材料和试剂

1. 96孔微孔板（Greiner Bio-One，目录号：650061）
2. HER2/PD-L1 BsAb蛋白 (Chen et al., 2021)
3. 人编程的细胞外结构域的重组细胞外结构域配体 1（C-6His）（PD-L1-ECD ） Novoprotein ，目录号：CM06）
4. 重组人表皮生长因子受体2（C-6His）（HER2）（Novoprotein，目录号：CP69）
5. PBS中的1％酪蛋白（Thermo Fisher Scientific，目录号：37582）
6. TMB 底物试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：34021）
7. 高灵敏度链霉亲和素-HRP（ Thermo Fisher Scientific，目录号：21130）
8. EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：21338）
9. 硫酸（国药化学试剂有限公司，目录号：100216008）
10. PBS（Hyclone，目录号：16777-249）
11. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
12. 0.05% PBST (v/v)（见配方）
13. 2 M 硫酸溶液 (H 2 SO 4 )（见配方）
14. 曲妥珠单抗（Selleck，目录号：A2007）

设备

1. SpectraMax M5e 酶标仪（Molecular Devices，目录号：89212-400）

软件

1. GraphPad Prism 9.0（GraphPad 软件， www.graphpad.com ）

程序

A. 抗原制备
1. 准备用于检测的生物素抗原——生物素化 HER2 蛋白。首先，根据制造商的说明，使用 EZ-Link Sulfo -NHS-LC-LC-生物素试剂盒结合 HER2 蛋白。
2. 在 PBS 缓冲液中以 2 μg/mL 的最终浓度制备人 PD-L1-ECD 蛋白（捕获抗原）。

B. 涂有 PD-L1-ECD 抗原的板
1. 用 50 μL 的 2 μg/mL PD-L1-ECD 蛋白涂抹 96 孔微孔板的每个孔。覆盖_ 板盖上盖子，在 4°C 下孵育过夜，不要搅拌。

C. HER2/PD-L1 BsAb的阻断和添加
1. 第二天，去除涂层溶液，每孔用 200 μL 的 PBS 洗板 3 次。
2. 使用多通道移液器将 200 μL 的 1% 酪蛋白在 PBS 缓冲液中添加到每个孔中，从而阻止涂层微板。在 37°C 下孵育 1 小时。
3. 丢弃阻塞溶液并用每孔 200 μL 的 0.05% PBST 清洗微孔板三次。
4. 在 PBS 缓冲液（例如，200 nM、66.7 nM、22.2 nM、7.4 nM、2.5 nM、0.823 nM、0.274 nM、0.091 nM、0.030 nM、0.010 nM、0.003 nM和 0.001 nM)。
5. 将 50 μL的每种稀释抗体一式三份添加到每个孔中，并在 37°C 下孵育 1 小时。

D. 与HER2/PD-L1 BsAb孵育并添加生物素化 HER2 抗原
1. 与 HER2/PD-L1 BsAb 和对照抗体孵育后，用 200 μL 的 0.05% PBST 将微孔板清洗 3 次至每孔。
2. 将 50 μL 预先制备的生物素化-HER2 蛋白在 PBS 缓冲液中的 1% 酪蛋白中以 2 μg/mL 移液到每个孔中，并在 37°C 下孵育 1 小时。
3. 丢弃生物素化 HER2 蛋白溶液，用 200 μL 的 0.05% PBST 将微孔板清洗 3 次至每口井。
4. 加入 50 μL 1:1,000 稀释的链霉亲和素-HRP 到每个孔中进行检测，并在 37°C 下孵育 1 小时。
5. μL的 0.05% PBST将微孔板清洗三遍。

E. 添加底物和显影
1. 根据制造商的说明以 1:1 的比例制备 TMB 底物溶液 A 和 B。在每口井中加入 50 μL新鲜制备的底物，在室温下孵育 10 分钟。
2. 充分显色后，在每个孔中加入 50 μL含 2 M 硫酸 (H 2 SO 4 ) 的终止溶液，并使用SpectraMax M5e 酶标仪测量 450 nm 处的吸光度（光密度，OD）。

数据分析

1. 从测量的 OD 450 nm值中减去背景信号并将它们标准化。将HER2/PD-L1 B sA b 浓度或对照抗体的所有值转换为对数刻度（以 10 为底，log 10 ）。
2. 绘制背景校正和归一化 OD 450 nm值（Y 轴，对应于被占用的 HER2/PD-L1 BsAb 同时与 HER2 和 PD-L1位点结合的分数）或对照抗体浓度（X 轴，log 10刻度）。
3. 4 参数逻辑模型通过非线性回归拟合浓度响应数据，使用 GraphPad Prism 9.0 软件（图 1）。

图1。双靶点的结合曲线桥接酶联免疫吸附试验。
HER2/PD-L1 BsAb 可同时与人 PD-L1-ECD 和 HER2 结合，由桥接 ELISA 确定，其中 PD-L1-ECD 蛋白包被在板上，生物素化的 HER2 蛋白作为检测剂.曲妥珠单抗用作对照抗体。数据显示为平均值 ± SEM (n = 3)。

笔记

在此 ELISA 方法中，在每个步骤中使用多通道移液器将溶液添加到 96 孔微孔板的孔中。在溶液去除和洗涤步骤中，将溶液直接倒入水槽中。没有一个板孵化步骤需要搅拌。

食谱

1. 0.05% PBST (v/v)
Tween-20 , 0.05%, 500 μL
PBS， 999.5毫升
总计， 1,000毫升
2. 2 M 硫酸溶液 (H 2 SO 4 )
硫酸 (98%)， 2 M， 3 mL
ddH 2 O, 897 米长
总计 , 1,000毫升

致谢

该工作得到国家重大科技专项“重大新药创新开发”（2019ZX09732002-006）和国家自然科学基金（81872785和81673347）的支持。此处描述的协议改编自先前发表的作品( Chen et al., 2021)。

利益争夺

MP 和 Y.-L。 C 获得上海万石生物科技有限公司的津贴。 YW、LT、WW 和 CW 受雇于 Dartsbio Pharmaceuticals, Ltd.。

参考

1. Chen, YL, Cui, Y., Liu, X., Liu, G., Dong, X., Tang, L., Hung, Y., Wang, C. 和 Feng, MQ (2021)。一种靶向 HER2 和 PD-L1 的双特异性抗体以卓越的疗效抑制肿瘤生长。生物化学杂志 297（6）：101420 。
2. Chu, W., Xu, H., Wang, Y., Xie, Y., Chen, YL, Tan, X., Huang, C., Wang, G., Wang, Q., Luo, W., et人。（2022 年）。具有优异抗肿瘤活性的 IgG4 亚类中的 HER2/PD1 双特异性抗体。临床翻译医学12（4）：e791。
3. Hinner，MJ，Aiba，RSB，Jaquin，TJ，Berger，S.，Durr，MC，Schlosser，C.，Allersdorfer，A.，Wiedenmann，A.，Matschiner，G.，Schuler，J.，等。（2019）。 4-1BB/HER2 双特异性抗体-Anticalin Fusion PRS-343 与肿瘤局部共刺激 T 细胞结合。临床癌症研究25(19)：5878-5889。
4. Kaplon, H.、Chenoweth, A.、Crescioli, S. 和 Reichert, JM (2022)。 2022 年值得关注的抗体。单克隆抗体14(1)：2014296。
5. 康特曼，RE（2012）。双特异性抗体的双重靶向策略。单克隆抗体4(2)：182-197。
6. Lee, HY, Schaefer, G., Lesaca, I., Lee, CV, Wong, PY 和 Jiang, G. (2017)。用于双特异性抗体生物测定选择的“二合一”方法。 J 免疫方法448：74-79。
7. Ljungars, A.、Schiott, T.、Mattson, U.、Steppa, J.、Hambe, B.、Semmrich, M.、Ohlin, M.、Tornberg, UC 和 Mattsson, M. (2020)。一种双特异性 IgG 形式，包含四个独立的抗原结合位点。科学代表10（1）：1546。
8. Mu, S.、Liang, Z.、Wang, Y.、Chu, W.、Chen, YL、Wang, Q.、Wang, G. 和 Wang, C. (2022)。 PD-L1/TIGIT双特异性抗体在动物模型中显示出生存优势。临床翻译医学12（5）：e754。
9. Register, AC, Tarighat, SS 和 Lee, HY (2021)。双特异性抗体的生物测定开发 - 挑战和机遇。国际分子科学杂志22（10）：5350。
10. Saldanha, M.、Dandekar, P. 和 Jain, R. (2018)。复杂生物制品生物活性测试的监管视角。趋势生物技术36（3）：231-234。