材料和试剂

1.用于试剂稀释的微量离心管（1.5 mL）（SSI，目录号：1260）
2.黑色 96 孔聚苯乙烯平底微孔板（Corning，目录号：3915）
3.0.20μm膜过滤器（Corning，目录号：431219）
4.Protealysin (PLN) 在大肠杆菌中产生并如 Gromova 中所述进行纯化等。（2009 年）。虽然 PLN 用于协议的开发，但也可以使用其他 M4 家族蛋白酶。特别是，我们成功地实施了该协议，无需对来自Bacillus thermoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶（Serva，目录号：36015）进行任何修改
5.Emfourin (M4in) 在大肠杆菌中产生并如 Chukhontseva 所述纯化等。（2021 年）。 M4 家族肽酶的其他蛋白质或低分子量抑制剂的活性也可以使用该协议确定
6.底物：2-氨基苯甲酰基-L-精氨酰基-L-丝氨酰基-L-缬氨酰基-L-异亮氨酰基-L-(ε-2,4-二硝基苯基)赖氨酸[Abz-RSVIK(Dnp)]（肽2.0）
7.三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
8.三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
9.二甲基亚砜（DMSO）（MP Biomedicals，目录号：0219605525）
10.检测缓冲液（参见配方）
11.DMSO 中的底物原液（参见配方）。可在 -20 °C 下储存，不会损失任何基材特性；但是，有必要尽量减少冻融循环。
12.蛋白酶 (PLN) 溶液（参见食谱）。分析前立即准备；不存储
13.抑制剂(M4in) 溶液（见配方）。分析前立即准备；不存储

设备

1.台式微量离心机（Eppendorf、 Micro Centrifuge 5415 )
2.用于微量离心管的固态实验室恒温器（DNA 技术，Thermit）
3.能够测量荧光动力学的温控酶标仪（BMG、CLARIOstar Plus）

软件

1.GraphPad Prism 8.0（GraphPad 软件）

程序

1.准备检测缓冲液、底物和蛋白质（PLN 和 M4in）储备溶液。
2.将 120 μL 底物溶液加入黑色 96 孔板的孔中（见注 1）。
3.在 37°C 下将板在酶标仪中孵育 10 分钟（见注 2）。
4.从每口井中取出 30 μL 的底物溶液。
5.在 37°C的恒温器中预热测定缓冲液和蛋白质储备溶液。
6.根据表 1，将抑制剂溶液或测定缓冲液添加到孔中：
a.15 μL 抑制剂溶液用于抑制测试。
b.15 μL 用于酶活性控制的测定缓冲液（见注 3）。
c.30 μL 用于底物对照的检测缓冲液（见注 4）。
7.将阅读器中的混合物在 37°C 下孵育 1 分钟。
8.用 15 μL PLN 溶液开始抑制试验和酶活性控制反应（表 1）。添加酶后，立即将溶液与设置为 80 μL 的微量移液器混合一次。该操作减少了反应开始时可能出现的信号失真。
9.将板在 37 °C 下放入阅读器中，并在 320 和 420 nm 的激发和发射波长下，每 10 秒记录一次与时间相关的荧光变化 15 分钟（见注 5）。
10.将基板溶液从基板控制井转移到分光光度计单元中，以测量 365 nm 的光密度。使用从获得的光密度计算的浓度作为水解反应中的初始底物浓度（见注 6）。

表 1.分析混合物的组成
样本试剂专注体积 (μL)
在反应混合物中在添加的解决方案中
基板控制基质30 或 90 μM40 或 120 μM90
检测缓冲液30
全部的：120
酶活性控制基质30 或 90 μM40 或 120 μM90
检测缓冲液15
蛋白酶晚上 50 点下午 400 点15
全部的：120
抑制试验基质30 或 90 μM40 或 120 μM90
抑制剂0.5–3.5 纳米4–28 海里15
蛋白酶晚上 50 点下午 400 点15
全部的：120

数据分析

对每对底物和 M4in 浓度进行了几次独立测量。使用 GraphPad Prism 8.0 软件绘制和分析进展曲线。曲线分析的详细信息可以在原始研究文章中找到（Chukhontseva 等人， 2021）。以特征进度曲线为例（图1 ）。

图1. Emfourin介导的蛋白酶解酶催化的 Abz-RSVIK(Dnp) 水解抑制作用。
Abz-RSVIK(Dnp) 浓度为 30 (A) 和 90 (B) μM； emfourin 浓度为 0、0.5、1、1.5、2、2.5 和 3.5 nM；蛋白酶的浓度为 50 pM。反应在37°C下进行。 Abz-RS (2-aminobenzoyl-L-arginyl-L-serin) 是底物水解的产物。使用校准曲线将相对荧光单位转换为产物浓度，如前所述（Karaseva 等。 , 2019)。

笔记

1.与先前描述的 PLN 活性测定一样，在抑制测定中，反应是通过添加酶开始的( Chukhontseva et al. , 2021 ) 。然而，在这里我们设法通过调整光电倍增管增益来显着降低测定中的酶浓度。当将荧光灯转换为电流时，增益设置控制光电倍增管的放大。我们能够使用更低的酶浓度进行测量（图 2）。然而，降低浓度会导致低信号，从而降低信噪比。

图 2. 不同浓度的蛋白酶解蛋白水解 Abz-RSVIK(Dnp) 的动力学
蛋白酶解浓度为 0、25、50、100、250、500 和 2,500 pM； Abz-RSVIK(Dnp) 浓度为 30 μM。反应在37°C下进行。 Abz-RS (2-aminobenzoyl-L-arginyl-L-serin) 是底物水解的产物。使用校准曲线将相对荧光单位转换为产物浓度，如前所述（Karaseva 等。 , 2019)。

2.微孔板上的底物吸附是该操作的主要原因。我们之前研究了微孔板上底物吸附的动力学，并观察到在孵育 10 分钟后，底物浓度在反应时间内没有变化（Karaseva 等。 , 2019)。
3.进行酶活性控制以检查蛋白酶活性。每次准备新溶液时以及在独立测量之间进行此控制。
4.底物控制的主要目的是确定反应混合物中的底物浓度。底物控制也是必要的，以证明背景噪音低并且在没有酶的情况下没有自发的底物水解。由于底物的高背景噪声，我们进一步降低酶浓度的尝试失败了，这导致了信号变化。
5.在这里，酶添加和测量开始之间的延迟约为 20 秒。
6.底物储备溶液的制备和进一步稀释以最终反应混合物中 DMSO 浓度不超过 2.5% 的方式进行。在此浓度范围内，DMSO 对蛋白酶解 Abz-RSVIK(Dnp) 的水解没有显着影响（图 3）。如前所述（Karaseva 等人， 2019）。底物浓度对 50 pM 酶反应速率的依赖性如图 4 所示。

图3 。 _ DMSO 对蛋白酶解蛋白 Abz-RSVIK(Dnp) 水解速率的影响。
Abz-RSVIK(Dnp) 浓度为16 μM；蛋白酶的浓度为 50 pM 。反应在37°C下进行。

图 4. 显示 Abz-RSVIK(Dnp) 浓度与蛋白酶催化反应速率之间关系的 Michaelis-Menten 饱和曲线。
蛋白酶的浓度为 50 pM。反应在37°C下进行。

食谱

1.检测缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.4
将 1.653 g Tris-HCl 和 0.242 g Tris 与 240 mL dH 2 O混合
用 HCl 调节 pH 至 7.4
添加 dH 2 O 至 250 mL
通过 0.20 μm 膜过滤器过滤
2.基材原液
将 2 mg 的底物溶解在 400 μL 的 DMSO 中。要获得所需的底物浓度，请在检测缓冲液中稀释储备溶液。将得到的底物溶液以 10,000 × g离心10 分钟，但不要将其转移到新管中，因为底物可以吸附在塑料上（Karaseva 等人， 2019）。使用消光系数 ε 365 nm = 1,7300 M 1通过 2,4-二硝基苯在 365 nm 处的吸光度确定底物浓度厘米-1 （约翰宁等。 , 1998)。处理过程中将底物溶液保持在室温下，在分析前立即准备，不要储存。
3.PLN 和 M4in 解决方案
在移液器吸头末端取少量冻干蛋白（PLN 或 M4in），溶解在 200 μL 的检测缓冲液中。将溶液以 10,000 × g离心10 分钟，然后转移到新管中以除去未溶解的部分。使用 PLN (ε 280 nm = 52,370 M 1 cm 1 ) 和 M4in (ε 280 nm = 10,810 M 1 cm 1 ) (Chukhontseva)的消光系数通过 280 nm 处的吸光度确定所得溶液的浓度等。 , 2021;卡拉塞娃等人， 2019）。要获得所需的蛋白质浓度，请在测定缓冲液中稀释溶液。在处理过程中将蛋白质溶液保持在室温下。

致谢

这项工作是使用国家研究中心“库尔恰托夫研究所”分子遗传学研究所细胞与基因技术中心的设备进行的。这项工作得到了俄罗斯科学基金会（项目号 22-24-00135）的支持。该协议改编自之前的工作（Chukhontseva等人，2021 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

1.Adekoya, OA 和 Sylte, I. (2009)。嗜热菌蛋白酶家族 (M4)：治疗和生物技术潜力。 Chem Biol Drug Des 73（1）：7-16。
2.Chukhontseva, KN, Berdyshev, IM, Safina, DR, Karaseva, MA, Bozin, TN, Salnikov, VV, Konarev, PV, Volkov, VV, Grishin, AV, Kozlovskiy, VI 等。（2021 年）。 protealysin 操纵子编码 emfourin，一种新型蛋白质金属蛋白酶抑制剂家族的原型。 Int J Biol Macromol 169：583-596。
3.Demidyuk, IV, Gasanov, EV, Safina, DR 和 Kostrov, SV (2008)。嗜热菌蛋白酶样蛋白酶前体的结构组织。蛋白质 J 27（6）：343-354。
4.Demidyuk, IV, Gromova, TY 和 Kostrov, SV (2013)。蛋白酶解。 Rawlings, ND 和 Salvesen, G. (Eds.)蛋白水解酶手册。第 3 版。学术出版社，507-602。
5.Eshwar, AK, Wolfrum, N., Stephan, R., Fanning, S. 和 Lehner, A. (2018)。 Cronobacter turicensis LMG 23827(T) 中基质金属蛋白酶 9 和 Zpx 的相互作用介导了斑马鱼模型中的感染。细胞微生物20（11）：e12888。
6.Feng, T., Nyffenegger, C., Hojrup, P., Vidal-Melgosa, S., Yan, KP, Fangel, JU, Meyer, AS, Kirpekar, F., Willats, WG 和 Mikkelsen, JD (2014)。延伸蛋白修饰金属蛋白酶的表征：胡萝卜杆菌 Prt1 的 N 端加工和底物切割模式。申请微生物生物技术98(24)：10077-10089。
7.Gromova, TY, Demidyuk, IV, Kozlovskiy, VI, Kuranova, IP 和 Kostrov, SV (2009)。蛋白酶前体的加工。生物化学 91（5）：639-645 。
8.Johanning, K., Juliano, MA, Juliano, L., Lazure, C., Lamango, NS, Steiner, DF 和 Lindberg, I. (1998)。激素原转化酶 2 对脑啡肽原和脑啡肽原相关底物的特异性。生物化学杂志 273（35）：22672-22680 。
9.Karaseva, MA, Chukhontseva, KN, Lemeskina, IS, Pridatchenko, ML, Kostrov, SV 和 Demidyuk, IV (2019)。蛋白酶解的内部猝灭荧光肽底物。科学代表9（1）：14352。
10.Khaitlina, S.、Bozhokina, E.、Tsaplina, O. 和 Efremova, T. (2020)。细菌肌动蛋白特异性内切蛋白酶 Grimelysin 和 Protealysin 作为促成沙雷氏菌侵袭活动的毒力因子。国际分子科学杂志21（11）：4025。
11.Tsaplina, OA, Demidyuk, I., Artamonova, T., Khodorkovsky, M. 和 Khaitlina, S. (2020)。蛋白酶对外膜蛋白 OmpX 的切割可调节 Serratia proteamaculans 入侵。 FEBS Lett 594（19）：3095-3107。
12.Tsaplina, OA, Efremova, T., Demidyuk, I. 和 Khaitlina, S. (2012)。丝状肌动蛋白是蛋白酶的底物，蛋白酶是侵入性沙雷氏菌的金属蛋白酶。 FEBS J 279（2）：264-274。