材料和试剂

1. 50 mL 圆底离心管
2. 2 mL 圆底离心管
3. 70 μm 尼龙网（EMD Millipore，CLS431751）
4. 3 – 4 周龄的拟南芥植物
5. 闪烁液（Perkin-Elmer， Waltham ，目录号：6013321）
6. 14 C-百草枯（American Radiolabeled Chemicals Inc. ARC 1311）。储存于- 20 °C
7. NaCl ( Sinopharm Chemical Re a gent Co., Ltd., CHINA, CAS: 7647-14-5)
8. 氯化钙2 （国药化学试剂有限公司，中国，CAS：10043-52-4 ）
9. 氯化钾（国药化学试剂有限公司，中国，CAS：7447-40-7 ）
10. 管理系统（SIGMA，美国 CAS：1266615-59-1）
11. W5 解决方案（参见食谱）

设备

1. 带温度控制的离心机（Allegra X-22R Benchtop Centrifuge , Beckman Coulter , Indianapolis , USA）
2. 自动细胞计数仪（ IC1000 ，上海瑞宇生物科技有限公司，上海，中国）
3. （ YKD-DAT004F，无锡赛福安全设备有限公司，无锡，中国）
4. 闪烁瓶（ Perkin-Elmer，Waltham，美国）
5. 液体闪烁计数器（ Tri-Carb 2910 TR ， Perkin-Elmer，Waltham，USA）
6. -20 °C冰箱

程序

1. 根据Yoo 等人的方法分离原生质体。（2007 年）并暂停在冷 W5 溶液中（参见食谱）。
2. 用细胞计数器计数原生质体以估计它们的浓度。在 40 × g和 4 °C 下离心2 分钟。倒出上清液并将原生质体重新悬浮在冷的 W5 溶液中至大约3 × 10 6原生质体/mL。该原生质体制剂已准备好加载14 C-百草枯（图1 ）。

图 1. 14 C-百草枯进出拟南芥的实验方案叶肉原生质体。

3. 14 C-百草枯 (3.1 mM, 0.1 μC i/ μL)解冻并在室温下用 W5 溶液稀释 10 倍。
4. 加入等量稀释的14 C-百草枯溶液，最终浓度为 3 μM 14 C-百草枯。在室温下孵育 1 小时，将百草枯加载到原生质体中。
5. 在 40 × g和 4 °C 下将原生质体离心2 分钟。用卸载的14 C-百草枯丢弃上清液，用 15 mL 冷W5 溶液洗涤原生质体2-3次。
6. 在室温下将原生质体重新悬浮在 13 mL 的 W5 溶液中，并立即启动百草枯外排测定。
7. 0、10、20和 40 分钟），将1 mL 的原生质体悬浮液转移到 2 mL 圆底离心管中。在每个时间点至少重复三个。
8. 立即离心分装的样品（40 × g ，2 分钟，4 °C ）。将上清液转移到闪烁瓶中。将原生质体颗粒重新悬浮在 1 mL 的 W5 溶液中，并将其转移到闪烁瓶中。然后向每个样品中加入 5 mL闪烁液。在液体闪烁计数器上检测放射性。
9. 分析和呈现数据，如图 2 所示。
注： 14 C-百草枯废物按照大学同位素安全管理规定进行处置。

图2 ．数据分析和呈现。
（一个）计算14 C-百草枯在不同时间点在原生质体中的保留。
t=i： 14 C-百草枯原生质体流出的时间（0、10、20 和 40 分钟）。
CPM t=i ：不同时间点原生质体中14 C-百草枯放射性保留的平均值。
CPM t=0 ：初始时间原生质体中14 C-百草枯放射性保留的平均值。
A t = i ： 14 C-百草枯放射性在原生质体中在不同时间点相对于初始时间的保留百分比。
(B)在 Col-0 和DTX6过表达系 (OE-13) 中测量的原生质体中的百草枯保留 (Xia et al., 2021)。百草枯保留率定义为原生质体中负载的14 C-百草枯的百分比。值是平均值 ± SD (n = 3)。不同字母表示显着差异（P < 0.05；单因素方差分析）。

食谱_

1. W5解决方案
154 毫米氯化钠
125 毫米氯化钙2
5 毫米氯化钾
2毫米MES
酸碱度 5.7

致谢

该协议改编自以前的工作（张等。 , 2014;秦等。 , 2021) ;我们要感谢这些研究的作者的协议。

利益争夺

没有声明利益冲突。

参考

1. Apel, K. 和 Hirt, H. (2004)。活性氧：新陈代谢、氧化应激和信号转导。 Annu Rev 植物生物学55：373-399。
2. Chen, R., Sun, S., Wang, C., Li, Y., Liang, Y., An, F., Li, C., Dong, H., Yang, X., Zhang, J. 和左杰（2009）。拟南芥_ PARAQUAT RESISTANT2基因编码一种 S-亚硝基谷胱甘肽还原酶，它是细胞死亡的关键调节因子。单元格 Res 19(12)：1377-1387。
3. Fujita, M., Fujita, Y., Iuchi, S., Yamada, K., Kobayashi, Y., Urano, K., Kobayashi, M., Yamaguchi-Shinozaki, K. 和 Shinozaki, K. (2012)。多胺转运蛋白的自然变异决定了拟南芥对百草枯的耐受性。 Proc Natl Acad Sci USA 109（16）：6343-6347。
4. 霍克斯，TR (2014)。植物对百草枯的抗性机制。害虫管理科学70（9）：1316-1323。
5. Huang, Y.、Zhan, H.、Bhatt, P. 和 Chen, S. (2019)。受污染环境中的百草枯降解：目前的成就和前景。前微生物10：1754。
6. Huang, YJ, Huang, YP, Xia, JQ, Fu, ZP, Chen, YF, Huang, YP, Ma, A., Hou, WT, Chen, YX, Qi, X., et al. （2022 年）。 AtPQT11 是一种 P450 酶，通过 N-去甲基化对百草枯进行解毒。 J 基因组学S1673-8527(22)00127-8。
7. Li, J., Mu, J., Bai, J., Fu, F., Zou, T., An, F., Zhang, J., Jing, H., Wang, Q., Li, Z.,等。（2013）。 Paraquat Resistant1 是一种定位于高尔基体的假定转运蛋白，参与百草枯的细胞内转运。植物生理学162（1）：470-483。
8. 罗，C.，蔡，XT，杜，J.，赵，TL，王，PF，赵，PX，刘，R.，谢，Q.，曹，XF，和向，CB （2016）。 PARAQUAT TOLERA NCE3 是一种 E3 连接酶，通过靶向组蛋白修饰蛋白甲基转移酶 4b 来关闭激活的氧化反应。公共科学图书馆基因 12 ：e1006332。
9. Lv, Z., Zhao, M., Wang, W., Wang, Q., Huang, M., Li, C., Lian, Q., Xia, J., Qi, J., Xiang, C.,等。（2021 年）。将 MATE 家族蛋白 DTX6 中的 Gly311 变为酸性氨基酸可增强拟南芥对二氢吡啶类除草剂的抗性。摩尔厂14（12）：2115-2125。
10. Nazish, T., Huang, YJ, Zhang, J., Xia, JQ, Alfatih, A., Luo, C., Cai, XT, Xi, J., Xu, P. 和 Xiang, CB (2022)。了解拟南芥中的百草枯抗性机制，以促进抗百草枯作物的开发。植物公社 3(3)：100321。
11. Qin, P., Zhang, G., Hu, B., Wu, J., Chen, W., Ren, Z., Liu, Y., Xie, J., Yuan, H., Tu, B.,等。（2021 年）。叶衍生的 ABA 通过转运蛋白介导的温度敏感机制调节水稻种子发育。科学进阶7（3）： eabc8873。
12. Xi, J.、Xu, P. 和 Xiang, CB (2012)。 AtPDR11（一种定位于血浆膜的 ABC 转运蛋白）的缺失赋予了拟南芥对百草枯的耐受性。植物 J 69(5)：782-791。
13. Xia，JQ，Nazish，T.，Javaid，A.，Ali，M.，Liu，QQ，Wang，L.，Zhang，ZY，Zhang，ZS，Huang，YJ，Wu，J.，等。（2021 年）。 MATE 家族转运蛋白 DTX6 的功能获得性突变赋予拟南芥对百草枯的抗性。摩尔厂14（12）：2126-2133。
14. Yoo, SD, Cho, YH 和 Sheen, J. (2007)。拟南芥叶肉原生质体：用于瞬时基因表达分析的多功能细胞系统。国家协议2(7)：1565-1572 。
15. Zhang, H.、Zhu, H.、Pan, Y.、Yu, Y.、Luan, S. 和 Li, L. (2014)。 DTX/MATE 型转运蛋白促进脱落酸流出并调节拟南芥的 ABA 敏感性和耐旱性。摩尔厂7(10)：1522-1532。