材料和试剂
细胞
金黄色葡萄球菌RN6390 菌株 ( Khusainov et al., 2016)

70S核糖体纯化
1. 聚碳酸酯50 mL离心管（ Nalgene TM ，目录号： 3117-0500）
2. 开顶薄壁超透明管，38.5 mL（Beckman Coulter，目录号：344058）
3. 血琼脂板（BD TM Columbia 琼脂，含 5% 羊血，目录号：PA-254005.06）
4. 脑心浸液肉汤（BHI，Sigma-Aldrich，目录号：53286）
5. 溶葡萄球菌素（Sigma-Aldrich，目录号：L7386）
6. DNase I（Roche，目录号： 4716728001 ）
7. 不含乙二胺四乙酸（ EDTA， Thermo Scientific TM ，目录号：78429）
8. 30% PEG 20000（汉普顿研究公司， HR2-609 ）
9. 缓冲区 A（见配方）
10. 缓冲液 B（见配方）
11. 5 ×缓冲液 E（见配方）
12. 解离缓冲液（见配方）

30S亚基纯化
1. 开顶薄壁超透明管，13.2 mL（Beckman Coulter，目录号：344059）
2. Amicon ultra-15 离心过滤机组（默克密理博，目录号： UFC910008 ）
3. 液氮
4. 30S 存储缓冲区（见配方）

mRNA纯化
1. RNaseZap (热 Scientific TM ，目录号： AM9780）
2. NucleoSpin Plasmid，用于质粒 DNA 的迷你试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号：740588.50）
3. NucleoSpin Gel and PCR Clean - up，用于凝胶提取和 PCR 清理的迷你试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号：740609.50）
4. 巴姆嗨酶（NEB，目录号：R0136S）
5. CutSmart ®缓冲器（NEB，目录号：B7204S）
6. 具有DNase turbo的MEGAscript试剂盒（ Ambion ，目录号：AM1333）
7. ROTI ®苯酚/氯仿/异戊醇，250 mL，pH 7.5 – 8.0（Carl Roth，目录号：A156.1）
8. ROTI ® Aqua-P/C/I，250 mL，pH 4.5 – 5.0（Carl Roth，目录号：X985.1）
9. 3 M 醋酸钠
10. 缓冲 ELU （见配方）

30S 和 mRNA 质量分析
1. PageRuler TM蛋白质阶梯（ Thermo Scientific TM ，目录号：26616 和 26619 ）
2. InstantBlue® _ 考马斯亮蓝蛋白染色剂（Abcam，目录号：ab119211）
3. ROTI ®水酚，250 mL， pH 4.5 – 5.0（Carl Roth，目录号：A980.1）
4. 氯仿（热 Scientific TM ，目录号：AC158210010 ）
5. 琼脂糖（ SeaKem TM ，目录号：11590717）
6. 1 M硫氰酸钾（Sigma，目录号： P3011）
7. 溴化乙锭（热 Scientific TM ，目录号：15585011）
8. 100％甲酰胺（Sigma，目录号：F9037）
9. RiboRuler低范围 RNA 梯（ Thermo Scientific TM ，目录号：SM1831 ）
10. 4% 浓缩凝胶（见配方）
11. 15% 分离凝胶（见配方）
12. 4 ×蓝色缓冲液（见配方）
13. 10 ×运行缓冲液（见配方）
14. 6% 聚丙烯酰胺凝胶（见配方）
15. 10 × TBE （见配方）

足印测定
1. 10 μM脚趾底漆（5' CCTGCAGGTCGACTC 3'）
2. 10 × PNK 缓冲液（ Thermo Scientific TM ，目录号：EK 0032 ）
3. 10 U/ μL T4 PNK（热 Scientific TM ，目录号：EK 0032 ）
4. [ γ- 32 P]-ATP (370 MBq/mL, 10 mCi /mL, 185 MBq)
5. 微型生物自旋色谱柱（Bio-Rad，目录号：732-6200）
6. 20 U / μL AMV逆转录酶，分离自禽成髓细胞瘤病毒（ QBIOgene ，目录号：EMAMV200 ）
7. 10 × AMV缓冲液（ QBIOgene ，目录号：EMAMV200）
8. 10 mM dATP 、 dCTP 、 dGTP和 dTTP（Roche，目录号：11051440001、11051458001、11051466001 和 11051482001）
9. 0.3 M醋酸钠（Sigma，目录号：S2889）
10. 苯酚/氯仿， pH 4.5 - 5.0（Carl Roth，目录号：X985.1）
11. 氯仿/异戊醇（Carl Roth，目录号：X984.1）
12. 100% 冷乙醇
13. 80% 冷乙醇
14. 8 M尿素（ Sigma，目录号：U5128）
15. 0.1％溴酚蓝（ Sigma，目录号：B0126）
16. 0.1％二甲苯氰（ Sigma，目录号：X4126）
17. 100 µM ddATP 、 ddGTP 、 ddCTP和ddTTP （ Roche，目录号：3732738001 ）
18. 3 M KOH（ Sigma，目录号：221473）
19. 1 M tris-HCl，pH 8.0（ Sigma，目录号：T1503）
20. 10% SDS（ Bio-Rad，目录号：1610416）
21. 乙酸（ Sigma，目录号：A6283）
22. 10 × toeprinting缓冲区（见配方）

用于冷冻电镜的 30S-mRNA 复合物制备
1. 液体乙烷
2. 液氮
3. Quantifoil R2/2300 网孔碳网格

注意：所有缓冲液均在前一天制备并储存在 4 ° C 。

设备

70S核糖体纯化
1. 2升烧瓶
2. 微生物培养箱（ Thermo Scientific TM ，目录号：50125882 或等效）
3. 30 °C的细胞培养摇床
4. II级生物安全柜
5. 落地式离心机（Beckman、Avant J20 XP 和/或 Avanti JE 或同等产品）
6. JA-25.50 转子（Beckman，目录号：363055）
7. JLA-16.250转子（贝克曼，目录号：363930）
8. 超速离心机（Beckman、OPTIMA XE90 或同等产品）
9. 45型钛转子（贝克曼，目录号：339160）
10. SW28 转子（ Beckman ，目录号：342204）
11. Gradient Master TM基本单元（ Biocomp ，目录号：B108-2）
12. Gradient Master TM设备（ BioComp Instruments，Fredericton，加拿大）
13. 馏分收集器（Bio-Rad， 2110 型）
14. NanoDrop ND-1000 分光光度计（ Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 或同等产品）

30S亚基纯化
1. 超速离心机（Beckman、OPTIMA XE90 或同等产品）
2. SW41 Ti摆桶转子（Beckman，目录号：331362）
3. 落地式离心机（Beckman、Avanti JE 或同等产品）
4. JLA-16.250转子（贝克曼，目录号：363930）

mRNA纯化
1. 37 °C的细胞培养振荡器
2. 台式离心机（Eppendorf MiniSpin ® Plus 个人微型离心机，配备 12 位转子或同等产品）
3. Eppendorf Thermomixer R，干式加热和冷却摇床或同等产品

30S 和 mRNA 质量分析
1. Mini-PROTEAN ® Tetra Handcast系统（Bio-Rad 或同等产品）
2. PowerPac TM基本电源（Bio-Rad 或同等产品）
3. 宽迷你子电池 GT 电池（Bio-Rad 或同等产品）
4. GelDoc Go 凝胶成像系统 (Bio-Rad)

足印测定
1. 台式离心机（Eppendorf MiniSpin ® Plus 个人微型离心机，配备 12 位转子或同等产品）
2. 磷光成像或放射自显影（台风或同等产品）

30S–mRNA 复合物制备冷冻电镜数据采集
1. Thermo Scientific Vitrobot Mark IV
2. Talos Arctica 配备 Falcon III 直接电子探测器 ( Thermo Fisher)
3. 装有 EPU 软件的显微镜控制 PC

软件

1. MotionCor2 ( https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software/ )
2. 文件格式（ https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/locally-develop-software/zhang-software/ ）
3. Relion 3.0 ( https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page/ )
4. 资源地图 ( http://resmap.sourceforge.net/ )
5. 嵌合体（ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ）

程序

A. 70S核糖体纯化
1. 琼脂板上划出金黄色葡萄球菌的RN6390 细胞，并在 37 °C 下生长20 小时。
2. 在 250 mL 烧瓶中的 50 mL 无菌 BHI 培养基中接种单个菌落，并在 37 °C和 180 rpm 下生长 17 小时。
3. 将 5 mL 的过夜培养物添加到四个 2 L 烧瓶中，每个烧瓶中都装有 500 mL 的无菌 BHI 培养基，并在 37 °C和 180 rpm 下生长 3 小时，直到 OD 600 = 1。
4. °C 下以 4,400 × g离心15 分钟来收获细胞。
5. 将颗粒重新悬浮在 50 mL 的缓冲液 A 中。
6. 通过在 4,400 下离心收集颗粒 × g 15 分钟。
7. 重复前面的步骤 (5 – 6) 两次。
8. 称量细胞并保持在-80 °C 。
注意：典型的产量是 2 L 培养物中的 2.8 g 细胞。
9. 将细胞 (2.8 g) 在冰上解冻 15 – 20 分钟，然后重悬于 6.25 mL 缓冲液 A 中，并添加 0.7 mg 溶葡萄球菌素、1 ×蛋白酶抑制剂混合物、1 mM EDTA pH 7.5 和 6 µl DNase I/1 克细胞重量。在 37 °C 下孵育 1 小时。
10. °C下以 21,500 × g （JA-25.50 转子）旋转裂解液 90 分钟。
11. 将收集的上清液中的 PEG20K 浓度调整为 2.8%，并在搅拌下将反应置于冰上 5 分钟。
12. × g离心5 分钟（JA-25.50 转子）收集上清液。
13. 将 PEG20K 浓度增加到 4.2%，然后在搅拌下将反应置于冰上 10 分钟。
14. × g离心10 分钟（JA-25.50 转子）收集上清液。
15. 用 1 mM EDTA 将每个颗粒重新悬浮在 17.5 mL 缓冲液 A 中，放在 25 mL 蔗糖垫（缓冲液 B）上，并在 4 °C （45 型Ti转子）下以 235,000 × g旋转17 小时。
16. 用 5 mL 的缓冲液 E 冲洗每个管的壁，以去除多余的蔗糖，并将颗粒重新悬浮在 1 mL 的缓冲液 E 中。
17. 将获得的样品放在 12 个 7% – 30% 蔗糖梯度上并以 83,000 × g旋转 16.5 小时（SW28 转子）。
18. 分馏蔗糖梯度（图 1A - I），池分数为 70S，并将醋酸镁调整为 25 mM，将 PEG20K 调整为 4.5%。在搅拌下置于冰上 10 分钟。
19. 以 20,000 × g离心沉淀核糖体 13 分钟（JA-25.50 转子）（ Khusainov等人，2016 年）。
20. 用解离缓冲液清洗管壁，以去除多余的蔗糖和 PEG。将颗粒重新悬浮在 1.5 mL 的解离缓冲液中。
注意：通常产量为 14 mg 的 70S，纯度至少为 95%。
21. 通过 15% 聚丙烯酰胺凝胶（图 1A-II）和质谱分析（图 1A-III）检查 70S 的纯度。

B. 30S亚基纯化
1. 将 14 mg 的 70S 直接加载到在同一缓冲液中平衡的0% – 30% 蔗糖梯度上的解离缓冲液中，并以 109,000 转速旋转 × g 14.5 小时（SW28 转子）。
2. 将蔗糖梯度 (图 1B-I) 分馏, 并将汇集分数的醋酸镁调整为 10 mM, 将亚精胺调整为 2.5 mM。
3. Amicon超离心过滤器中将 30S 样品浓缩至 2–3 mg/mL 。
注意：通过平行使用两个过滤器，浓缩样品需要 1 小时。
4. 制作等分试样，在液氮中快速冷冻，并储存在 -80 °C 。
注意：等分试样的体积不应小于 3 μL ，以防止样品蒸发。而且，等分试样的大小应该很小（3 – 5 μ L ），因为后续实验不需要大量样品。

图 1. 30S 核糖体亚基纯化。
30S ( B ) 是从 70S ( A ) 通过蔗糖梯度运行两次（I 和 IV，35 mL 是蔗糖梯度的总体积）获得的。粗蓝线代表用于进一步实验的分数。在 SDS-PAGE 上运行 70S 和 30S 级分以检查样品（II 和 V）的纯度。 70S 核糖体被送至质谱分析以评估样品纯度 (III)。通过苯酚/氯仿萃取从 30S 中获得 16S，并在变性条件下在琼脂糖凝胶上电泳以代表其完整性 (VI)。

C. spa mRNA纯化
本研究中使用的质粒先前在 Benito 等人中进行了描述。 (2000) 和Huntzinger等人。（2005 年）。 pUT7 质粒含有一个 T7 启动子，用于 T7体外转录和氨苄青霉素抗性。具有强 Shine-Dalgarno AGGGGG（下划线）和 UUG 起始密码子（粗体）的spa mRNA 序列如下所示：
ACAAAUAACAUAC AGGGGG UAUUAAU UUG AAAAAAGAAAAACAUUUAUUCAAUUCGUAAACUAGGUGUAGGUAUUGCAUCUGUAACUUUAGGUACAUUACUUAUAUCUGGUGGCGUAACACCUGCUGCAAAUGCUGCGCAACACGAUGAAGCUCAACAAAAUGCUUUUUAUCAAGUCUUAAAUGCCUAACUUAAACGCUGGGAUCCUAGAGUCGACCUGCAGG

注意：在开始处理 mRNA 之前，用去除 RNase 污染的液体（例如RNaseZap ）擦拭工作台和移液器。
1. 用 pUT7- spa质粒转化 XL1大肠杆菌细胞。
2. 在 250 mL 的 LB 培养基中生长细胞，其中 100 μg /mL 氨苄青霉素在 37 °C 16 小时。
3. 使用NucleoSpin Plasmid mini 试剂盒纯化质粒，并在 37 °C 下用BamHI酶在 1 × CutSmart 缓冲液中将其线性化（每次反应最多 50 μg质粒）2 小时。
注意：通常的产量是每次反应10 μg质粒。一个线性化反应足以进行实验。
4. 使用NucleoSpin凝胶和 PCR 清洁迷你试剂盒从 1% 琼脂糖凝胶中提取线性化质粒 DNA。
5. 用苯酚/氯仿提取 DNA：
• 加入等体积的苯酚，充分涡旋，并在17 , 000下离心 × g 1 分钟。保持上相。
• 加入等体积的氯仿，充分涡旋，并在17 , 000下离心 × g 1 分钟。保持上相。
6. 用 2.5 体积的 100% 冷乙醇和 1/16 体积的 3 M 醋酸钠沉淀 DNA。
7. μL的 80% 冷乙醇清洗颗粒。
8. 使用MEGAscript试剂盒在 37 °C 下体外转录 mRNA 3 小时。
9. /μL DNase turbo停止反应，并在 37 °C下孵育 15 分钟。
10. 用苯酚/氯仿提取 mRNA，用 100% 冷乙醇沉淀（类似于步骤 5 和 6）。
11. μL的 80% 冷乙醇清洗颗粒。
12. 向样品中加入 50% 甲酰胺并在 90 ℃加热 3 分钟摄氏度。
13. 用 6% 聚丙烯酰胺中型凝胶分离 mRNA，并在 4 °C 下用缓冲液 ELU 洗脱 16 小时。
14. 用苯酚/氯仿提取 mRNA，用 100% 冷乙醇沉淀（类似于步骤 5 和 6）。
15. μL的 80% 冷乙醇清洗颗粒。
16. 重悬于 10 – 30 μL MQ水。
17. 将等分试样储存在 -20 摄氏度。

E. 30S 和 mRNA 质量分析
在 15% 聚丙烯酰胺凝胶上检测到高分子量非核糖体蛋白的缺失和所有核糖体蛋白的存在（图 1B-V）。 SDS-PAGE 上所有 70S 核糖体蛋白的位置在Khusainov中确定等。 (2016) (图 1A-II)。核糖体 RNA 的完整性由 0.8% 琼脂糖凝胶在变性条件下进行检查（图 1B-VI）。
1. 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶
a. 混合 15% 分离凝胶的所有缓冲液成分，然后置于聚合酶中 15–20 分钟。
b. 对 4% 浓缩胶重复相同的步骤。
c. 将 1 ×蓝色缓冲液添加到 30S 样品中（每泳道 0.15 OD）并在 95 下加热 3 分钟摄氏度。
d. 加载 5 μL的蛋白质梯和 5 μL的 30S 样品。
e. 的 1 ×运行缓冲液中运行凝胶 30 分钟，然后在 150 V 运行 1 小时。
f. InstantBlue ®中染色凝胶考马斯 20 分钟并在水中脱色1 小时。
2. 提取核糖体 RNA
a. 中加入等体积的苯酚，涡旋混匀，然后在 17 , 000下离心 × g 1 分钟。
b. 在上相中加入等体积的氯仿，涡旋充分混合，然后在 17 , 000下离心 × g 1 分钟。
c. 重复最后两个步骤。
d. 用 1/10 体积的 3 M 醋酸钠 pH 5.3 和 2.5 体积的 100% 冷乙醇沉淀核糖体 RNA。
e. 将样品保持在 -20 过夜 °C或 -80 下 1 小时 °C并在 17 , 000降速 ×克 4点15分钟摄氏度。
f. 用 70% 冷乙醇清洗沉淀，并在高速真空中干燥 5 分钟。
g. 将获得的样品重新悬浮在 10 μL的mQ水中。
3. RNA琼脂糖凝胶
a. 中将 0.8% 琼脂糖溶解在 1 × TBE 缓冲液中，然后冷却至 60 摄氏度。
b. 在混合物中加入 100 mM 硫氰酸钾和溴化乙锭。
c. 将凝胶放置 40 分钟以进行聚合酶。
d. 将 0.015 OD 的样品与高范围 RNA 梯一起加载到凝胶上。
e. 在 120 V的 1 × TBE 缓冲液中运行凝胶 45 分钟。
4. RNA聚丙烯酰胺凝胶
用溴化乙锭染色的 6% 聚丙烯酰胺凝胶检查 mRNA 纯度和完整性（图 2C ）。 spa mRNA的序列如图2D所示。
a. 将 6% 聚丙烯酰胺凝胶的所有组分混合，然后聚合15-20分钟。
b. 在 90 度预热的 50% 甲酰胺中，在接近 100 ng mRNA 的1 × RNA 上样染料中上样 4 μL低范围 RNA 梯 °C 2 分钟。
c. 运行凝胶在 200 V 下 30 分钟。
d. 将凝胶在溴化乙锭中染色 10 分钟。

F. 足印测定
1. 混合 1 μ M Toe 引物、10 U/ μL T4 PNK 和 5 μL [ γ - 32 P]-ATP，37 °C孵育1 h，然后通过 micro bio-spin column pre -在mQ水中平衡。
2. 在 90 的 toeprinting 缓冲液中孵育 0.5 μ M的spa mRNA 和 169,916 cpm / μ L Toe 引物 °C 1 分钟，置于冰上 1 分钟，然后加入 MgCl 2至 10 mM 最终浓度。在 20 处进行重折叠/退火 °C 15 分钟。反应混合物的最终体积为 20 μL 。
3. 将 33,983 cpm / μ L的 mRNA-Toe 引物与 0.025 μ M 、0.05 μ M和 0.2 μ M 30S 小核糖体亚基混合。 37岁孵化 °C 10 分钟，0.1 μ M itRNA额外 5 分钟（最终 MgCl 2浓度应为 8 mM）。反应混合物的最终体积为 13 μL 。
4. 将获得的样品与 0.3 U/ μL AMV逆转录酶和 0.3 mM dNTPs 在 AMV 缓冲液中孵育 30 分钟，温度为 37 ℃ ，用苯酚/氯仿萃取，重悬于尿素蓝缓冲液中。
5. 对于测序通道，将 0.33 μ M mRNA 与 135,932 cpm / μ L Toe 引物、1.7 μ M核苷酸和 0.27 U/ μ L AMV 逆转录酶在 AMV 缓冲液中孵育，温度为 37 °C 30 分钟。
6. 将 237 mM KOH、26 mM tris-HCl pH 8、0.26 % SDS 和 3.9 mM EDTA 添加到测序通道的样品中，并在 90 下孵育 °C 3 分钟，37 °C 1 小时。在 0.3 M 醋酸钠和 100% 冷乙醇中沉淀 RNA，并在尿素蓝缓冲液中重悬。
7. 在 10%、40 厘米、0.5 毫米变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移两个样品。
8. 放射自显影获取数据（图 2A 和 2B）。

图 2。 30S-mRNA-itRNA复合物的足印分析
（一）足印测定方案。（ B ）随着 30S 浓度的增加，30S-mRNA-itRNA 复合物形成的 Toeprint分析。（ C ）变性条件下聚丙烯酰胺凝胶检测mRNA的完整性。 (D) spa mRNA序列，起始密码子以粗体显示，Shine-Dalgarno 序列加下划线； +16 核苷酸由黑色箭头显示。

F. 用于冷冻电镜的 30S-mRNA 复合物制备
1. 450 nM的spa mRNA 与 90 nM的 30S 混合在存储缓冲液中，立即应用到Quantifoil R2/2300 目多孔碳冷冻电镜网格上，并使用 Vitrobot Mark IV设备（4 °C和 100% 湿度）在以下条件下：网格上 4 μL复合物，3 s 印迹时间，5 印迹力和 30 s 等待时间。
2. 如果您打算使用配备 Autoloader 的显微镜，请将网格夹入墨盒中。
3. 保持在液氮中，直到数据采集。

G. 数据采集和分析
1. 在 200 kV Talos Arctica 仪器上收集数据，该仪器配备 Falcon III 直接电子探测器，聚焦范围为 -0.5 至 -2.7 μ m ，步长为 0.2。
注意：出于我们的目的，使用了 120,000倍的放大倍率，得到的像素大小为 1.24 Å。
2. 将获取的数据传输到工作站或集群进行数据处理。
3. 使用 RELION 3.0 软件进行数据处理( Zivanov et al., 2018) 。
4. 使用 MotionCor2 执行漂移和增益校正以及剂量加权（Zheng 等人，2017）。
5. 使用整个堆栈的剂量加权平均图像，通过软件Gctf确定对比度传递函数（张等人，2016）。
6. 使用高斯函数的拉普拉斯算子选择粒子（最小直径 180 Å，最大直径 290 Å）。
7. 提取框大小为 270 像素的粒子，并分成几类进行 3D 分类。
8. 合并类（如有必要），提取原始大小，然后继续进行 3D 细化。
获得的 30S-mRNA 结构已被细化到 3.6 Å 的整体分辨率，头部和身体的单独集中细化导致分辨率分别为 3.6 和 3.4 Å（图 3B 和 3C）。
9. 估计 RELION 3.0 中的本地分辨率（ Zivanov等人，2018 年）。
10. 分析 Chimera 中的结构（Pettersen 等人，2004 年）或ChimeraX （Goddard 等人，2018 年）（图 3A）。

图 3. 低温电磁数据处理方案。
电子电影是从 Talos 显微镜上的样品收集中获得的。在运动校正和对比度传递函数 (CTF) 估计之后，挑选并提取最小直径为 180埃和最大直径为 290 埃的粒子。接下来的步骤是 2D 和 3D 分类，然后是 3D 细化和后处理。最终的 30S-mRNA 结构在 3.6 Å 处获得，头部和身体的焦点细化分别为 3.4 和 3.6 Å。

食谱

70S核糖体纯化
3. 缓冲器 A
100 毫米 NH 4氯
21 mM 醋酸镁
20 mM HEPES-KOH，pH 7.5
1 mM二硫苏糖醇 (DTT)
3. 缓冲器 B
1.05 M 蔗糖
0.5 M氯化钾
10.5 mM 醋酸镁
0.5 毫米乙二胺四乙酸
20 mM HEPES-KOH，pH 7.5
1 毫米 DTT
3. 5 ×缓冲器 E
500 毫米氯化钾
50 mM 醋酸镁
2.5 毫米乙二胺四乙酸
50 mM HEPES-KOH，pH 7.5
5 毫米 DTT
3. 解离缓冲液
1 mM 醋酸镁
30 毫米 NH 4氯
10 mM HEPES-KOH，pH 7.5
1 毫米 DTT

30S亚基纯化
1. 30S存储缓冲
10 mM 醋酸镁
30 毫米 NH 4氯
10 mM HEPES-KOH，pH 7.5
1 毫米 DTT
2.5 mM 亚精胺

mRNA纯化
1. 缓冲 ELU
16% (v/v) 苯酚 pH 4.5 – 5.0
50 mM 醋酸铵
1 mM EDTA，pH 8.0

30S 和 mRNA 质量分析
1. 4% 浓缩凝胶
4% (v/v) ROTIPHORESE ® NF-丙烯酰胺/双溶液 30 (37.5:1)
125 mM tris-HCl，pH 6.8
0.1% (w/v)十二烷基硫酸钠
0.1% (v/v)过硫酸铵
1/500 V TEMED
2. 15% 分离胶
15% (v/v) ROTIPHORESE ® NF-丙烯酰胺/双溶液 30 (37.5:1)
375 mM tris-HCl，pH 8.8
0.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠
0.1% (v/v)过硫酸铵
1/1000 V TEMED
3. 4x 蓝色缓冲液
0.25 M tris-HCl，pH 6.8
9.2% (w/v) 十二烷基硫酸钠
40% (v/v) 甘油
0.1% (w/v) 溴酚蓝
100 毫米 DTT
4. 10 ×运行缓冲液
30 克 tris 碱
144 克甘氨酸
10 g 十二烷基硫酸钠在 1,000 mL 的mQ水中，pH 8.3
5. 6% 聚丙烯酰胺凝胶
6% (v/v) ROTIPHORESE ® NF-丙烯酰胺/双溶液 40 (19:1)
1 × TBE
8 M 尿素
6. 10 × TBE
108 克三基地
55克硼酸
40 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0 溶于 1,000 mL 的mQ水，pH 8.3
6. 1 × TBE 是 10 × TBE 的 1:10 稀释液（来自第 6 步）

足印测定
1. 10 × toeprinting 缓冲区
100 mM tris-HCl，pH 7.5
300 毫米氯化钾
5 毫米 DTT
2. 10% 聚丙烯酰胺凝胶
10% (v/v) 丙烯酰胺/双溶液 40 (19:1)
1 × TBE
8 M 尿素
3. 尿素蓝缓冲液
0.025% 溴酚蓝
7.6 M 尿素中的二甲苯氰

致谢

作为斯特拉斯堡大学、CNRS 和Inserm的 ITI 2021-2028 计划的一部分，跨学科主题研究所IMCBio + 的这项工作得到了 CNRS 和Agence的支持 Nationale de la Recherche (ANR, 授予 ANR-21-CE12-0030-01 (SM), IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002)、SFRI-STRAT'US 项目 (ANR 20-SFRI-0012) 和 EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) 在法国未来投资计划的框架下。我们感谢 Marat Yusupov博士、 Yaser Hashem 博士、Pascale Romby博士和 Angelita Simonetti 博士的有用讨论和批判性建议，感谢Yaser Hashem 博士和 Armel Bézault博士在 Talos Arctica 显微镜上的数据采集方面的帮助。
该协议改编自 Belinite 等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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