材料和试剂

293T人胚胎肾细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
MCF7 细胞（ATCC，目录号：HTB-22）
MDA-MB-231 细胞（ATCC，目录号：CRM-HTB-26）
10厘米盘子（ Fisherbrand ，目录号：FB0875712）
细胞刮刀（ Fisherbrand ，目录号：08-100-241）
DMEM，高葡萄糖，HEPES（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12430104）
DMEM，低葡萄糖，丙酮酸，HEPES（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12320032）
胎牛血清 (FBS) [各种供应商；对乳腺上皮细胞进行预筛选，以确定在四代过程中促进细胞生长而没有细胞死亡（浮动细胞）的批次]
青霉素/链霉素（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15070063）
1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（ Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10010023）
HEPES（1 M）（Gibco， Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）
MgCl 2 （Merck/Sigma-Aldrich，目录号：208337）
KCl （Merck/Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
Nonidet ™ P 40 替代品（ Fluka Biochemika ，目录号：74385）
DTT（1,4-二硫苏糖醇； MilliporeSigma ，目录号：111474）
RNaseOUT TM重组核糖核酸酶抑制剂（ Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：10777-019）。储存在-20°C，使用前在冰上解冻
停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂一次性混合物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：78442）
Dynabeads ® Protein G（ Life Technologies 的Novex ，目录号：10003D）。储存于 4°C
Tween-20（Merck/Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
RNeasy ®迷你套件（Qiagen，目录号：74104）
QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen，目录号：205311）
Bradford 试剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23238）
转移膜 Immobilon-P 聚偏二氟乙烯（PVDF）（Merck/Millipore，目录号：IPVH00010）
Precise TM 4% – 20% Tris-HEPES-SDS 蛋白质凝胶，4.5 mm（ Thermo Fisher Scientific，目录号：25244）或任何选择的预制凝胶
抗 IMP-1（D33A2）兔单克隆一抗（Cell Signaling，目录号：8482）
抗纽蛋白小鼠一抗，克隆V284（ MilliporeSigma ，目录号：05-386）
抗 GAPDH（14C10）兔单克隆一抗（Cell Signaling，目录号：2118）
辣根过氧化物酶（HRP）驴抗小鼠多克隆二抗（Jackson ImmunoResearch ，目录号：715-035-151）
HRP山羊抗兔多克隆二抗（Invitrogen，目录号：G-21234）
HRP 小鼠抗兔 IgG（构象特异性）（L27A9）二抗（Cell Signaling，目录号：5127）
非免疫兔IgG全分子对照（Jackson ImmunoResearch ，目录号：011-000-003）
脱脂牛奶、奶粉（Kroger 或同等产品）
Polysome 裂解缓冲液（参见配方）
RIP 洗涤/洗脱缓冲液（参见配方）
TBS-Tween 中的 5% 牛奶（参见食谱）

设备

EXTRACTMAN 设备 (Gilson)
分光光度计（ Thermo Fisher Scientific，型号： NanoDrop 2000）
凝胶记录系统（Bio-Rad、Gel Doc XR+ Gel Documentation System）
可达到≥ 12,000 rpm 速度的冷冻离心机（必须容纳以3、000 × g旋转的50 m L试管和以 12,000 rpm 旋转的1.5 m L试管）
平板离心机（Beckman，型号：Allegra X15R）
超声仪（Fisher Scientific 100）
可容纳 1.5 mL 试管的试管旋转器；使用带有 Eppendorf 管适配器的标准旋转管旋转器
qPCR机器（Applied Biosystems，ABI7900HT Fast Real-Time PCR System）

程序

细胞培养
≥ 50% 的融合度在适当的培养基中培养板细胞。对于 293T 细胞，在 10 cm 培养皿中电镀 1.5 × 10 6 个细胞并在 48 小时内收获应产生大约2 mg 的蛋白质，这足以满足感兴趣的终点。
注意：一个 10 cm 培养皿可产生 500 µL 裂解液，或相当于两个 RIP 样品（每个 RIP 反应需要 200 µL 裂解液）。如果细胞表达高水平的内源性 RBP，则一个 10 厘米的培养皿应为 RIP 提供足够的材料；如果细胞表达低内源性 RBP 水平，则计划将两个 10 cm 培养皿合并到 500 µL 裂解液中；如果 RBP 的内源性表达水平未知，我们建议从更浓缩的裂解液开始（即，将两个 10 cm 培养皿合并成 500 µL 裂解液）。考虑到每个 RIP 需要 2 × 200 μL 的裂解物：一种裂解物用于纯化，使用针对目标 RBP 的抗体进行纯化，另一种裂解物用于使用抗 IgG 对照抗体进行纯化。每个 RIP 反应的纯化洗脱液应为蛋白质和 RNA 分析提供足够的材料。
在 37°C 下孵育细胞。
电镀后 24-48 小时继续下一步。

用于制备 RNP 裂解物的细胞裂解
注意：在冰上执行所有这些步骤。
通过抽吸从盘中取出介质。
用 5 mL 的冰冷 PBS 冲洗细胞两次。
加入 5 mL 的新鲜冰冷 PBS。
用刮刀从盘子上刮下细胞。
将刮下的材料转移到 50 mL 锥形管中。
通过在 3,000 × g和 4 °C 下离心 5 分钟来沉淀细胞。
吸出并丢弃上清液。
将多核糖体裂解缓冲液 (PLB) 添加到颗粒中（每 10 厘米培养皿 500 μL PLB 或每两个 10 厘米培养皿 500 μL PLB，以获得更浓缩的裂解液）并上下移液器以完全重新悬浮颗粒。
将裂解液转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。
将裂解液储存在 PLB 中 -80 °C 或直接进行步骤 11。
裂解物进行超声处理（10 个脉冲，4 – 5 W）。
在 4 °C 下以大约 12,000 rpm 的转速旋转裂解物 30 分钟。
将上清液转移到新的 Eppendorf 管中，并在相同条件下再旋转两次（在相同条件下总共进行三个离心循环）。
每个 Eppendorf 管中分取大约 200 μL 的裂解液，并储存在 -80 °C 下，直到准备好执行 RIP 程序或立即进行下一步。

RNP 免疫沉淀 (RIP)/EXTRACTMAN
在冰上解冻裂解物（如果冷冻）。
在 200 µL RIP 裂解液中加入大约 1.2 µg 一抗（大约含有 0.8 mg 蛋白质）并将匹配的 IgG 对照添加到另外 200 µL RIP 裂解液中。
注意：抗体的量会因抗体亲和力或内源性细胞 RBP 水平而异，需要优化（1–10 µg 抗体是典型范围）。
将 5 µ L 洗涤过的蛋白 G 结合顺磁性Dynabeads添加到含有 RIP 裂解液 + 一抗的同一管中。
注意： Dynabead清洗程序在制造商的规格表中进行了描述。
在旋转器上低速孵育混合物（大约每分钟 30 转）和 4 °C 的首选时间。
注意：大约 25% 的蛋白质在孵育 30 分钟后被拉出；然而，拉通效率会因抗体亲和力或 RBP 水平而异，并且需要优化（30 分钟至 16 小时应该是孵育时间的合理范围）。
准备 EXTRACTMAN 设备。
注意：EXTRACTMAN 设备设置以视频形式显示在以下链接中： https://www.gilson.com/extractman-starter-kit.html 。
在设备上设置新的一次性微孔板和珠子收集条。
注意：每个板包含四个标有 A-D 的“列”，每列包含一个 RIP 反应。因此，每个板可用于同时运行多达四个 RIP 反应。
将磁铁定位器放置在 EXTRACTMAN 手册中指定的正确起始位置。
对于将要运行的每个 RIP 反应，向微孔板中每列的五个小孔中的每一个添加 100 μL 的洗涤/洗脱缓冲液（这将包括洗涤孔以及结合的洗脱孔）。
注意：如果需要更浓缩的裂解液，请减少洗脱孔的体积。
将 200 μL 的 RIP 混合物（裂解液 + 原抗体 + 顺磁性Dynabeads ）添加到微孔板的大孔中。
按照 EXTRACTMAN 手册中的说明进行设备操作。简而言之，或者继续移动手柄，然后将磁铁定位器依次移动到设备上的每个连续停止位置，并在每次停止时短暂（< 5 秒）暂停。
按照程序收集每个输入孔中的剩余体积并放入管中（大约 200 µL 体积；这就是所谓的“未绑定”部分）。
收集微孔板中每列最后一个孔中的体积并放入管中（大约 100 µL 体积；这就是所谓的“绑定”分数）。
收集中间洗涤孔中的体积并放入试管中（大约每孔 100 µL）。
注意：此步骤不是必需的，但如果认为有必要，收集的体积可用于检查与洗涤程序相关的任何损失。
将未结合、结合和洗涤部分（如果适用）储存在 -20°C 以进行下游分析，或直接进行步骤 D 或 F 分别进行 RNA 和/或蛋白质分析。

RNA分离
注意：在开始工作之前，应使用 RNase Away 或含有 RNase 抑制剂的等效溶液仔细擦拭所有工作台、移液器、操作员手套等。此外，所有试管、吸头和其他耗材都应经过认证，不含 RNase/核酸酶。细胞培养基、PBS 和其他溶液（例如，裂解缓冲液成分）应专用于 RIP，并与用于其他实验目的的相同溶液分开存放。这是为了通过防止被纯化的 RNP 复合物中的 RNA 降解来避免损害 RNA 分析终点。
将 Qiagen RNeasy mini 试剂盒中提供的 350 μL 裂解缓冲液直接添加到未结合/结合/洗涤部分体积中。
按照制造商的说明进行其余处理步骤。
注意：Qiagen RNeasy 迷你试剂盒用于此处描述的工作，但如果按照制造商的说明从细胞中分离 RNA 的程序，其他 RNA 提取试剂盒/方法可能会产生类似的结果。

qRT -PCR
使用选择的方法确定 RNA 浓度和质量 [例如，将大约 1 – 2 µL 未结合/结合的馏分加载到NanoDrop设备上并记录 RNA 浓度和 260/280（理想范围：1.7 – 2.0）和 260/230 比率（理想范围: 1.8 – 2.2)]。
使用选择的试剂盒（例如， QuantiTect逆转录试剂盒）和适当的热循环仪设置设置 RT-PCR。
注意：至少重复运行每个反应。
使用上一步中生成的 cDNA 和选择的引物运行 qPCR，并为每个循环设置适当的温度和时间。
注意：其他端点，如 Northern 印迹、微阵列或 RNA-Seq 分析也可以在此处应用。

蛋白质印迹
使用选择的方法（例如，添加 Bradford 试剂，然后比色读数）确定每个未结合、结合和洗涤级分（如果适用）中的蛋白质浓度
将等量的蛋白质裂解物从每个未结合的部分加载到聚丙烯酰胺凝胶上，以实现目标蛋白质的定量可视化。假设感兴趣的 RBP 回收率为 20% – 100%（取决于抗体亲和力），加载适量的结合分数。应记录此加载分数，然后用于计算拉通效率。
使用仪器、运行/转移设置以及选择的一抗和二抗进行蛋白质印迹。

数据分析

RIP 程序可用于识别 RBP 的 mRNA 结合伙伴。在这里，我们描述了使用 EXTRACTMAN 设备从人类细胞中快速有效地纯化含有 RBP IGF2BP1 的 RNP。然后可以从纯化的 RNP 中提取 RNA 并进行qRT -PCR 分析。请注意， qRT -PCR 分析可用于此处描述的工作的上下文中，因为在先前的分析中已经确定了 IGF2BP1 的一些 mRNA 结合伙伴。如果不知道感兴趣的 RBP 的 mRNA 结合伙伴，则应应用更多的探索性 RNA 识别方法，如微阵列分析或 RNA-Seq。
纯化过程中 RBP 富集效率的评估是使用纯化级分（结合）的蛋白质印迹分析以及纯化过程后的一部分输入裂解物（未结合）进行的。分析洗涤级分中的蛋白质含量也可能有用。一个 10 cm 培养皿中 293T 细胞裂解物中的近似蛋白质产量约为 4 µg/µ L（约 2 mg 总蛋白质）。使用 Bio-Rad 凝胶记录系统提供的 Image Lab 软件对蛋白质印迹上观察到的条带强度进行量化。带强度值用于评估拉通效率，知道信号的线性响应范围。具体来说，将结合部分的条带强度除以未结合部分的条带强度会生成“% pull-through”读数，该读数可用作纯化效率的代表（图 1）。
重要的是，必须对感兴趣的 RBP 以及对照蛋白（此处使用纽蛋白或 GAPDH）的印迹进行纯化效率分析。虽然目标 RBP 的 % pull-through 效率可能会因抗体亲和力等各种因素而有所不同，但对照蛋白的 % pull-through 应该可以忽略不计。控制蛋白的显着 % pull-through 可能表明非特异性免疫沉淀条件，可以通过改变盐或去污剂浓度来增加缓冲液结合条件的严格性来修改。
还应使用 IgG 对照抗体对 RIP 反应的未结合和结合部分进行相同的分析，期望这将显示 RBP 或对照蛋白（例如 GAPDH 和 vinculin）的最小渗透。
在这里进行的分析中，与初级 CRD-BP 抗体和标准 RIP 程序孵育过夜后，RBP CRD-BP 的 % 拉通效率为 37%，而使用基于 EXTRACTMAN 的拉通效率为 60% RIP 技术（图 1A）。重要的是，在使用标准或基于 EXTRACTMAN 的 RIP 技术时，在与 IgG 对照抗体孵育后，未检测到可测量量的 CRD-BP 或对照蛋白纽蛋白。
Bio-Rad 的图像实验室软件用于量化相对条带强度，然后用于计算 % 穿透效率。软件指示用户选择参考带（在这种情况下，为每个各自的 RIP 反应的未结合部分中的带）。然后将参考条带强度设置为 1，并相对于参考条带对测试/实验条件的条带强度（在这种情况下，每个 RIP 反应的结合部分中的条带）进行定量。因此，未结合部分的相对带强度值显示在表 1 中（结合部分的带强度值始终设置为 1）。然后通过未结合部分的条带强度除以结合和未结合部分的条带强度之和乘以 100 计算 % 拉通效率。

表 1. 相对蛋白质印迹条带强度值。使用 Bio-Rad Image Lab 软件对图 1 所示的蛋白质印迹上观察到的条带的相对条带强度值进行量化。 O/N：过夜。

图 1. (A-B) 293T 细胞和 (C) MCF7 和 MDA-MB-231 细胞中 IGF2BP1 RIP 后的拉通效率的蛋白质印迹分析。
(A) 使用不同的 IGF2BP1 一抗孵育时间 [30 分钟、2 小时和过夜 (O/N)] 执行 RIP 程序后的拉通效率分析。 (A-B) 使用标准程序和 EXTRACTMAN 在 293T 细胞中进行 IGF2BP1 RIP，并比较两种技术的效率（以百分比表示）。 (C) 使用 EXTRACTMAN 对人乳腺癌细胞进行 IGF2BP1 RIP 程序后的拉通效率分析。

一旦感兴趣的蛋白质的蛋白质印迹证实了 RIP 程序的特异性，就可以对纯化材料中的 RNA 含量进行分析。具体来说，与蛋白质分析类似，RNA 是从未结合和结合的 RIP 部分中提取的。首先评估提取的 RNA 的质量和数量，例如，使用NanoDrop设备。然后，来自每个部分的等量 RNA 被逆转录用于 qPCR 分析。 293T 细胞的 RNA 产量约为 400 ng/µL（约 12 µg RNA 总量）从单个汇合的 10 cm 培养皿中提取。产量因细胞类型而异，但通常在每个汇合的 10 cm 培养皿 7–15 µg 的范围内。在使用 EXTRACTMAN 设备对目标蛋白质进行抗体的 RIP 程序之后，输出部分中的 RNA 产量范围约为从 0.2 到 0.6 µg（或相当于大约 2% – 10% 拉通）（图 2）。
使用目标 mRNA 和对照 mRNA（管家基因和/或已知与您感兴趣的 RBP 无关的基因）的引物建立反应。反应至少重复运行。在 qPCR 运行之后，对于正在研究的每组引物/基因，记录来自重复组裂解物的每个未结合和结合级分的循环阈值 (Ct) 值。然后为每组引物/基因的每个重复计算delta_Ct ( )。∆Ct=Ct_bound-〖Ct〗_unbound)然后将倍数变化计算为 2 -ΔCt 。对于一组给定的引物，如果 RBP 拉通的未结合和结合部分之间的倍数变化与 IgG 对照拉通复合物的倍数变化显着不同，则该 RNA 被指定为富集。为了获得 % mRNA pull-through 值，倍数变化除以等于倍数变化 + 1 的值，即：
% mRNA pull-through=[2^(-(Ct_(bound )- Ct_unbound ) )/(2^(-(Ct_bound - Ct_unbound ) )+1)]*100

图 2. 通过 (A) 293T 细胞和 (B) MCF7 细胞中的 IGF2BP1 RIP 程序提取的 RNA 种类的 qPCR 验证。
使用靶向特定 mRNA 种类的引物对从富含 IGF2BP1 和 IgG 的 RIP 裂解物中分离的 RNA 进行 qPCR，这些 mRNA 种类先前在含 IGF2BP1 的核糖核蛋白复合物中被鉴定。

总 % RNA pull-through 可以通过将结合部分中的 RNA 总量除以结合和未结合部分中的 RNA 总量之和乘以 100 来计算。RNA 的总量可以通过乘以得到每个部分中 RNA 的浓度除以该部分的总体积。

食谱

多核糖体裂解缓冲液
KCl粉末 ( mw : 74.5 g/mol) 100 mM, 0.7 g (745 mg)
HEPES 溶液 10 mM，pH 7.0，1 mL 的 1 M HEPES 溶液 (pH 7.0)
MgCl 2粉末 ( mw : 95.2 g/mol) 5 mM , 0.05 g (47.6 mg)
Nonidet P-40 0.5% , 0.5 mL
*Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂一次性鸡尾酒（100 ×库存） 1 ×
* RNaseOUT TM (40 U/µL) 2 U/µL
*DTT 1 毫米
总计： 100 毫升
* 每次使用前添加新鲜的（仅准备每次实验所需的特定数量的裂解物所需的体积；因此，体积会有所不同）；剩余的成分可以混合并在无 RNase/核酸酶的试管中作为储备溶液制备，并在 4°C 下储存长达一个月。
5% 牛奶在 Tris 缓冲盐水 (TBS)-Tween 中
牛奶5%， 5 毫升
TBS-吐温 (0.01%)， 95毫升
总计： 100 毫升
RIP 洗涤/洗脱缓冲液（0.01% Tween）
Tween-20 0.01%, 1 毫升
PBS , 99毫升
全部的： 100毫升

致谢

伊尔迪科 Kasza和 Joshua Martin 提供了技术援助。 Gilson, Inc (Madison, WI) 好心分享了 EXTRACTMAN 设备。该工作得到了科威特科学促进基金会（项目编号 2013-6302-03，授予 SAF）、国防部学者奖（授予编号 W81XWH-06-1-0491，授予 CMA）、国家癌症研究所（赠款号 RO1CA186134，给 DJB），并由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所试点资助（赠款号 P30 CA014520-威斯康星大学综合癌症中心支持）。该协议最初在Fakhraldeen等人中描述。（2022 年）。

利益争夺

SMB 持有 Salus Discovery LLC 的股权并受雇于该公司，该公司拥有本文所述的许可技术。 DJB 持有BellBrook Labs LLC、Tasso Inc、Stacks to the Future LLC、Lynx Biosciences LLC、 Onexion Bio-systems LLC 和 Salus Discovery LLC 的股权。所有其他作者声明他们与本文的内容没有竞争利益。

参考

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