材料和试剂

1.雄性 C57BL/6 小鼠（在蒙得维的亚巴斯德研究所动物设施-UBAL 饲养和维护）
2.Falcon ® 50 mL 锥形离心管（Corning，目录号：352070）
3.1.5 mL Eppendorf 微量离心管（CNWTC，目录号：TYA10）
4.96孔板，V形底（Deltalab，目录号：900012.1）
5.带 26 G 针头的 1 mL 注射器（BD，目录号：303176）
6.带有 24 G 针头的 5 mL 注射器（BD，目录号：302187）
7.氯胺酮（Pharmaservice，Ripoll Vet，蒙得维的亚，乌拉圭）
8.甲苯噻嗪（Unimedical，蒙得维的亚，乌拉圭）
9.95％乙醇（Drogueria Industrial Uruguaya，目录号：12702 ）
10.RPMI（GIBCO，目录号：61870-010）
11.FBS（GIBCO，目录号：10437-028）
12.BSA（摩羯座，目录号：BSA-1U）
13.EDTA（Fluka，目录号：03620）
14.PBS（Sigma，目录号：D1408）
15.0.4％台盼蓝溶液（GIBCO，目录号：15250061）
16.正常大鼠血清 (NRS)（由 URBE - Facultad de Medicina - UdelaR 提供）
17.eBioscience TM FoxP3/转录因子染色缓冲液组（Invitrogen，目录号：00-5523-00）
18.LIVE/DEAD 可固定远红死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：L10120）
19.APC 抗 CD11b抗体（Millipore，目录号：MABF520 ）
20.APCCy7 抗 CD19抗体（ BioLegend ，目录号：115530）
21.APCCy7 抗 TCRβ 链抗体（ BioLegend ，目录号：109220）
22.APCCy7 抗 Ly-6G抗体（ BioLegend ，目录号：127624）
23.Brilliant Violet TM 510 抗 CD11b抗体（ BioLegend ，目录号：101245）
24.PE抗F4 / 80抗体（Millipore，目录号：MABF1530 ）
25.抗 SIRT6抗体（Abcam，目录号：ab191385 ）
26.Alexa Fluor TM 488山羊抗兔IgG抗体（Invitrogen，目录号：A11034 ）
27.氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉（见食谱）
28.70% 乙醇（见配方）
29.RPMI 补充 0.2% FBS（见食谱）
30.FACS 缓冲液（见配方）
31.15% 正常大鼠血清 (15% NRS)（见配方）

设备

1.手术器械（梅奥和虹膜剪刀直和蚊子止血解剖钳）
2.冷冻离心机（Eppendorf，型号：5804R），转子 A-2-DWP
3.倒置显微镜（尼康，型号：Eclipse TS100）
4.血细胞计数器（Bright-Line TM ，目录号：Z359629）
5.Attune TM NxT 流式细胞仪（Invitrogen，目录号：A24858）

软件

1.Attune TM NxT 软件 (Invitrogen)
2.FlowJo（有限责任公司，FlowJo_Vx.0.7）

程序

A.腹腔细胞的分离和制备（请参阅解释性视频以遵循步骤 5 - 10）
1.使用带有 26 G 针头的 1 mL 注射器，通过皮下注射 500 μL 的氯胺酮/甲苯噻嗪（参见食谱）对小鼠进行麻醉。
2.通过颈椎脱位安乐死小鼠。
3.将鼠标背面放在聚苯乙烯泡沫塑料块上。
4.用 70% 乙醇喷洒鼠标（参见食谱）。使用解剖钳和梅奥剪刀，抓住并切割腹膜的外部皮肤。
5.将皮肤分开，直到暴露约 3 厘米的腹膜。
6.用解剖钳拉起腹膜皮肤并将其抬高（参见视频 1）。
7.G 针头的 5 mL 注射器在腹腔中注入 4 mL 的 RPMI，辅以 0.2% FBS 。将针头轻轻插入用解剖钳固定的区域。
8.注射后，用止血钳夹住该区域并轻轻按摩腹膜以释放细胞。
9.使用虹膜剪刀，在夹子上方区域的腹膜壁上进行切口。握住止血钳，在 50 mL Falcon 管中将鼠标面朝下翻转。或者，可以使用塑料巴斯德吸管进行腹腔灌洗收集。
10.到达那里后，打开夹子，释放并收集腹膜液。
11.下以 500 × g离心收集的腹膜液10 分钟摄氏度。
12.在 1 mL 的 RPMI 中丢弃上清液并重新悬浮细胞，并辅以 0.2% FBS。
13.使用台盼蓝（1:2 稀释）和血细胞计数器计数活细胞。

视频 1. 腹腔灌洗。

注意：不推荐腹腔内麻醉，因为它对腹膜细胞有炎症作用。在颈椎脱位前对小鼠进行麻醉以促进精确操作并避免腹膜腔内的血液浸润非常重要。为防止对腹膜腔器官造成损伤，避免用腹膜液收集血液或其他液体，在注射、钳夹和切割腹膜时要非常小心，这一点很重要。使用 24 G 针头进行腹腔灌洗至关重要。更大的针头会损坏腹膜和腔内的器官。至少需要 1 分钟的腹膜小鼠按摩才能从腹膜腔中恢复尽可能多的细胞。用于腹腔灌洗的技术可确保完全恢复注入腹腔的体积，从而最大限度地恢复细胞。使用此协议，至少 5 × 10 6每只动物将被回收。动物牺牲后，所有程序不应超过 5 分钟，以最大限度地提高细胞活力。收集后，将腹腔细胞保持在冰上很重要。为了获得最佳的腹膜细胞计数，建议使用最终的 1:20 稀释。在补充有 0.2% FBS 的 RPMI 中稀释细胞 1:10，然后用台盼蓝稀释 1:2。

B.流式细胞仪染色方案_ _ _
1.对每个要分析的样品使用三个孔：一个用于 SIRT6 染色，另一个用于 SIRT6 抗体控制和二级抗体控制（参见表 1 中的详细控制信息）。对于单染色 (SS) 和无染色 (NS)，将所有样品中的剩余细胞混合并铺板。在所有情况下，每孔板 2 × 10 5 个细胞。
2.以 500 × g离心细胞2 分钟。
3.用多通道移液器吸出并丢弃上清液，并用 100 μL 的 PBS 洗涤。或者，可以通过倒置板来倾析上清液。
4.以 500 × g离心细胞2 分钟。
5.丢弃上清液并将所有样品孔重新悬浮在 10 μL的可固定活力染料中（参见表 2）。对于 SS 和 NS 井，在 10 μL的 PBS 中重新悬浮。
6.在室温下孵育板 10 分钟，避光。
7.加入 15 μL的 15% NRS（参见食谱）并重新悬浮细胞。
8.在避光的冰上孵育 20 分钟。
9.加入 25 μL的表面染色混合物（参见表 2）并重新悬浮细胞。对于 SS 孔，添加为每个荧光团选择的抗体 [例如，对于 PE SS，使用 PE Anti-F4/80（每个 SS 参见表 2）]。对于 NS 井，在 25 μL 的 FACS 缓冲液中添加和重新悬浮（参见食谱）。
10.在避光的冰上孵育 30 分钟。
11.以 500 × g离心细胞2 分钟。
12.丢弃上清液并用 100 μL的 FACS缓冲液洗涤。
13.重复步骤 11 和 12。
14.丢弃上清液并将所有细胞重新悬浮在 100 μL的转录因子染色固定/透化试剂（按制造商所述制备）中。
15.°C 下孵育过夜，避光。
16.以 500 × g离心细胞2 分钟。
17.丢弃上清液并用 100 μL的转录因子染色透化缓冲液洗涤（如制造商所述制备）。
18.重复步骤 16 和 17。
19.将 20 μ L抗 SIRT6 抗体中的上清液和重悬细胞丢弃到每个 SIRT6 染色和二级抗体控制孔中。对于 SIRT6 抗体对照、SS 和 NS，在 20 μL的转录因子染色透化缓冲液中重新悬浮。
20.在避光的冰上孵育 30 分钟。
21.以 500 × g离心细胞2 分钟。
22.丢弃上清液并用 100 μL的转录因子染色透化缓冲液洗涤（如制造商所述制备）。
23.以 500 × g离心细胞2 分钟。
24.丢弃上清液并在 20 μL的共轭二级抗体中重新悬浮到 SIRT6染色孔和每个样品的 SIRT6 控制孔中。对于二级抗体控制、SS 和 NS，添加 20 μL的转录因子染色透化缓冲液。
25.在避光的冰上孵育 1 小时。
26.丢弃上清液并用 100 μL的转录因子染色透化缓冲液洗涤。
27.以 500 × g离心细胞2 分钟。
28.重复步骤 26和 27。
29.丢弃上清液并在 100 μL的 FACS 缓冲液中重新悬浮所有孔。
30.将每个孔的内容物转移到 Eppendorf 管中。
31.添加多达 400 μL的额外 FACS 缓冲液。
32.采集 2 × 10 4 和流中每个样本5 × 10 4 个事件流式细胞仪。

注意：对于 SS 和 NS，每个用于染色（SS 条件）的荧光团需要一个孔，另外一个用于 NS 条件的孔是必要的。仅当使用没有板处理器的流式细胞仪时，才需要将每个孔的内容物转移到适当的管中。每个管中所需的额外 FACS 缓冲液体积取决于所使用的流式细胞仪。对于 Attune TM NxT 流式细胞仪，在每个样品中添加 200 µL，在 SS 和 NS 条件下添加 400 µL。

表 1. 抗体对照说明。
SIRT6 抗体和二抗对照的染色和效用总结。如果需要，可以添加 SIRT6 抗体的同种型对照。
抗体控制活力染色表面染色
混合抗 SIRT6 抗体染色二抗染色效用
SIRT6 抗体对照是的是的不是的识别非特异性结合靶标的偶联二抗信号。
中学
抗体对照

是的是的是的不在不添加偶联二抗的情况下鉴定 SIRT6 抗体噪声信号。可能的光谱重叠的可视化。

表 2. 每个染色步骤的试剂制备。
准备所有使用的试剂的详细信息。对于每个染色步骤，该表显示了使用的抗体、制备抗体的初始稀释度、加入孔后的最终稀释度以及使用的稀释剂。请注意，对于表面染色混合物，倾倒门组合物 [1) 或 2)] 有两种选择，具体取决于测定的炎症状况。
初始稀释
（准备）最终稀释
（添加到井中）

可固定活力染料染色
-活/死远红1:5001:500
在 PBS 中稀释 1x
表面染色
表面混合：
-Brilliant Violet 510 抗 CD11b
1:150
1:300
-PE抗F4/801:1001:200
-APCCy7 倾卸门：
1) 有炎症刺激：
APCCy7 抗 CD19
APCCy7 抗 TCRβ
APCCy7 抗 Ly6G
2）无炎症刺激：
APCCy7 抗 CD19
在 FACS 缓冲液中稀释

单染（SS）：
-APC 抗 CD11b（用于远红 SS）
-Brilliant Violet 510 抗 CD11b
-PE抗F4/80
-APCCy7 抗 CD19
-FITC 抗 CD11c（用于 Alexa Fluor 488 SS）
在 FACS 缓冲液中单独稀释

1:200
1:200
1:200

1:200

1:100
1:150
1:100
1:200
1:100

1:400
1:400
1:400

1:400

1:200
1:300
1:200
1:400
1:200
细胞内/核内 SIRT6 染色
-抗SIRT61:2001:200
-偶联二抗（Alexa Fluor 488 山羊抗兔）1:2001:200
* 在转录因子染色透化缓冲液中单独稀释。

数据分析

1.使用 SS 采集数据执行荧光团补偿。
2.将补偿矩阵应用于所有样本。
3.按形态选择感兴趣的人群（图 1A）。在此步骤中，从门中排除与细胞碎片相对应的事件。
4.选择单个单元格事件（图 1B）。
5.选择活细胞（用于活力染料染色的阴性细胞）（图 1C）。细胞活力应在 80% – 90% 左右。
6.选择用于倾倒浇口的染色的负种群 (图 1D)。
7.选择 CD11b 阳性细胞（图 1E）。
8.在 CD11b 阳性细胞中，F4/80 的表达定义了三个群体：阴性 (F4/80 - )、低 (F4/80 lo ) 和高 (F4/80 hi ) (图 1F)。在我们的案例中，分析了 F4/80 lo和 F4/80 hi种群，因为它们被认为是不同的巨噬细胞种群（Bain等人，2016）。

图 1. 巨噬细胞群定义的门控策略。
图显示了通过形态学 (A)、单细胞 (B) 和活细胞 (C) 的选择、通过转储门 (D) 排除不同谱系、CD11b 阳性细胞 (E) 的后选择来定义感兴趣的群体，并在这些细胞 (F) 内鉴定两个巨噬细胞群 (F4/80 lo和 F4/80 hi )。在这两个群体中分析了 SIRT6 表达。箭头表示为门控策略的下一步选择的人口。所选人口的百分比显示在每个图表中。
图像是从原始研究文章（Bresque等人，2022）中提取和修改的。在本实验中，小鼠被注射了 LPS 或 PBS（对照），并使用前面描述的方案评估了腹膜细胞中的 SIRT6 表达。

9.在对照样本中选择感兴趣的巨噬细胞群（CD11b + F4/80 lo和 CD11b + F4/80 hi ）。将 SIRT6 阳性群体定义为在 SIRT6 抗体和二抗对照中观察到的所有细胞之上的门；此门在两个控件中必须相同。对于每个对照，您最多可以在 SIRT6 阳性细胞门内允许 1% 的细胞（图 2A）。对所有样品单独重复此步骤，因为对照的荧光可能因样品和/或条件而异。
10.为每个样本应用在 SIRT6 染色复制中定义的 SIRT6 正门（图 2B ）。
11.对分析的所有巨噬细胞群重复步骤 9 和 10。
12.对于数据分析，使用 SIRT6 阳性细胞中 SIRT6 阳性细胞的百分比和 SIRT6 几何平均荧光强度 (GMFI)。使用 GMFI 作为该人群中 SIRT6 表达水平的测量值。
13.如原始研究文章 (Bresque et al. , 2022)中所述进行统计分析。

图 2. 定义 SIRT6 阳性细胞的门控策略。
lo和 F4/80 hi )中使用抗体对照 (SIRT6 抗体和二级抗体) 定义 SIRT6 阳性细胞。 SIRT6 阳性门首先是两个抗体对照中的所有事件；此门中最多 1% 的事件允许用于抗体对照。 (B) SIRT6 正门应用于 SIRT6 染色样品（门的应用由黑色箭头表示）。 SIRT6 阳性细胞的百分比显示在 SIRT6阳性门内。图像是从原始研究文章（Bresque等人，2022）中提取和修改的。在本实验中，小鼠用 LPS 或 PBS（对照）治疗，并使用前面描述的方案评估 SIRT6 表达。

食谱

1.氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉（基于 30 g 小鼠计算）
氯胺酮 (50 mg/mL), 200 mg/kg, 120 µL
甲苯噻嗪 (20 mg/mL), 24 mg/kg, 40 µL
ddH 2 O, 340 µL
总计：500 µL
2.70% 乙醇
95% 乙醇，737 毫升
ddH 2 O, 263 毫升
总计：1,000 毫升
3.RPMI 补充 0.2% FBS
胎牛血清 0.2%，2 毫升
RPMI，998 毫升
总计：1,000 毫升
4.流式细胞仪缓冲器
BSA 0.1%，1 克
2 mM EDTA，20 mL（制备 100 mM EDTA）
ddH 2 O, 980 毫升
总计：1,000 毫升
5.15% 正常大鼠血清 (15% NRS)
正常大鼠血清 (NRS)，2.25 mL
FACS 缓冲液，12.75 毫升
总计：15 毫升

致谢

这项工作得到了 ANII (FCE_1_2014_1_104002 和 INNOVA II to CE) 和 FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (COF 03/11) 的资助。 MB 得到了 ANII (POS_NAC_2015_1_109950) 和 CAP (UdelaR) 的奖学金支持。 VPT 得到了 CAP (UdelaR) 的奖学金支持。 Attune™ NxT 细胞仪由 ANII (PEC_3_2019_1_158811) 的机构拨款购买和升级。作者要感谢蒙得维的亚巴斯德研究所动物设施部门 (UBAL) 和细胞生物学部门的所有人对目前工作的支持和帮助。作者要感谢梅赛德斯塞戈维亚博士 (LIRI, Institut Pasteur Montevideo) 和 Alvaro Díaz (Facultad de Química, Universidad de la República) 为流式细胞术分析提供有用的建议和讨论。发起该协议出版物的原始研究发表在 Bresque等人。（2022 年）。

利益争夺

CE 和 MB 代表所有作者声明不存在与本手稿相关的利益冲突。

伦理

本研究中使用的所有小鼠（雄性 C57BL/6）均在蒙得维的亚巴斯德研究所动物设施单位 (UBAL) 饲养和饲养。实验方案得到了蒙得维的亚巴斯德研究所动物护理和使用委员会（CEUA，方案编号 70153-000839-17、003-19 和 006-19）的批准。所有描述的研究都是根据协议中批准的方法并遵循所有国际准则和法律规定进行的。

参考

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2.Bauer, I., Grozio, A., Lasiglie, D., Basile, G., Sturla, L., Magnone, M., Sociali, G., Soncini, D., Caffa, I., Poggi, A.,等。（2012）。 NAD +依赖性组蛋白脱乙酰酶 SIRT6 通过调节 Ca 2+反应促进胰腺癌细胞中细胞因子的产生和迁移。 J Biol Chem 287（49）：40924-40937。
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5.江，H.，汗，S.，王，Y.，查伦，G.，他，B.，塞巴斯蒂安，C.，杜，J.，金，R.，葛，E.，莫斯托斯拉夫斯基，R.，等人。（2013）。 SIRT6 通过长链脂肪酰基赖氨酸的水解来调节 TNF-α 的分泌。自然 496（7443）：110-113。
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7.Kawahara，TL，Michishita，E.，Adler，AS，Damian，M.，Berber，E.，Lin，M.，McCord，RA，Ongaigui，KC，Boxer，LD，Chang，HY，等。（2009 年）。 SIRT6 将组蛋白 H3 赖氨酸 9 去乙酰化与 NF-kappaB 依赖性基因表达和有机体寿命联系起来。单元格136（1）：62-74。
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