材料和试剂

1. 移液器吸头 10 μL、200 μL 和 1,250 μL（BEAVER，目录号：43140、43143、43152）
2. 移液器套件（Gilson，目录号：GFAM00140）
3. 离心管 15 mL 和 50 mL（BEAVER，目录号：43008、43009）
4. EP管1.5 mL（AXYGEN，目录号： MCT-150-CS）
5. 细胞培养板 6 孔、48 孔、24 孔和 96 孔（CORNING，目录号：3516、3548、3526、3599）
6. 100 mm细胞培养板（BEAVER，目录号：43701）
7. HNSC 细胞系 SAS（RIKEN BRC，目录号：RCB1974）
8. 人胚胎肾细胞系HEK293T（ATCC，目录号：CRL-3216）
9. 牛生长血清（HyClone，目录号：SH30541.03）
10. Dulbecco改良的Eagle培养基，DMEM（Gibco，目录号：31966047）
11. 链霉素-青霉素（Gibco，目录号：15140122）
12. 胰蛋白酶-EDTA （Gibco，目录号：25300096）
13. Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668019）
14. Opti-MEM（Gibco，目录号：51985026）
15. EJ2GFP-puro （Addgene，目录号：44025）
16. pQCXIH -I-SceI （来自加利福尼亚大学旧金山分校 John P. Murnane 博士的礼物）
17. 嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P8833）
18. Hygrovetine （Selleck，目录号：S2908）
19. 带有细胞训练器c ap的圆底管， 5 mL （ Falcon，目录号：38030 ）
20. LY2157299（SelleckChem，目录号：S2230）
21. 奥拉帕尼（LC Laboratories，目录号：O-9201）
22. PBS（见食谱）
23. SAS /HEK 293T 中等（见食谱）

设备

1. 细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026283）
2. Neubauer 计数室（Carl Roth，目录号：PC72.1）
3. 离心机（Eppendorf，目录号：5804）
4. CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter，目录号： B49008AC ）

软件

1. 用于 FACS 分析的 FlowJo 软件

程序

A. EJ2GFP-puro稳定整合到 SAS 细胞中
1. 转染前 24 小时，将 SAS 细胞置于 6 孔板中，温度为 5 × 每孔10 5 个细胞。每口井包含 2 毫升的 SAS 培养基。
2. 对于每口井，准备一个混合 A 和一个混合 B，每个都在 1.5 mL 管中。用手指轻弹轻轻混合并孵育 5 分钟。

3. 将 Mix A 加入 Mix B，轻轻混匀，室温孵育至少 20 分钟。
4. 用 2 mL 的 1× PBS 清洗细胞两次后，吸出 PBS。
5. 将混合物加入 SAS 细胞后，在37°C 和5% CO 2下孵育。
6. 孵育 6 小时后，将混合物更换为含有 2 mg/mL 嘌呤霉素的SAS培养基。
7. 更改每 2 – 3 天加入 2 mg/mL 嘌呤霉素的SAS培养基，直至细胞达到 80 %–90% 融合。
8. 用胰蛋白酶-EDTA 对细胞进行胰蛋白酶处理并计数。
9. 将 60 个细胞与新鲜 SAS 培养基（含 2 mg/mL 嘌呤霉素）混合，形成 6 毫升细胞悬液。
10. 在 96 孔板的每个孔中加入 100 μL的细胞悬浮液（边缘孔为100 μL的PBS ）。
11. 电镀四小时后，只用一个细胞记录孔，以供后续筛选。
12. 当汇合超过 50% 的孔面积时，种子细胞逐渐进入 48 孔板、 24 孔板和 6 孔板。选择最佳条件下的细胞系进行扩增和后续实验。由于所选的单克隆细胞系有可能对嘌呤霉素具有抗性并且没有成功转染 EJ2GFP-puro，因此其他单克隆 EJ2-puro-SAS 细胞也需要冷冻保存。

B. I-SceI 诱导的 DSB 的产生
1. 逆转录病毒制备
a. 包装前一天，将 5 × 10 6 HEK 293T 细胞置于 100 mm 细胞培养板上包含 10 毫升HEK293T培养基。
b. 准备一种溶液 A 和一种溶液 B，分别装在 1.5 mL 管中。轻轻混合并孵育 5 分钟。
零件解决方案 A 解决方案 B
pQCXIH-I-SceI 20微克 -
脂质体2000 - 75 微升
Opti-MEM 至 1,250 μL 1,125 微升
全部的 1,250 微升 1,250 微升

c. 将溶液 A 和溶液 B 混合在一起，在室温下放置至少 20 分钟。
d. 用 10 mL 的 1× PBS 清洗 HEK 293T 两次。
e. 将混合物（溶液 A 和溶液 B）加入 HEK 293T 并孵育 6 小时在 37 °C和 5% CO 2下。
f. 孵育 6 小时后，取出转染培养基，换上新鲜的 HEK293T 培养基。 C继续在 37 °C 和 5% CO 2下孵育。
g. 72 小时后，收获含有病毒的培养基。含有病毒的培养基可在 4 °C 下临时储存3 天，或在 -80 °C冰箱中储存约 6 个月。
2. 在 SAS 单元中使用 I-SceI 生成 DSB
a. 感染前一天，将单克隆 EJ2-puro-SAS 置于 6 孔板中（含 2 mL SAS 培养基）每孔 5 × 10 5 个细胞。
b. 用 1 mL 的含病毒培养基和 1 mL 的SAS培养基的混合物孵育单克隆报告细胞 24 小时。
c. 24 小时后，用新鲜的含有 400 mg/mL 潮霉素 10 天的SAS培养基。每 2-3 天刷新一次培养基。 GFP 表达细胞在荧光显微镜下清晰可见（图2 ）。

图2 。荧光显微镜下 GFP 表达细胞的代表性图像
SAS (A) 不带外或 (B) 带 I-Scel 转染的图像。比例尺= 10 µm 。

C. 流式细胞仪检测 GFP +细胞
1. 1× PBS清洗受感染的细胞（至少 1 × 10 6 个细胞）两次，然后用胰蛋白酶消化成单细胞悬液。
2. 用 1× PBS 再次洗涤，以 500 ×g旋转5 分钟，重新悬浮在 1 mL 的 1× PBS 中，并迫使细胞通过带有细胞过滤器盖的流管。
3. 在流式细胞仪上设置 GFP/FITC 区域的门，以检测 GFP +细胞的比例（图3 ）。两种经典抑制剂进一步验证了流式细胞仪检测 Alt-EJ 的效率。一是TGFBR1 抑制剂LY2157299，导致 Alt-EJ 水平上调。另一个是 PARP1 抑制剂奥拉帕尼，导致 Alt-EJ 水平下调。如图所示如图 3 E 所示，我们改进的报告基因分析准确地反映了两种抑制剂对 Alt-EJ 水平调节的影响。

图3 。流式细胞仪检测 GFP + SAS 细胞。
(A) 没有 I-SceI 表达的阴性对照。 (B) 使用 I-SceI 表达式进行控制。 (C)用 LY2157299 抑制 T GFBRI （0.4 μmol/L 48 小时）以增加 Alt-EJ。 (D) 用 Olaparib 抑制 PARP1 (10 μmol/L for 48 h ) 减少 Alt-EJ。 ( E) SAS-EJ2-puro的GFP 阳性细胞百分比。 NC ：阴性对照； *P < 0.05； ***P < 0.001。

食谱

1. 1× PBS
溶解137毫米氯化钠， 2.7毫米 KCl、 7.5 mM Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 和9.1 mM 1 L ddH 2 O (pH 7.4)中的KH 2 PO 4 。
2. SAS /HEK 293T 中等的
445 mL 的 DMEM 辅以 50 mL 的牛生长血清和 5 mL 的链霉素-青霉素。

数据分析

流式细胞仪
1. 通过设置前向散射与侧向散射的图来控制感兴趣的细胞。
2. 使用前向散射高度与前向散射面积不包括双峰。
3. 未转染的细胞用作阴性对照，以鉴定用于检测 GFP 表达阴性细胞的门。然后使用这个门来评估转染后靶细胞中 GFP 的表达水平。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（82073007；QL）的资助。作者希望感谢 Jeremy Stark 教授、Mary Helen Barcellos-Hoff 教授、感谢 John Murnane教授和 Trevor Jones 先生对本研究结果的帮助和支持。此处描述的协议改编自之前的研究（ Gunn等人，2012； Muraki等人，2013）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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5. Gunn, A. 和 Stark, JM (2012)。基于 I-SceI 的分析，用于检查哺乳动物染色体双链断裂的不同修复结果。方法 Mol Biol 920：379-391。
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15. Valikhani, M., Rahimian, E., Ahmadi, SE, Chegeni, R. 和 Safa, M. (2021)。血液系统恶性肿瘤中经典和替代非同源末端连接途径的参与：治疗的靶向策略。 Exp Hematol Oncol 10（1）：51。
16. Wang, M.、Chen, S. 和 Ao, D. (2021)。靶向癌症中的 DNA 修复途径：机制和临床应用。医学通讯 (2020) 2(4): 654-691。