材料和试剂

1.1.7 mL微管（Genesee Scientific，目录号：22-281LR）
2.SURGIFOAM ®可吸收明胶海绵（Ethicon，目录号：1969）
3.12 孔细胞培养板，平底孔，TC 处理 (GenClone 25-106)
4.无菌1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：14190144）
5.青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 × ）（Gibco，目录号：10378016）
6.EpiLife TM CF 试剂盒（Gibco，目录号：MEPICF500）
注意：该试剂盒包含 500 mL EpiLife TM无钙培养基和 500 μL 0.06 M CaCl 2 （参见配方）。
7.人角质形成细胞生长补充剂（HKGS，100 × ）（Gibco，目录号：S0015）
8.Adwin Scientific Tissue-Tek Cryomold，中间体（Fisher Scientific，目录号：NC9511236）
9.Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）化合物（VWR，目录号：25608-930）
10.大鼠抗人整合素 α6 CD49f 抗体（ BioLegend ，目录编号： 313602，1:500 稀释）
11.Alexa Fluor 647-缀合的山羊抗大鼠二抗（ BioLegend ，目录号：313609）。稀释 1:400
12.Prolong Gold 抗褪色试剂（ThermoFisher Scientific，目录号：P36930）
13.TRIzol ™ 试剂（ ThermoFisher Scientific，目录号：15596026）
14.Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物（ ThermoFisher Scientific，目录号：H3570）
15.iScript™ cDNA 合成试剂盒（Bio-Rad，目录号：1708891）
16.培养基（见食谱）
17.洗涤缓冲液（见配方）
18.70% 乙醇（见配方）

设备

1.CO 2培养箱（松下，型号：MCO-170AICUVL-PA）
2.Technocut ®一次性手术刀，无菌，MYCO Medical，No. 20（VWR，目录号：10148-894）
3.镊子（VWR，目录号：89259-946）
4.手术剪（VWR，目录号：76192-134）
5.移液器（ ThermoFisher Scientific，型号： Finnpipette TM F2 可变容量移液器，目录号：4701070）
6.O lympus IX73 荧光显微镜（Olympus Corporation Microscopy Technologies）
7.纳米滴 1000
8.-80 °C冰箱
9.徕卡 Cryocut 1800

程序_

A.溶液制备
注意：以下步骤应在具有层流的生物安全柜中完成，以保持无菌。在放置在层流组织培养罩之前，用 70% 乙醇擦拭所有容器和试剂，并在所有步骤中使用无菌技术。
1.洗涤缓冲液（见配方 1）
× PBS中以 1:100稀释 100 ×青霉素-链霉素-谷氨酰胺 (100 × )来制备洗涤缓冲液。
2.培养基（见配方 2）

B.皮肤准备
注意：手术切除的皮肤应保持在 4°C，并在去除后尽快使用。
1.使用镊子去除皮肤上的皮下脂肪，并用含有 1倍浓度青霉素-链霉素-谷氨酰胺的 PBS 清洗（ Shannon 等人，2022 年）。
2.使用手术刀从手术切除的皮肤样本中仔细修剪激光切割边缘。
3.用 0.5 – 1.0 mL 的EpiLife TM CF培养基（无补充）和 2 cm × 2 cm 的手术明胶海绵制备 12 孔培养板。让泡沫吸收介质（ MacLeod 等人，2013；Shannon 等人，2022 ）。培养基应完全浸透手术海绵，并将孔填充约 25%。
4.将组织切成 1 cm × 1 cm 的正方形，将皮肤、真皮面朝下放在用培养基预先饱和的明胶海绵正方形上（在步骤 B3 中准备）。确保表皮保持空气界面，并确保真皮与介质浸泡的海绵接触。组织不应浸入介质中。
5.在 37 °C 下孵育组织和 5% CO 2 。
6.通过使用 1 mL 无菌血清移液器从井中吸出介质，每 2-3 天更换一次介质。通过轻轻倾斜板从底部汇集介质，避免吸头和明胶海绵之间的任何接触。在不干扰明胶海绵和皮肤外植体的情况下向井中添加新鲜培养基，并确保皮肤保持在气液界面中。
7.皮肤外植体可以这种方式保存长达 4 周（ Companjen等人，2001；Steinstraesser 等人，2009 ）。
注意：据报道成功使用皮肤外植体进行伤口愈合研究长达两周，尽管在第一周内体外皮肤培养中表皮增厚很明显（ Xu et al., 2012; Neil et al., 2020 ），和据报道，表皮屏障功能可保持完整长达四个星期（ Steinstraesser等人，2009 年）。然而，组织活力会随着时间的推移而降低。优化培养条件和实验参数很重要。

C.离体伤口
1.要产生离体伤口，请垂直握住剪刀，对皮肤组织造成 20-30 次切口。不要切碎组织：这些伤口应该很浅，每个切口应该大约是外植体长度的一半。
注意：切口伤口肉眼可能不会立即明显。
2.受伤的样本应在 24 小时内使用Trizol试剂进行 RNA 提取或快速冷冻在 OCT 化合物中进行免疫荧光染色。

D.细胞因子刺激
1.如果需要细胞因子刺激，则制备补充有所选细胞因子的培养基 [例如，IL-1β（ Companjen 等人，2001）、IL-15 或 IL-27（ Suwanpradid 等人，2021） ] ，并添加 0.5 – 1.0如步骤 B3 中所述，每孔 mL。
2.小心地将外植体转移到新制备的 12 孔板中，不要让培养基接触表皮表面。
3.在细胞因子处理后的两天内，可以从明胶海绵中收集并小心去除皮肤。

E.组织收集
免疫染色
1.将组织切成 2 mm × 2 mm 的正方形，将皮肤与真皮面朝下放在中间 Tissue-Tek cryomold 的底部。
2.慢慢添加 OCT 化合物以覆盖组织样本，避免气泡。
3.如有必要，用 10 μL 移液器吸头弹出任何气泡。
4.让 OCT 在室温下放置在平坦的表面上 10 分钟。
5.通过将 cryomold 放在平坦的表面上的干冰上，将组织快速冷冻，直到冷冻。
6.将冷冻的 OCT 块存放在 -80 °C的冰箱中，直到使用。
7.对于免疫染色，使用低温恒温器从 OCT 块中获得 7 – 10 µm 厚的含有表皮和真皮的冷冻切片。

RNA分析
1.用剪刀彻底切碎组织，并将切碎的组织转移到干净的微量离心管中，每个外植体至少含有 800 μL Trizol 试剂。
2.涡旋样品并在室温下孵育5-15 分钟，以允许 Trizol 裂解组织。
3.含有裂解组织的离心管在 12,000 × g在 4 °C 下至少 10 分钟。小心地将上清液转移到干净的试管中，用于标准 RNA 分离技术，例如乙醇沉淀或专为 RNA 提取而设计的市售试剂盒。

F.示例结果
免疫染色
1.按照上述方法，在人体组织上产生 24 小时的体外伤口，并在 OCT 化合物中冷冻。在用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟和用 0.1% Triton 渗透 15 分钟之前，将 8 μm 部分加热至室温。
2.用大鼠在潮湿室中于 4°C孵育一夜的抗人Integrin α6 CD49f 抗体切片。
3.用 0.1% Triton 的 PBS 清洗载玻片，并用 Alexa Fluor 647 偶联山羊抗大鼠二抗（稀释 1:400）孵育 1 小时。
4.随后洗涤后，使用 Hoechst 稀释 1:10,000 对细胞核染色 10 分钟。
5.上成像之前，使用 Prolong Gold 抗褪色试剂安装载玻片并盖上盖玻片（图 1）。

体外受伤并培养 24 小时的人体皮肤外植体中整合素 α6（ITGA6/CD49f，洋红色）的免疫染色。将组织切片至 8 μm厚。比例尺 = 50 μm。

逆转录定量PCR
1.Trizol试剂中分离总 RNA ，然后用 DNase I 处理。
2.使用 Nanodrop 1000 量化 RNA，并使用 cDNA 合成试剂盒生成 cDNA。使用 Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) 或 SYBR green blue (PCR biosystems) 检测扩增；每个 qPCR 反应使用 10 ng cDNA。
3.使用以下引物执行 qPCR：
基因前锋 (5'-3')反向（3'-5'）
S100a7CCTGCTGACGATGATGAATGGCTCTGCTTGTGGTAG
GAPDHATGGGAAGGTGAAGGTCGGACAGCGTCAAAGGTGGGAGGAGT

4.使用GAPDH表达作为内部对照（参见引物序列）。
5.将人类样本中基因表达计算的倍数变化标准化为未处理或未受伤的对照，如图所示。数据表示为倍数变化或使用所示的 ΔΔCt 方法（图 2）。

S100a7的相对 mRNA 水平在损伤后 24 小时 (A) 或用 100 ng 胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP) 局部治疗 16 小时 (B) 后对离体创伤 (W) 的反应。
提供的数据来自四个独立实验，使用两个不同的人类供体在技术上重复。误差线代表±SEM。在未经检验的正态性假设下，使用双尾非配对学生t检验进行统计分析。 p 值 <0.05 被认为具有统计学意义； **：p < 0.01 和 ****：p < 0.0001。

食谱

1.洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
1 ×磷酸盐缓冲液1 ×495 毫升
100 ×青霉素-链霉素-谷氨酰胺1 ×5 毫升
全部的不适用500 毫升

2.培养基
a.将一个装有 5 mL 100 × HKGS 的小瓶解冻至室温并轻轻旋转以混合。
b.旋转 0.5 mL 的 0.06 M 钙溶液进行混合（包含在EpiLife TM CF 套件中）。
c.在移至组织培养罩之前，用 70% 乙醇擦拭容器外部进行消毒。
d.吸取 5 mL 的 100 × HKGS 并添加到 495 mL 的EpiLife TM无钙培养基中。
e.将钙原料缓慢添加到 500 mL 的培养基中，以达到 0.06 mM Ca 2+的最终浓度。
f.未使用的溶液在 4 °C 下储存长达一个月。

3.70% 乙醇
试剂最终浓度数量
乙醇（绝对）70%700 毫升
H 2 O不适用300 毫升
全部的不适用1,000 毫升

致谢

我们要感谢杜克大学的 Jutamas Suwanpradid 和 Yingai Jane Jin 的协议开发。这项工作部分得到了 NIH/NIAID 赠款 R01-AI139207 和 NIH/NIAMS 赠款 R01-AR068991 和杜克大学皮肤病学系的支持。该协议改编自先前出版物中描述的方法（Macleod 等人，2013；Shannon 等人，2022）。

利益争夺

所有作者都声明没有竞争利益。

伦理

正常皮肤样本取自杜克大学医学中心接受腹部成形术的成年男性和女性患者的其他丢弃和无法识别的组织。本研究的所有人体样本均根据杜克大学机构审查委员会批准的方案获得。

参考

1.Companjen, AR, van der Wel, LI, Wei, L., Laman, JD 和 Prens, EP (2001)。用于功能研究的改进的体外皮肤器官培养系统。 Arch Dermatol Res 293（4）：184-190。
2.MacLeod, AS、Hemmers, S.、Garijo, O.、Chabod, M.、Mowen, K.、Witherden, DA 和 Havran, WL (2013)。树突状表皮 T 细胞调节皮肤抗菌屏障功能。临床投资杂志 123（10）：4364-4374。
3.Neil，JE，Brown，MB 和 Williams，AC（2020 年）。用于研究局部治疗的人体皮肤外植体模型。科学代表10（1）：21192。
4.Shannon, JL, Corcoran, DL, Murray, JC, Ziegler, SF, MacLeod, AS 和 Zhang, JY (2022)。胸腺基质淋巴细胞生成素控制头发生长。干细胞报告17(3): 649-663。
5.Smits, JPH, Niehues, H., Rikken, G., van Vlijmen-Willems, I., van de Zande, G., Zeeuwen, P., Schalkwijk, J. 和 van den Bogaard, EH (2017)。永生化 N/TERT 角质形成细胞作为 3D 人类表皮模型中的替代细胞来源。科学代表7（1）：11838。
6.Steinstraesser, L., Rittig, A., Gevers, K., Sorkin, M., Hirsch, T., Kesting, M., Sand, M., Al-Benna, S., Langer, S., Steinau, HU ，等人。（2009 年）。用于介入研究的人体全皮肤培养系统。整形术9：e5。
7.Suwanpradid，J.，Lee，MJ，Hoang，P.，Kwock，J.，Floyd，LP，Smith，JS，Yin，Z.，Atwater，AR，Rajagopal，S.，Kedl，RM 等。（2021 年）。源自巨噬细胞的 IL-27 促进过敏性超敏反应后 IL-15 的产生和 T 细胞维持。前免疫12：713304。
8.Xu, W.、Jong Hong, S.、Jia, S.、Zhao, Y.、Galiano, RD 和 Mustoe, TA (2012)。部分厚度人体外皮肤培养模型在皮肤伤口愈合研究中的应用。实验室投资92（4）：584-599。
9.Zomer, HD 和 Trentin, AG (2018)。人类和小鼠的皮肤伤口愈合：转化研究中的挑战。 J Dermatol Sci 90（1）：3-12。