材料和试剂

消耗品
1. 14 mL培养管（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：149566B）
2. 培养皿（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：FB0875713）
3. 多通道水库（Fisher Scientific， Biotix TM ，目录号：12111089）
4. 深孔96孔板（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：12566611）
5. 黑壁96孔微孔板（Fisher Scientific，Greiner-Bio，目录号：07-000-166）
6. 透气微孔板密封盖（Fisher Scientific， Andwin Scientific，目录号：NC1660916）
7. 1 mL比色皿（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：14955128）
8. PCR 条（Fisher Scientific， BrandTech ，目录号：14380941）
9. 血清移液管（Fisher Scientific，Basix，目录号：14-955-235）
10. 15 mL锥形管（Fisher Scientific，Basix，目录号：14955237）
11. 接种环/牙签（环： Fisherbrand TM ，目录号：22-363-602）

B. subtilis菌株可在此处获得： https ://bgsc.org/search.php?Search=bDS
相关注释 DNA 序列可在原始自然通讯出版物的补充数据中找到： https ://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-021-25691-4/MediaObjects/41467_2021_25691_MOESM6_ESM.zip

非标准氨基酸
1. L-4,4-联苯丙氨酸（ BipA ）（ Peptech ，目录号：AL506）
2. L-4-叠氮基苯丙氨酸（ pAzF ）（ abcr -GmbH，目录号：AB308874）
3. 香豆素-nsAA （ CouAA ）（Sigma-Aldrich，目录号：792551）
4. L-4-苯甲酰基苯丙氨酸（ BpA ）（ Peptech ，目录号：AL660）
5. L-4-Boc-赖氨酸（ boc -K）（Chem Impex Int'l，目录号：00363）
6. L-5-羟基色氨酸（5OHW）（Sigma-Aldrich，目录号：107751）
7. L-4-甲基-苯丙氨酸（4MeF）（Peptech ，目录号：AL096）
8. L-4-炔丙基氧基-苯丙氨酸（ pPrF ）（Combi-Blocks，目录号：QW-3179）
9. L-4-氨基-苯丙氨酸（4AmiF）（Peptech ，目录号：AL305）
10. L-4-氨基甲基-苯丙氨酸（4AmiMeF）（Peptech ，目录号：AL300）
11. L-苯戊酸，α-氨基（ BzpA ）（ Peptech ，目录号：AL514）
12. L-4-硝基-苯丙氨酸（ pNitroF ）（ Peptech ，目录号：AL061）
13. L-4-氰基-苯丙氨酸（ pCNF ）（Fisher Scientific，目录号：AAH63572MD）
14. L-4-氟代苯丙氨酸（ pFF ）（ Peptech ，目录号：AL021）
15. L-4-碘-苯丙氨酸（ pIF ）（ Peptech ，目录号：AL261）
16. L-4-乙酰基-苯丙氨酸（ pAcF ）（ Peptech ，目录号：AL624）
17. L-4-甲氧基-苯丙氨酸（4MeOF）（Alfa aesar ，目录号：H63096）
18. L-2-萘丙氨酸（ NapA ）（ Peptech ，目录号：AL121）
19. L-联吡啶基苯丙氨酸 ( biPyrA )（不再市售）
20. L-4-叔丁基-酪氨酸（ tBut -Y）（Sigma-Aldrich，目录号：533130）

其他试剂
1. IPTG（热 Scientific TM ，目录号： FERR0392）
2. 葡萄糖（热 Scientific TM ，目录号： AA1109036）
3. 谷氨酸（ Acros Organics，目录号：156211000）
4. 硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
5. 无水氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
6. 氯化钙，二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
7. 氯化锰（Sigma-Aldrich，目录号：416479）
8. 无水氯化锌（Fisher Scientific，目录号：AA1235722）
9. 硫胺素-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
10. 盐酸（10N）（RICCA Chemical Company，目录号：3770-32）
11. 无水氯化铁（III）（Fisher Scientific，目录号：AAA1628122）
12. 磷酸钾（一元）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
13. MOPS（游离酸）（Fisher Scientific，TCI America，目录号：M0707）
14. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
15. 硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4000）
16. 磷酸盐缓冲盐水（片剂形式）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
17. 氢氧化钠（ Acros Organics，目录号：134070010 ）

媒体
1. LB Broth，Lennox（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP9722500）
2. LB琼脂，Lennox（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP9745500）
3. S750（1 升）（见食谱）
4. 氨 S750（1 L）（见食谱）
5. 10 × S750 盐（1 L）（见食谱）
6. 100 ×金属 (500 mL)（见配方）

设备

注意：设备规格主要是建议，因为该协议已针对一系列不同的仪器进行了验证。

1. -80 °C 冰箱
2. 培养箱（ Thermo Scientific，目录号： 51-028-065HPM）或摇动培养箱（ Infors -HT Multitrons ）
3. 酶标仪（在 Molecular Devices SpectraMax i3X 或BioTek H1M Synergy 上执行的协议）
4. 分光光度计（ Thermo Scientific，目录号：840301000）
5. 板振荡器（ Thermo Scientific，目录号： 88882005）
6. 转子鼓（ FisherBrand ，目录号：14-251-251）
7. 移液器（Fisher Scientific、Eppendorf Research Plus）
8. 移液器（Fisher Scientific，Eppendorf EasyPet 3，目录号：12-654-105）
9. 涡流混合器（Scientific Industries，Inc. Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）

软件

1. Excel
2. 与使用的读板器相关的软件

程序

A. 适用于试管和 96 孔板的 S750 协议
1. 从 -80 °C 冰箱中取出含有所需枯草芽孢杆菌菌株的甘油库存。将甘油库存中的条纹细胞转移到 LB 琼脂板上。抗生素可能对确认菌株身份有用，但不是必需的，因为掺入构建体是稳定的整合。在 37°C 下孵育过夜。有关应包含在每个实验中的基本控制，请参阅注 1。
2. 第二天，从 LB 板中挑选所需的菌落，并将其转移到培养管中的 1 mL S750 培养基中。通过上下吹打大力混合以分解生物膜并促进悬浮生长。这些用作实验的种子培养物，而不诱导异源基因表达。有关可选介质条件，请参见注 2。
3. 在 37°C 摇动培养箱或转子鼓中生长4-6小时，OD 介于 0.2 和 0.7 之间。
4. 通过将所需的 IPTG 和nsAA添加到 S750来准备实验介质（将用于诱导异源基因表达和nsAA掺入）。 IPTG 最终浓度为 1 mM，即 1,000 × 1 M 储备溶液。 IPTG 通常添加到包括nsAA在内的所有培养物中，但滴定的情况除外；对于双滴定，请参见图 1。大多数酪氨酸衍生的nsAA的nsAA终浓度通常为 100 μM 。 1 mM 应用于boc -K、5OHW 和CouAA 。同样，其他浓度也可用于滴定（参见图 1 示例）。由于与其同源合成酶的结合不同，不同的nsAA将表现出不同的滴定动力学。
a. 对于 96 孔板格式，建议的更高通量策略是在 15 mL 管中制备每个nsAA独有的主混合介质，然后转移到储液罐中，并通过 1 mL 多通道将300 μL分配到 2 mL 深孔板中.根据我们的经验，在深 96 孔板格式中，超过 300 μL 的培养体积不能很好地通气。有关建议的媒体布局，请参见图 2。
b. 对于单培养管，出于通气原因，每管使用不超过 1 mL 培养基。

ns AA和转录诱导剂的双重滴定。
pHyperspank启动子控制下的 UAG-mNeongreen 构建体以不同水平的nsAA和 IPTG 表达。使用低水平的 IPTG 和nsAA滴定，可以进行非常敏感的诱导。将信号标准化为阳性对照构建体，其中 TAC酪氨酸密码子取代了 UAG 终止密码子并提供了 1 mM IPTG。有关详细信息，请参阅数据分析。

图 2. 便于装板的建议板布局。
这种板布局易于使用多通道移液器进行设置，并且误差最小。

5. 测量种子培养物的 OD，然后用额外的 S750 稀释它们，以所需细胞的理论密度 0.002 开始实验培养物。
a. 对于 96 孔板设置，在 PCR 管中使用 S750 将培养物稀释至 OD 0.2，然后根据需要使用多通道在板上分配 3 μ L ，以在 300 μ L实验介质中实现最终 OD 为 0.002 。
b. 对于单培养管，适当稀释培养基至最终 OD 0.002。例如，将 4 μ L的 OD 0.5 种子培养物添加到含有 IPTG 和nsAA的 1 mL S750 中。
6. 过夜孵育管/板，在 37°C 下摇动。
a. 对于 96 孔深孔板，盖上透气盖（见注 4b）。示例数据在图 3a 中。
b. 对于时间课程中使用的透明底浅 96 孔板，盖上透明透气盖。摇动应该设置为快速，尽管可以使用她的轨道或双轨道。每 5 – 10 分钟读取一次 OD 600和荧光。对于mNeongreen记者来说，488/530 的读数是可以接受的，尽管 mNeongreen 可以使用许多不同的过滤器设置。图 3b 中的示例数据。
7. 对于单培养管，在 37°C 摇动培养箱或转子鼓中生长。
8. 在一夜之间增长后读取端点数据。过长的生长期会看到一些信号减弱，但通常在 14 到 24 小时之间就足够了。
a. 对于荧光读数，用 PBS 1:1 稀释培养物，彻底混合，将 200 μL转移到透明底板，并读取 OD 和荧光。如果使用的nsAA本身是荧光的，例如CouAA ，则旋转细胞并在 PBS 中洗涤 2 到 3 次，然后在 PBS 中重新悬浮以进行读板器实验。如果尝试显微镜检查，请在 1.5 mL 管中进行洗涤，在每种情况下小心地去除尽可能多的洗涤液，并通过移液器彻底重悬颗粒。 CouAA 的宽荧光光谱会产生非常高的背景，除非它被充分洗掉。
b. 对于nanoLuciferase读数，将 100 μL培养物加入板中，取 OD，然后加入 100 μL Nano - Glo荧光素酶试剂。 Nano-Glo 将裂解细胞，使添加后的 OD 测量值不可靠。

图 3. nsAA合并数据。
( A) nsAA合并的端点数据，对不同的AARS使用不同的 nsAA： BipA用于biparS ， pAzF用于napARS ， CouAA用于CouRS ， BpA用于bpaRS ， boc -K 用于AbkRS 。如数据分析中所述处理的数据。平均生物学三次；误差线代表标准偏差。 (B) 加入nsAA的时间课程；阴影区域是生物一式三份之间的标准偏差。

B. 与氨 S750 结合的变体（增长较慢、可靠性较低、更容易进口）
1. 当试图掺入不能很好地导入细胞的nsAA时（可能是由于体积大且疏水），可以通过使用缺乏竞争性氨基酸的培养基来改善导入，例如 S750，其中氨是唯一的氮源（见配方对于氨 S750)。
2. 芽孢杆菌将在该培养基中生长并发生掺入，但速度明显要慢得多。用氨 S750 替换种子培养和实验介质，并分配大约 50% 的生长时间，特别是对于种子培养，这可能需要 6-8 小时才能达到足够高的 OD 用于播种（最小 OD 约为 0.2）。

C. 与 LB 结合的变体（可靠性较低、背景较高、细胞导入受阻）
1. 用 LB 替换 S750 LB 起始培养和实验培养。
2. 旋转细胞并用 PBS 重悬。细胞不需要为了发光而旋转。

数据分析

nsAA合并的数据分析很简单，结果应该可以从原始数据中解释而无需操作，如图 4 所示。但是，要获得最终数据，请按照以下步骤操作。有关数据处理的示例，另请参见补充Excel文件 1 。
1. nsAA的 WT 对照的荧光/发光数据的平均生物学复制，然后从所有样品的荧光/发光值中减去该值的 90%。由于没有nsAA的低背景合成酶往往会产生非常少的可观察到的背景掺入，如果减去完整的 WT 背景，则nsAA荧光值通常为负值。这使绘图和下游数据分析变得复杂，例如确定折叠感应。由于 WT 荧光非常低，90% 和 100% 之间的差异非常小——通常小于三个 WT 生物复制之间的标准偏差。这会产生背景标准化的合并数据。
2. 从 OD 值中减去读板器背景 OD（从读取空白介质孔；每个给定的读板器应该是恒定的）。对于许多读板机来说，这个值可以在 0.001 到 0.04 之间。这导致标准化的 OD 数据。注意任何特别低的 OD 值，并考虑来自那些可疑的井的数据。此处描述的大多数nsAA不应显着阻碍增长，但 5OHW 除外，据观察它会降低最终 OD。
3. 将背景标准化合并数据除以标准化 OD 数据。这会产生 OD 归一化的掺入数据。跳过此步骤进行时间过程分析。
4. 将所有平均值除以来自缺乏 TAG 终止密码子的 TAC 阳性对照的 OD 标准化荧光/发光数据。这导致最终数据作为蛋白质表达的一部分而没有nsAA掺入。有关示例，请参见图 4 和补充 Excel 文件 1 。
5. 使用三个生物复制品之间的标准差来绘制误差线。

图 4. 数据分析示例。
(A) 来自读板器的原始荧光数据，没有标准化。 (B) 根据数据标准化处理的数据，减去背景，OD 标准化，并标准化为缺乏 UAG 密码子的记者的最大可能表达。

笔记

1. 始终包括 WT B. subtilis (Py79) 作为阴性对照和 TAC 报告阳性对照菌株，以正确规范实验到实验的信号。 TAC 报告基因阳性对照包含编码酪氨酸的有义密码子 TAC，而不是在报告蛋白中nsAA掺入所需位点的无义密码子 TAG。如果nsAA的掺入率不是限制因素，它可以衡量预期的蛋白质表达量，并在实验中标准化数据。这些菌株可以通过 BGSC 获得（参见材料和试剂）。
2. 向起始培养物中添加诱导剂是可选的，但不推荐，因为它似乎对最终信号没有任何影响。发酵剂和实验培养物中的抗生素也是可选的，但对于稳定整合的构建体来说是不必要的，并且会减缓生长。确保不要在 WT 对照中添加抗生素。
3. 起始培养物
a. 该协议建议从菌落而不是冷冻库存开始培养。可以从冷冻库中开始培养，但以这种方式生长的发酵剂培养物生长不可靠，通常需要更长的时间才能达到合适的 OD。对于来自旧板的培养物（> 2-3 天）也是如此。如果需要，可以使用这两种方法，但要确保细胞在从种子培养物开始实验培养之前至少经历了两次加倍。
b. 高于 0.7 的 OD 确实适用于发酵剂培养物，但结果不会那么可靠。
4. 协议变体
a. ，基本的 300 μ L S750 读板器端点合并协议非常可靠。在测试新的合成酶或nsAA时，首先执行该协议以证明合并是有效的，然后再尝试更大的培养物、更丰富的媒体或其他协议变体。
b. 由于芽孢杆菌需要通气，最好以 3 mm 的轨道体积以 1,000 rpm 的速度摇晃 96 孔板过夜。然而，在标准培养箱的 250 rpm 过夜摇动下，在 96 孔板中观察到了稳健的掺入。
c. 在尝试纯化含有蛋白质的nsAA时，发现革兰氏阳性BugBuster试剂盒对于从在 S750 中过夜生长的静止期枯草芽孢杆菌中纯化蛋白质非常有效。
5. 背景归一化
a. 一般来说，在基于 OD 的数据分析过程中，不需要更改背景扣除。这是因为S750 中的枯草芽孢杆菌具有相对较低的自发荧光，并且在过夜生长后，几乎所有培养物都会达到饱和。
b. 然而，其他介质，如 LB，将具有更高的自发荧光和可能更多可变的 OD。在这些情况下，可能需要创建线性自发荧光归一化曲线，其中测量不同 OD 的几种不同 WT Py79 培养物，然后绘制，并创建线性自发荧光曲线。然后可以使用该曲线来减去基于 OD 的自发荧光。

食谱

1. S750（1升）
100 mL 10 × S750 盐
10 mL 100 ×金属
10 毫升 1 M 谷氨酸
20 毫升 50% 葡萄糖
860 毫升 ddH 2 O
2. 氨水S750（1升）
100 mL 10 × S750 盐
10 mL 100 ×金属
20 毫升 10% w/v 硫酸氨
20 毫升 50% 葡萄糖
850 毫升 ddH 2 O
3. 10 × S750 盐（1 升）
104.7 g MOPS（游离酸）
13.2 克无水硫酸氨
6.8 克无水磷酸二氢钾
至 1 L 与 ddH 2 O
4. 100 ×金属 (500 毫升)
100 毫升 1 M 氯化镁
35 毫升 1 M 氯化钙
2.5 毫升 1 M 氯化锰
5 mL 10 mM 氯化锌
25 mL 的 2 mg/mL 硫胺素-HCl
1 mL 1 M HCl
5 mL 50 mM 氯化铁 (III)
326.5 毫升 ddH 2 O

致谢

这项工作得到了 NSF 合作研究资助 MCB-2027074（给 ECG）和 MCB-2027092（给 AMK）的支持。 MAJ 的部分资金来自教育部 - 国家需要领域的研究生援助 (P200A210065) 和美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的化学-生物学接口培训补助金 (T32GM133395)。
该协议改编自Stork 等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明了以下相互竞争的利益： AMK 在 Nitro Biosciences 拥有相关的经济利益。

参考

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