材料和试剂

1. 植物激素标准品和内标品（表 1）。

表 1. 植物激素标准品和内部标准品。
T玉米素：反式玉米素； DHZ：二氢玉米素； t ZR：反式玉米素核苷； DHZR：二氢玉米素核糖体； t ZMP：反式玉米素核苷-5'-一磷酸； iP：异戊烯基腺嘌呤； iPR：异戊烯基腺苷； iPAMP：异戊烯基腺苷-5'-一磷酸； IAA：吲哚-3-乙酸； ABA：脱落酸； GA 1 、 20和29 ：赤霉素 A 1 、 A 20 、和 A 29 ; STD：植物激素标准； ISTD：植物激素内标。
*由于 d 2 -GA 1不再市售，因此可替换为 d 4 -GA 1 （产品编号：032 2491）。

2. 乙腈（Merck，目录号：1.00030）
3. 甲醇（Merck，目录号：1.06007）
4. Milli-Q 水 (Merk Milli-Q)
5. 乙酸（Merck，目录号： 5.33001 ）
6. 甲酸（Merck，目录号： 5.33002 ）
7. 液氮
8. 来自豌豆植物的节点 2 腋芽，有五片完全展开的叶子
9. 内标工作溶液（见配方）
10. 萃取溶剂（见配方）
11. 1% 醋酸（见配方）
12. 植物激素标准溶液（见配方）

设备

1. 2010 Geno Grinder（SPEX SamplePrep，型号：2010）
2. 用于 Geno/Grinder 2010 的 3 mm 直径 440C 不锈钢球（SPEX SamplePrep，产品编号：2151）
3. 冷冻离心机（Eppendorf，型号：5425R）
4. 固相萃取歧管（Chromabond，型号：730150）
5. 带冷阱的旋转真空浓缩器（Christ，型号：RVC 2-33）
6. 超高压液相色谱系统（岛津制作所，型号：Nexera X2）
7. 三重四极杆线性离子阱质谱系统（AB Sciex，型号：5500）
8. 实验室规模（精度：0.0001 g）
9. Sep-Pak tC18 墨盒（Waters，目录号：WAT036820）
10. 1.5 mL Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：0030121872）
11. HPLC小瓶（Agilent，目录号：5188-6591）
12. HPLC帽（Agilent，目录号：5190-7024）
13. Kinetex C18 反相 UPLC 柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μ m）（Phenomenex，目录号：00A-4475-AN）
14. Vertex低保留非过滤移液器尖端（ SSIbio ，目录号： 4337N00 ）
15. 15 mL Falcon管（Corning，目录号：352096 ）
16. 4 °C冰箱和 -20 °C和 -80 °C冰箱

程序

样品的均质化和提取
1. 称量一个 1.5 mL Eppendorf 管，内部有两个研磨珠（3 mm 不锈钢金属球）。
2. 将 20 个豌豆腋芽（每个约 2 mm）取样到一个 Eppendorf 管中，并在液氮中快速冷冻。
3. 取样后再次称量 Eppendorf 管，计算腋芽重量。
4. 用 2010 Geno Grinder 在 4 °C （1,500 冲程/分钟，2 × 1 分钟）下均质冷冻植物组织。

两个输出：RNA 沉淀和上清液
5. 将 1 mL 新鲜制备的萃取溶剂（80% 乙腈含有 1% 乙酸和 5 μL 内标工作溶液）添加到均质样品中，并在室温下涡旋 10 s。
6. 将提取物在 -20 °C 下放置 5 分钟，然后在 15,900 × g和 4 °C 下离心10 分钟。
7. 将 950 μL上清液转移到新的 Eppendorf 管中进行激素提取。剩余的沉淀可用于 RNA 提取（见注 1）。
8. 在室温下使用带有冷阱的旋转真空浓缩器蒸发上清液，直到颗粒完全干燥。

使用固相萃取 (SPE) 柱清洗样品
9. 将 1 mL 的 1% 乙酸加入干燥的样品中，上下移液 3 次以重新溶解。
10. 将样品储存在 4 °C ，直到在步骤 14 加载到 Sep-Pak tC18 墨盒上。
11. 使用 Sep-Pak tC18 墨盒设置固相萃取歧管（图 1）。

图 1.采用 Sep-Pak tC18 小柱的固相萃取歧管装置。

12. 用 1 mL 的 100% 甲醇清洗 Sep-Pak tC18 墨盒。
13. 用 1 mL 的 1% 乙酸激活 tC18 墨盒。
14. 将样品（从步骤 10 开始）加载到激活的墨盒上。
15. 用 1 mL 的 1% 乙酸清洗装入的墨盒。
16. 用含有 1% 乙酸的 1 mL 80% 乙腈洗脱样品。
17. 使用带有冷阱的旋转真空浓缩器在室温下蒸发洗脱的样品，直到完全干燥。
18. 在干燥的样品中加入 50 μL 的 1% 乙酸，上下移液 3 次以重新溶解，涡旋 30 秒。
19. 在 15,900 × g和 4 °C 下将溶解的样品离心10 分钟，然后将上清液转移到 HPLC 小瓶中。
20. 在加载到 UPLC-MS/MS 之前，将样品储存在 -80 °C 。

UPLC–MS/MS 设置
用于该协议的 UPLC-MS/MS 系统是 Nexera X2 超高压液相色谱系统与配备电喷雾电离源 (ESI) 的 5500 三重四极杆线性离子阱质谱系统相结合。 UPLC方法如下：
流动相 A：Milli-Q 水中的 0.5% 甲酸 (v/v)。
流动相 B：0.5% 甲酸的乙腈溶液 (v/v)。
流速：0.5 mL min -1 。
UPLC 梯度：0.5 分钟内 4% B，7 分钟内 4%–15% B，3.5 分钟内 15%–95% B。
净化步骤：95%–95% B 超过 2 分钟，95%–4% B 超过 0.1 分钟，柱清洗 1 分钟。
ESI 参数（分别用于正模式和负模式）：气帘，20 psi；碰撞气体，介质；离子源温度，500 °C ；离子源气体 1 和 2，80 psi；和 IonSpary 电压，+4,500 V 或 -4,500 V。
表 2 列出了计划的多反应监测 ( sMRM) 参数。

表 2. 植物激素标准及其相应内标的 sMRM 参数。 PH 和 ISTD 之间的 CE、DP 和 EP 相同。
PH：植物激素； Q1：Q1中选择的母离子； Q3：Q3中选择的产物离子； RT：保留时间； ISTD：内标； SM：扫描模式； CE：碰撞能量； DP：去簇潜力； EP：进入潜力。

数据分析

MultiQuant 软件 (AB Sciex, USA) 用于分析原始质谱数据。通过与样品中添加的内标浓度进行比较，使用 Microsoft Excel 进一步计算每种激素的浓度。

笔记

1. 植物碎片颗粒中的 RNA 应该能够使用大多数可用的 RNA 提取方法进行提取。已经测试了两种已建立的 RNA 提取方法：第一种是商业 RNA 提取试剂盒，第二种是基于十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 的方法（Barbier 等。 , 2019a;曹等。 , 2020)。颗粒中的 RNA 立即被提取，颗粒的保存条件在本方案中未测试。
2. UPLC-MS/MS 方法的验证已在我们之前的出版物（Cao 等。 , 2020) 。
3. 在加入提取溶剂之前，植物材料应始终保持冷冻状态，以防止植物激素降解或植物细胞中可能发生的代谢反应。
4. Sep-Pak tC18 小柱在激活后应保持湿润，直至样品洗脱。
5. UPLC-MS/MS 系统的维护应严格按照制造商的要求进行，以防止灵敏度下降和环境污染。
6. 所有直接接触样品的溶剂和耗材均经过测试，无环境污染。如果需要更换不同品牌的耗材，则需要进行环境污染测试。
7. 如果 UPLC-MS/MS 系统需要更换为其他类型的型号或品牌（例如，Agilent、Thermos 或 Waters），则需要使用植物激素标准品和内标物重新优化 UPLC-MS/MS 的设置.
8. 如果植物激素提取过程不能在一个工作日内完成，可在步骤 8 后暂停该过程，将干燥的样品在-20 °C下储存24 h，然后再继续提取。
9. https://www.frontiersin.org/files/Articles/605069/fpls-11-605069-HTML/image_m/fpls-11-605069-g001.jpg找到植物激素和 RNA 提取的汇总流程图。

食谱

1. 内标工作液
10 纳克毫升-1 d 5 - t玉米素
20 纳克毫升-1 d 3 - DHZ
40 ng mL -1 d 5 - t ZR
100 纳克毫升-1 d 3 -DHZR
120 ng mL -1 d 5 - t ZMP
40 纳克毫升-1 d 6 -IP
60 纳克毫升-1 d 6 -iPA
10 纳克毫升-1 d 6 -iPRMP
200 纳克毫升-1 d 5 -IAA
200 纳克毫升-1 d 2 -GA 20
200 纳克毫升-1 d 2 -GA 29
200 纳克毫升-1 d 6 -ABA
溶于 100% 甲醇。
在 -80 °C 下储存长达一个月。
2. 萃取溶剂
用 Milli-Q 水稀释乙腈和乙酸至含有 1% 乙酸的 80% 乙腈。在 4 °C 下储存长达 1 个月。
3. 1% 醋酸
用 Milli-Q 水将乙酸稀释至 1% 乙酸。在 4 °C 下储存长达 1 个月。
4. 植物激素标准溶液
植物激素标准溶液和内标溶液用甲醇稀释至 100 µg mL -1 （储备溶液）和 1 µg mL -1 （工作溶液）。在 -80 °C 下储存长达一年。

致谢

该方法已作为方法论文章发表在植物科学前沿（曹等。 , 2020)。这项研究由昆士兰大学和澳大利亚研究委员会乔治娜·斯威特奖学金 (FL180100139) 资助，并在 ARC 自然和农业植物成功卓越中心 (CE200100015) 的建立阶段得到支持。我们感谢 Lindsay Shaw 博士审阅了手稿。

利益争夺

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

参考

1. Barbier, FF, Chabikwa, TG, Ahsan, MU, Cook, SE, Powell, R., Tanurdzic, M. 和 Beveridge, C. (2019a)。一种不含苯酚/氯仿的方法，可从顽固的热带木本植物中提取核酸，用于基因表达和测序。植物方法15（1）：62。
2. Barbier, FF, Dun, EA, Kerr, SC, Chabikwa, TG 和 Beveridge, CA (2019b)。控制芽分支的信号的更新。趋势植物科学24（3）：220-236。
3. Cao, D., Barbier, F., Yoneyama, K. 和 Beveridge, CA (2020)。一种从少量植物组织中定量 RNA 和植物激素的快速方法。前植物科学11（1832）。
4. Cao, D.、Lutz, A.、Hill, CB、Callahan, DL 和 Roessner, U. (2017)。一种应用于遭受盐分胁迫的大麦根的植物激素和其他代谢物的定量分析方法。前植物科学7：2070。
5. Cao, Z.-Y., Sun, LH, Mou, RX, Zhang, LP, Lin, XY, Zhu, ZW and Chen, MX (2016)。使用二元固相萃取和液相色谱-三重四极杆质谱分析水稻中的植物激素及其主要代谢物。 J 色谱仪 A 1451：67-74。
6. Charnikhova, TV, Gaus, K., Lumbroso, A., Sanders, M., Vincken, JP, De Mesmaeker, A., Ruyter-Spira, CP, Screpanti, C. 和 Bouwmeester, HJ (2017)。玉米内酯。来自玉米的新型天然独脚金内酯。植物化学137：123-131。
7. Liu, Y.、Fang, X. a.、Chen, G.、Ye, Y.、Xu, J.、Ouyang, G. 和 Zhu, F. (2019)。用于植物激素分析的样品制备技术的最新发展。分析化学中的 TrAC 趋势113：224-233。
8. Novák, O.、Napier, R. 和 Ljung, K. (2017)。放大植物激素分析：组织和细胞特异性方法。 Annu Rev 植物生物学68：323-348。
9. Pan, X.、Welti, R. 和 Wang, X. (2010)。高效液相色谱-质谱法定量分析植物粗提物中的主要植物激素。国家协议5（6）：986。
10. Schäfer, M.、Brütting, C.、Baldwin, IT 和 Kallenbach, M. (2016)。通过基于单次固相萃取的样品制备和 UHPLC-HESI-MS/MS 分析，对 100 多种初级和次级代谢物以及植物激素进行高通量定量。植物方法12（1）：30。
11. Šimura, J.、Antoniadi, I.、Široká, J.、Tarkowská, D.、Strnad, M.、Ljung, K. 和 Novák, O. (2018)。植物激素组学：通过靶向代谢组学进行多种植物激素分析。植物生理学177（2）：476-489。
12. Trapp, MA, De Souza, GD, Rodrigues-Filho, E., Boland, W. 和 Mithöfer, A. (2014)。经验证的植物激素定量方法。前植物科学5（1-11）。
13. Xin, P., Guo, Q., Li, B., Cheng, S., Yan, J. 和 Chu, J. (2020)。一种定制的高效样品预处理方法，用于同时定量 10 类已知内源性植物激素。植物公社 1(3)：100047 。
14. Yao, C. 和 Finlayson, S. (2015)。脱落酸是拟南芥腋芽生长的一般负调节剂。植物生理学169（1）：611-626。
15. Yu, D., Rupasinghe, TW, Boughton, BA, Natera, SH, Hill, CB, Tarazona, P., Feussner, I. 和 Roessner, U. (2018)。高分辨率 HPLC-QqTOF 平台，使用平行反应监测进行深入的脂质发现和快速分析。 Anal Chim Acta 1026：87-100。