED 0.002

9. WB 运行缓冲液
试剂专注
Tris-HCl [pH 7.6] 25毫米
甘氨酸 192 毫米
安全数据表 0.1% (m/v)

10. WB 传输缓冲器
试剂专注
Tris-HCl [pH 7.6] 25毫米
甘氨酸 192 毫米
甲醇 10% (v/v)

11. WB 封闭缓冲液（TBST 缓冲液中的 5% BSA）
试剂专注
特里斯 19毫米
氯化钠 137 毫米
氯化钾 2.7 毫米
吐温-20 0.1% (v/v)
牛血清白蛋白 5% (m/v)

12. WB 洗涤缓冲液（TBST 缓冲液）
试剂专注
特里斯 19毫米
氯化钠 137 毫米
氯化钾 2.7 毫米
吐温-20 0.1% (v/v)

致谢

资金：本研究得到香港研究资助局 (ECS_27115317)、(GRF_17122119) 和 (GRF_17118120) 对 BG 的资助，以及国家自然科学基金 (一般项目_31771561 和 32170711) 对 BG 的资助我们感谢我们的原创该协议源自的研究论文：Feng 等人。（2021），高等人。（2011）和杨等人。（2017 年）。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

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