材料和试剂

1.5 mL无菌管（ Sudelab ，目录号：1002208）
250 mL Beckman管（Beckman Coulter，目录号：356011）
0.45-µm 过滤器（ACEFESA，Whatman，目录号：GE10462100）
1 - mL 石英比色皿（ Teknokroma ， Starna ，目录号：ST-29-F/Q/10）
96孔微孔板（Sarstedt，目录号：82.1581.100）
大肠杆菌BL21（DE3） pLysS感受态细胞（Sigma-Aldrich， Novagen ，目录号：69451-M）
pET-30 Xa /LIC 表达载体试剂盒（Sigma-Aldrich， Novagen ，目录号：70073）
ALDH/pET-30 Xa /LIC 构建体（ Proteogenix ，定制订单目录号：GS-GS002 -基因合成服务-和 GS-SBG03 -亚克隆到基因 <3,000 bp 的表达载体中； https://www.proteogenix.science/custom-gene-synthesis/ ）
卡那霉素（ Kn ）（Sigma-Aldrich，目录号：60615）
氯霉素（Cm）（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Kolle 手柄环（ Auxilab ，P. SELECTA，目录号：BRG501）
胰蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：95039）
酵母提取物（ Thermo Fisher Scientific，目录号：212750）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
异丙基β - D -1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I202）
溶菌酶（Roche，目录号：10837059001）
DNase（Roche，目录号：10104159001）
Triton-X 100（Sigma-Aldrich，目录号：X-100）
苯基甲磺酰氟溶液（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：93482）
DL -二硫苏糖醇（ DTT）（ACEFESA， Panreac AppliChem，目录号：A1101）
PD 10 脱盐柱（GE Healthcare，目录号：17-0851-01）
考马斯亮蓝 R 250（Sigma-Aldrich，目录号：1.12553）
牛血清白蛋白（BSA）（Roche，目录号：10711454001）
Bradford 试剂（ACEFESA， Panreac AppliChem，目录号：A6932,0500）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
基准测试蛋白质阶梯（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10747012）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
溴酚蓝钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W328707）
甲醇（ MetOH ）（ACEFESA，LABKEM，目录号：MTOL-0GH-2K5）
乙酸（VWR，目录号：20103.295）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD + ）（Apollo Scientific，目录号：BIB3011）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原形式）（NADH）（Apollo Scientific，目录号：BIB3012）
己醛（Sigma-Aldrich，目录号：H9008）
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：M-2670）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐（NADP + ）（Apollo Scientific，目录号：BIB3013）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原形式）（NADPH）（Apollo Scientific，目录号：BIB3014）
p -硝基苯甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：72800）
LB培养基（见食谱）
2 × YT 培养基（见配方）
绑定缓冲区（见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
平衡缓冲液（见配方）
5 × TMR 充电缓冲器（见配方）
运行缓冲液（见配方）
考马斯蓝着色剂（见食谱）
去污溶液（见配方）
反应缓冲液 A（参见配方）
反应缓冲液 B（见配方）
反应缓冲液 C（见配方）
20 mM NAD +原液（见配方）
500 µM NADH 原液（见配方）
40 mM NADP +原液（见配方）
500 µM NADPH 原液（见配方）
2 mM 己醛（见配方）
2 mM对硝基苯甲醛（见配方）

设备

毕比科学TM Stuart TM块状加热器（Fisher Scientific，目录号：10489438）
恒温摇床（VWR，New Brunswick，型号： Innova ® 43 ）
紫外可见分光光度计（Agilent Technologies，型号：Cary 60）
离心机（Beckman Coulter，型号： Avanti ® J-26 XP）
定角转子（Beckman Coulter，型号： JA-14 ）
定角转子（Beckman Coulter，型号：JA-25.50）
声波分离器（Fisher Scientific，型号：Fisherbrand TM Model 705 ）
ÄKTA TM start FPLC（快速蛋白质液相色谱）纯化系统（ Cytiva ，目录号：29022094）
多板阅读器（Tecan，型号：Tecan ® Spark）
Bransonic清洁器（Fisher Scientific，型号： B200 )
PowerPac TM基本电源（Bio-Rad，目录号：1645050）
Cary Eclipse 荧光光谱仪（安捷伦科技）

软件

独角兽 7（GE Healthcare/ Cytiva ， https: //www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/software/unicorn-7-p-05649 ）
Spark Control TM (Tecan, https://lifesciences.tecan.es/multimode-plate-reader?p=tab--3 )
Cary WINUV（安捷伦科技， https: //www.agilent.com/en/product/molecular-spectroscopy/uv-vis-uv-vis-nir-spectroscopy/uv-vis-uv-vis-nir-software/cary- winuv 软件）

程序

使用常规热激法转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞与 ALDH/pET-30 Xa /LIC 构建体
解冻大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞。将 100 μL 的细胞悬浮液转移到 1 mL 无菌管中。
中添加 1 ng 的ALDH/pET-30 Xa /LIC 结构。
通过上下吹打轻轻混合，并在冰浴上孵育 5 分钟。
使用块状加热器在 42°C 下热休克电池30 秒。
注意：热休克不要超过 45 秒。
在冰浴上孵育 2 分钟。
立即向细胞中加入 1 mL 的 LB 培养基。
在 37°C 下孵育管 1 小时，以 250 rpm 搅拌。
16,100 × g离心机 5分钟。
去除 1 mL 的上清液并将颗粒重新悬浮在剩余的 LB 介质中。
100 μL 的细胞传播到含有50 μg/mL 卡那霉素 ( Kn ) 和 34 μg/mL 氯霉素 (Cm)的 LB 板上。
37°C 下孵育过夜 (O/N) 。
含有50 µg/mL Kn和 34 µg/mL Cm的 5 mL LB 培养基中挑选菌落并准备 O/N 培养。
用 400 μL 的 O/N 培养物和 100 μL 的 80% 甘油制备细菌甘油库存。
涡流。
将甘油库存储存在-80°C。

重组人 ALDH 酶的表达和纯化
大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS制备过夜 (O/N) 细胞培养物（25 mL LB 培养基）含有ALDH/pET-30 Xa /LIC 构建体的细胞储存在 -80 °C 的甘油原液中，浓度为 50 µg/mL Kn和 34 μg/mL Cm（使用 50 mg/mL Kn和 34 mg/mL Cm 溶液添加 25 μL 的每种抗生素）。
在无菌条件下使用 Kolle 手柄环接种细胞。
使用Innova 43 Incubator Shaker以 250 rpm的转速在 37 °C 下孵育 O/N 。
使用分光光度计测量 595 nm 处的光密度 (OD)，并在1 L 的 2 × YT 中接种 25 mL 的 O/N 培养物，使用50 µg/mL Kn和 34 µg/mL Cm（添加 1 mL 的每种抗生素使用50 mg/mL Kn和 34 mg/mL Cm 溶液）。
孵育直到 OD 595为 0.8。
收集 1 mL 等分的预诱导细胞培养物，并将其保持在 -20 °C 以进行进一步的电泳分析（预诱导等分）。用 1 mM IPTG 诱导剩余的培养物。
在 22°C 下在轨道摇床上孵育 O/N，并在 250 rpm 下搅拌。
收集 1 mL 等分的 IPTG 诱导后细胞培养物，并将其保持在 -20°C 以进行进一步的电泳分析（诱导后等分）。
在 250 mL 贝克曼管中分配培养物。
在 12,400 × g （JA-14 转子）和 4 °C 下离心 10 分钟。
丢弃上清液并用 35 mL 的 20 mM Tris/HCl、0.5 M NaCl 和 5 mM 咪唑重悬颗粒，pH 8.0（结合缓冲液）。
冻融裂解；将细胞提取物 O/N 保持在 -20 °C。
在室温 (RT) 下解冻细胞提取物。
添加 1 mg/mL 溶菌酶（700 μL 50 mg/mL 原液）、20 μg/mL DNase（350 μL 2 mg/mL 原液）、1% Triton-X 100（1.5 mL 20% 原液）、1 mM PMSF（350 μL 的 0.1 M 原液）和 5 mM DTT（175 μL的 1 M 原液）。
在轨道摇床上以 250 rpm 的转速在冰上孵育 20 分钟，以获得粘度较低的样品。
以 35% 的振幅声波 2 分钟（2 秒开 - 1 秒关）以获得均匀的样品溶液。
收集 1 mL 等分的超声样品，在 16，100 × g下离心20 分钟，并将可溶性部分和颗粒分别保持在 -20°C，用于进一步的电泳分析（分别在超声等分后的可溶性和不溶性部分）。继续进行纯化步骤。
在 15,000 × g （JA-25.50 转子）和 4 °C 下将超声样品离心 20 分钟。
通过 0.45 µm 过滤器过滤上清液。
收集 1 mL 等分的上清液并将其保持在 -20 °C 以进行进一步的电泳测试。继续进行纯化步骤。
使用ÄKTA TM FPLC 纯化系统，在镍电荷螯合Sepharose TM Fast Flow 5 mL 色谱柱 ( HisTrap ) 上设置亲和层析纯化。
加载样品后，在 20 mM Tris/HCl、0.5 M NaCl、1 M 咪唑、pH 8.0（洗脱缓冲液）中应用逐渐增加的咪唑梯度（5、60、100 和 250 mM）进行酶洗脱（图 1 ):
1% 咪唑，10 柱体积 (CV)，10 mL 馏分
5.5%咪唑，10 CV，10 mL 馏分
9.5% 咪唑，10 CV，10 mL 馏分
24.5% 咪唑，5 CV，1 mL 馏分

图 1. (His) 6 -ALDH 在使用ÄKTA TM FPLC 纯化系统的带镍螯合Sepharose TM Fast Flow 5 mL 色谱柱 ( HisTrap ) 上的 FPLC 洗脱曲线。
蓝线表示通过 280 nm 处的吸光度测量的洗脱蛋白质的量，绿线表示逐步咪唑梯度。 FT：流通或未结合的蛋白质部分。 WB：弱结合蛋白部分。 P：目标蛋白质的峰值。

收集 1 mL 等分的流通 (FT) 和弱结合 (WB) 蛋白质组分以进行进一步的电泳分析。
在 PD 10 脱盐柱中加入 2.5 mL 的洗脱蛋白样品（24.5% 咪唑分数），并用 3.5 mL 的 50 mM mM Tris/HCl、0.5 M NaCl、pH 8.0（平衡缓冲液）去除咪唑。
添加 5 mM DTT，并通过在液氮中快速冷冻并在 -20°C 下储存来制备 200 μL蛋白质等分试样。

通过 SDS-PAGE 制备和分析样品
准备八种牛血清白蛋白 (BSA) 稀释液作为校准曲线(Bradford, 1976) 在 96 孔板中的浓度范围为 2.5 至 40 µg/mL。
在 96 孔板（重复）中添加 5 μL 的每个 BSA 稀释液。
将 5 μL 的纯重组蛋白添加到 96 孔板（重复）中。
在每口井中加入 245 μL 的布拉德福德试剂并混合。
在 RT 中孵育至少 5 分钟且不超过 1 小时（He，2011）。
使用分光光度计测量 595 nm 处的吸光度。
16,100 × g和 4 °C 下将诱导前和诱导后的等分试样离心20 分钟。
丢弃上清液并添加 400 μL 的结合缓冲液以彻底重新悬浮颗粒。
添加 1 mg/mL 溶菌酶（8 μL 的 50 mg/mL 原液）、20 μg/mL DNase（4 μL 的 2 mg/mL 原液）、1% Triton-X 100（20 μL 的 20% 原液）和 1 mM PMSF（4 μL 的 0.1 M 储备溶液）。
在冰浴上孵育 20 分钟以获得粘度较低的样品。
在超声波浴中对诱导前和诱导后的裂解物进行声波处理 10 分钟。
注意：对于小体积，建议使用超声波浴代替声波分离仪（用于获得细胞匀浆，步骤 B.16）。
在超声处理后将 400 μL 的结合缓冲液添加到不溶性部分（步骤 A.16）。
准备 7 个含有 50 μL 的样品，通过 SDS-PAGE 进行分析，如下所示：
添加 25 μL 的每个纯化步骤样品（诱导前、诱导后、超声处理后的不溶性部分、超声处理后的可溶性部分、FT 和 WB）。
添加 15 μL 的 Milli-Q 水。
添加 10 µL 的 TMR 充电缓冲器 5 × 。
对于纯重组蛋白，根据 Bradford 蛋白质定量方法将 2 μg上样到 SDS-PAGE 上（包括高达 40 μL 的 Milli-Q 水，并添加 10 μL TMR 充电缓冲液 5 × ）。
在块状加热器中将样品在 95°C 下变性 10 分钟。
加载 10 μL 的BenchMark TM蛋白质梯子和 25 μL 的每个样品（图 2），并使用电泳Powerpac TM基本电源通过运行缓冲液中的 SDS-PAGE 组件施加 100 V 90 分钟。

图 2. ALDH 表达和纯化步骤的 SDS-PAGE 分析。
MW标记： BenchMark TM蛋白阶梯； a)诱导前的可溶部分； b) IPTG诱导后的可溶性部分； c) 超声处理后的不溶部分； d) 超声处理后的可溶部分； e) 亲和层析流通； f) 弱结合蛋白部分； g) 2 μg峰 P（感兴趣的蛋白质——ALDH 条带用箭头标记并且对应于大约 60 kDa，即 55 kDa 对应于 ALDH 亚基加上来自 His 标签的 5 kDa）。

在 RT 的染色容器中用 20 mL 的考马斯蓝染色 SDS-PAGE 凝胶，搅拌 20 分钟。
用 50 mL 的脱色溶液在 RT 搅拌时对 SDS-PAGE 凝胶 O/N 进行脱色。

测定 ALDH 比活性的酶法
使用己醛作为底物测定 ALDH1A1、ALDH1A2 和 ALDH2 的标准活性（表 2）
从反应缓冲液 A 中的相应酶原液中制备三种不同的酶稀释液（参见配方），以达到稳态动力学的合适活性。
注意：必须获得一系列酶浓度，其中底物氧化在初始速率条件下发生。
将反应缓冲液 A 的 830 μL（805 μL 用于 ALDH1A1 测定）添加到 1 mL 石英比色皿中。
制备含有 840 μL（ALDH1A1 测定为 815 μL）的反应缓冲液 A 的内标对照。
注意：内标对照比色皿包含测定混合物中包含的所有化合物，酶除外。
在每个 1 mL 石英比色皿中加载 10 μL 的每种酶稀释液，内部标准控制比色皿除外。
通过添加 25 μL 的 20 mM NAD +库存，在反应测定中将 NAD +辅因子稀释至 500 μM。
稀释NADH 在反应测定中加入 10 µL NADH 内标至 5 µM 库存在 500 µM。
注意：将 NADH 内标添加到所有比色皿中以建立基础检测信号。此外，在内部标准控制比色皿中，5 µM NADH 可以从相对荧光单位中获得绝对酶促速率（参见数据分析部分）。
轻轻倒置混合。
通过将 125 μL 的 2 mM 己醛底物原液添加到试管中，以 250 μM 的最终饱和浓度开始反应（对于 ALDH1A1，添加 150 μL 的 0.2 mM 己醛底物原液，并以 30 μM 的最终饱和浓度工作）。
注： ALDH1A1 (30 µM) 和 ALDH1A2 和 ALDH2 (250 µM) 的己醛饱和浓度不同(Pequerul et al., 2020) 。
使用 Cary Eclipse 荧光光谱仪在 340 nm 的激发波长下读取样品，并在 25 °C 下收集 460 nm 的发射荧光至少 600 秒。
使用己醛作为底物测定 ALDH1A3 的标准活性（表 2）
从反应缓冲液 B 中的相应酶原液中制备三种不同的酶稀释液（参见配方），以达到稳态动力学的合适活性。
将 830 μL 的反应缓冲液 B 添加到 1 mL 石英比色皿中。
准备一个包含 840 μL 反应缓冲液 B 的内部标准控制。
在每个 1 mL 石英比色皿中加载 10 μL 的每种酶稀释液，内部标准控制比色皿除外。
通过添加 25 μL 的 20 mM NAD +库存，在反应测定中将 NAD +辅因子稀释至 500 μM。
稀释NADH 通过加入 10 µL 的 500 µM NADH，在反应测定中内标至 5 µM 股票。
轻轻倒置混合。
通过在试管中加入 125 μL 的 2 mM 己醛底物库存溶液开始反应，最终饱和浓度为 250 μM。
使用 Cary Eclipse 荧光光谱仪在 340 nm 的激发波长下读取样品，并在 25 °C 下收集 460 nm 的发射荧光至少 600 秒。
对硝基苯甲醛作为底物测定 ALDH3A1 的标准活性（表 2）
从反应缓冲液 C 中的相应酶储备溶液中制备三种不同的酶稀释液（参见配方），以达到稳态动力学的合适活性。
将 830 μL 的反应缓冲液 C 添加到 1 mL 石英比色皿中。
准备一个包含 840 μL 反应缓冲液 C 的内部标准控制。
在每个 1 mL 石英比色皿中加载 10 μL 的每种酶稀释液，内部标准控制比色皿除外。
通过添加 25 μL 的 40 mM NADP +库存，在反应测定中将 NADP +辅因子稀释至 1 mM。
稀释NADPH 通过加入 10 µL 的 500 µM NADPH，在反应测定中内标至 5 µM 股票。
轻轻倒置混合。
通过添加 125 μL 的 2 mM 开始反应对硝基苯甲醛底物储备溶液进入比色皿，最终饱和浓度为 250 µM。
使用 Cary Eclipse 荧光光谱仪在 340 nm 的激发波长下读取样品，并在 25 °C 下收集 460 nm 的发射荧光至少 600 秒。

表 2. 用于不同 ALDH 酶测定的反应混合物的组成。
零件ALDH1A1、1A2、2ALDH1A3ALDH3A1
缓冲50 mM HEPES，pH 850 mM HEPES，pH 850 mM Tris/HCl，pH 8
镁2+-30毫米-
乙二胺四乙酸0.5 毫米--
数字地面电视0.5 毫米5毫米5毫米
NAD +0.5 毫米0.5 毫米-
国家发展计划+--1毫米
NADH5微米5微米-
NADPH--5微米
基质30 µM 己醛，用于 1A1
250 µM 己醛，用于 1A2 和 2250 µM 己醛250 µM p 硝基苯甲醛

数据分析

min·mg (U/mg)为单位计算比酶活性(Solobodowska et al. , 2012)
调整反应测定比色皿的斜率并获得对应于内标对照比色皿（5 µM NAD(P)H 内标）的相对荧光 (UF) 单位，
v =dF/dt×C_st/F_st
其中dF /dt是时间相关荧光的斜率， C st是 NAD(P)H 浓度， F st是标准荧光。

NAD(P)H time dependent production=slope (UF/s) × ((5 µM NAD(P)H)/(UF background)) 等式。 1

根据 eq 获得以 U/mg 为单位的绝对速率（图 3 和表 3）。 1

( µmol NAD(P)H)/(L·sec) × (1 L)/(10^3 mL) × (1 mL reaction)/(0.01 mL enzyme) × ( 1 mL )/( mg enzyme) × ( 60 sec)/(1 min) x enzyme dilution factor

图 3. Excel 表格的屏幕截图，显示了使用 eq. 计算 ALDH1A1 比活性的代表性原始数据。 1.

表 3. ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH2 和 ALDH3A1 的比活性（单位为 U/mg）
ALDH1A1ALDH1A2ALDH1A3ALDH2ALDH3A1
0.111.080.350.483.21

光谱仪在 25 °C 下测量酶活性。 ALDH1A1、ALDH1A2 和 ALDH2 在反应缓冲液 A. ALDH1A3 测定在反应缓冲液 B 中进行。NAD +浓度为 500 μM，并且以饱和浓度使用己醛作为底物。 ALDH3A1实验在反应缓冲液 C中测量。 NADP +浓度为1 mM，饱和浓度的对硝基苯甲醛用作底物。

笔记

人类 ALDH1A1、1A2、1A3、2 和 3A1 同种型已在异源系统中重组表达，并以可溶性和酶促稳定的活性形式纯化。
在三种 ALDH1A 酶中，ALDH1A1 在饱和己醛浓度下的比活性最低（0.11 U/mg），而 ALDH1A2 的比活性最高（1.1 U/mg）。 ALDH1A3 和 ALDH2 的中间速率分别为 0.35 和 0.48 U/mg。使用饱和浓度的对硝基苯甲醛的 ALDH3A1 的比活性为 3.21 U/mg，是这五种 ALDH 同工型中测得的最高活性。
ALDH1A3 是最依赖 DTT 的 ALDH1A 同种型。当 DTT 从反应缓冲液中除去时酶活性降低。将 5 mM DTT 添加到 ALDH1A3 反应缓冲液中时，比活性高 4 倍。因此，与 ALDH1A1 和 ALDH1A2 反应缓冲液相比，ALDH1A3 反应缓冲液的 DTT 浓度高出 10 倍。
与反应缓冲液组成相关，当在己醛作为底物存在的情况下研究镁离子的影响时，每种酶都观察到了非常不同的模式（Pequerul 等人，2020 年）。 ALDH1A3 的最高活性显示在 30 mM MgCl 2 ；因此，该 Mg 2+浓度存在于 ALDH1A3 反应缓冲液中。相反，螯合剂 EDTA 包含在 ALDH1A1、ALDH1A2 和 ALDH2 的反应缓冲液中。
必须使用一系列浓度的活性酶，其中底物氧化在初始速率条件下发生（参见步骤D1a）。
内标对照比色皿包含测定混合物中包含的所有化合物，但酶除外（参见步骤 D1c）。
将 NADH 内标添加到所有比色皿中以建立基础检测信号。此外，在内部标准对照比色皿中，5 µM NADH 使我们能够从相对荧光的单位中获得绝对酶促速率（参见步骤 D1f ）。
ALDH1A1 (30 µM) 和 ALDH1A2 和 ALDH2 (250 µM) 的己醛饱和浓度不同（参见步骤 D1h）。
通常，亲和纯化步骤后不会去除N 端 (His) 6标签，并将其保留用于后续的生化和结构研究。 N端延伸位于单体结构的外部，不影响ALDHs的稳定性、寡聚状态或酶活性（Pequerul et al., 2020; Castellví et al., 2022）。

声明摘要
该协议包括一种在还原条件下生产重组蛋白和亲和纯化的方法，该方法已应用于 ALDH 家族 1 和 3 亚型，以生产高产量的纯、可溶、稳定和催化活性蛋白（10 – 30 mg/L 培养物））。它还包括它们各自的酶活性测定，优化并基于 NAD(P)H 在 460 nm 的荧光发射，使用己醛（用于 ALDH1A1、1A2、1A3 和 2）或对硝基苯甲醛（用于 ALDH3A1）作为底物。该方法适用于蛋白质晶体学，以及在癌症和其他疾病的治疗中具有诊断和治疗潜力的底物和抑制剂的鉴定和表征。
充分支持了对研究 ALDH 的稳健协议的迫切需求，仅在过去五年中有 700 多篇索引出版物（数据提取自 PubMed 数据库，用作搜索术语ALDH和癌症）。此外，荧光 ALDH 底物与泛抑制剂N ， N' -二乙氨基苯甲醛（例如， Aldefluor TM测定法）广泛用于鉴定癌症干细胞中的 ALDH 同种型。这通常是一个误导性因素，会得出关于特定 ALDH 同种型身份的错误结论，因此需要寻找更具选择性的抑制剂来提高检测准确性（Zhou等人，2019 年，Ibrahim等人，2022 年）。最后，尽管 ALDH 异构体适合作为癌症治疗的药物靶点，但缺乏有效的选择性酶抑制剂可用于体内给药并转化为临床应用。我们的手稿在为 ALDH 建立和传播完全优化和验证的协议方面向前迈进了一步。

食谱

LB培养基
在 1 L Milli-Q 水中稀释 10 g 胰蛋白胨、10 g NaCl 和 5 g 酵母提取物。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0。
2 × YT 培养基
在 1 L Milli-Q 水中稀释 16 g 胰蛋白胨、5 g NaCl 和 10 g 酵母提取物。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0。
绑定缓冲区
在 1 L Milli-Q 水中稀释 0.34 g 咪唑（5 mM）、29.22 g NaCl（0.5 M）和 2.4 g Tris（20 mM）。使用 HCl 将 pH 值调节至 8.0。
洗脱缓冲液
在 200 mL 的 Milli-Q 水中稀释 13.61 g 咪唑 (1 M)、5.8 g NaCl (0.5 M) 和 0.48 g Tris (20 mM)。使用 HCl 将 pH 值调节至 8.0。
平衡缓冲液
在 1 L Milli-Q 水中稀释 29.22 g NaCl (0.5 M) 和 2.4 g Tris (20 mM)。使用 HCl 将 pH 值调节至 8.0。
5× TMR 充电缓冲器
稀释 8.55 g蔗糖 (0.5 M)、5 g SDS (10%)、1.89 g Tris (312.5 mM)、0.14 g EDTA (10 mM) 和 1.92 g DTT (250 mM) Milli-Q 水。调节 pH 至 6.9 并加入 25 mg 溴酚蓝。
运行缓冲区
在 1 L Milli-Q 水中稀释 30.2 g Tris (250 mM)、10 g SDS (10%) 和 140.3 g 甘氨酸 (1.87 M)。不要调节pH 值。
考马斯蓝着色剂
甲醇和 10% 乙酸中稀释 2.5 g/L 考马斯亮蓝 R 250 。
脱色液
准备60 mL 的 Milli-Q 水、30 mL 的MetOH和 10 mL 的乙酸。
反应缓冲液 A （用于 ALDH1A1、ALDH1A2 和 ALDH2 活性测定）
在 1 L Milli-Q 水中稀释 11.92 克 HEPES（50 毫米）、0.19 克 EDTA（0.5 毫米）和 0.077 克 DTT（0.5 毫米）。将 pH 值调节至 8.0。
反应缓冲液 B （用于 ALDH1A3 活性测定）
稀释 11.92 g HEPES (50 mM)、6.1 g MgCl 2 (30 mM) 和 0.77 g DTT (5 mM)。将 pH 值调节至 8.0。
反应缓冲液 C （用于 ALDH3A1 活性测定）
在 1 L Milli-Q 水中稀释 6.06 g Tris (50 mM) 和 0.77 g DTT (5 mM)。使用 HCl 将 pH 值调节至 8.0。
20 mM NAD +储备溶液
在相应反应缓冲液的 1 mL 中稀释 0.014 g NAD + 。
500 µM NADH 原液
在相应反应缓冲液的 1 mL 中稀释少量 NADH（大约是铲尖），并使用分光光度计测量吸光度。通过 Lambert-Beer 方程计算浓度 ( Abs = ε · c·l )，其中ε是 NADH 的摩尔吸收率 (6.22 mM -1 ·cm -1 )， c是 NADH 的浓度， l是比色皿的路径长度。对于基线，在 1 mL 石英比色皿中添加 995 μL 的相应缓冲液并建立零。然后，添加 5 μL 的 NADH 库存并通过反转混合。设置分光光度计扫描样品并获得 NADH 在 340 nm 处的吸光度。获取 NADH 的库存浓度，并在 1 mL 最终体积 ( C1 ·V1 = C2·V2 )中制备 500 μM NADH 的工作溶液。
40 mM NADP +储备溶液
在 1 mL 的反应缓冲液 C 中稀释 0.014 g。
500 µM NADPH 原液
在反应缓冲液 C 中制备 NADPH 储备溶液，如 500 μM NADH 储备溶液所述（参见配方 14）。
2 mM 己醛
在相应反应缓冲液的 40 mL 中稀释 9.84 μL 的己醛。
2 mM对硝基苯甲醛
在 40 mL 反应缓冲液 C 中稀释0.012 g对硝基苯甲醛。

致谢

这项研究由西班牙Ministerio de Ciencia e Innovación ( Agencia ) 资助 Estatal de Investigación ，授权号 PID2020 - 119424RB - I00 / AEI / 10.13039/501100011033）。 Raquel Pequerul通过与Universitat的研究合同协议获得了Advanced BioDesign公司的财务支持巴塞罗那自治。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的利益。

参考

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