材料和试剂

1. Lab-Tek II，4孔室载玻片（Thermo Fisher，Nunc，目录号：154526）
2. 腔室拆卸工具（包含在腔室滑轨中）
3. 玻璃 Coplin 罐，5 个载玻片类型（AsOne，目录号：4-567-01）
4. 注射器过滤器单元，PES 0.22 μm（Merk Millipore，目录号：SLGPR33RS）
5. 注射器过滤器单元，PVDF 0.45 μm（Merk Millipore，目录号：SLHVR33RS）
6. 矩形盘（ Eiken Chemical，目录号：AW2000）
7. 棉签
8. 纸巾（Nippon Paper Crecia ，目录号：37105）
9. 玻璃盖玻片，24 × 60 mm（ Matsunami Glass，目录号：C024601）
10. 指甲油（透明面漆）
11. 人类细胞系 U2OS 40-2-6 (Ishimoto et al., 2021)，一种 U2OS 衍生细胞系，携带由 U2OS 2-6-3 细胞产生的 lacO 阵列和 ER T2 -LacI 基因 (Janicki et al. , 2004 ) . U2OS 40-2-6 细胞和最初的U2OS 2-6-3 细胞包含大约 200 个拷贝的 256 个lacO重复序列（总共大约 50,000 个lacO序列拷贝）。该阵列稳定整合到染色体 1 的染色体基因座 1p36 中。
12. Dulbecco 改良 Eagle 培养基（D-MEM）（含 L-谷氨酰胺的高葡萄糖）（例如，Wako，目录号：043-30085）
13. 胎牛血清（FBS）（例如，Nichirei，目录号：175012）
14. RO-3306（例如，Sigma-Aldrich，目录号：SML0569）
15. 4-羟基三苯氧胺（4-OHT）（例如，Abcam，目录号：ab141943）
16. 乙醇（例如，Nacalai Tesque，目录号：14713-53）
17. 10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如，Wako，目录号：048-29805），稀释至1×
18. 溴脱氧尿苷（BrdU）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：B5002）
19. 生理盐水（例如，大冢生理盐水、大冢制药）
20. PIPES（例如，Dojindo，目录号：347-02224）
21. 0.1 M EGTA-2Na 溶液（例如，Nacalai Tesque，目录号：37346-05）
22. Triton X-100（例如，Wako，目录号：169-21105）
23. MgCl 2 （例如，Wako，目录号：133-00165）
24. 37％甲醛溶液（例如，Nacalai Tesque，目录号：16223-55）
25. 兔抗 LacI 抗体，自制（Ishimoto 等人，2021）
26. 硫柳汞（例如，Nacalai Tesque，目录号：21624-74），用水溶解至 10% (w/v)
27. Alexa 594 驴抗兔 IgG（Molecular Probes，目录号：A21207）
28. 甲醇（例如，Nacalai Tesque，目录号：21915-93）
29. HCl（例如，Wako，目录号：080-01066），稀释至 1 M
30. 小鼠抗BrdU抗体，克隆：3D4（BD Pharmingen，目录号：555627）
31. Alexa 488山羊抗小鼠IgG（Molecular Probes，目录号：A11029）
32. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（例如，Wako，目录号：043-18804）
33. Fluoro -KEEPER 抗褪色试剂（ Nacalai Tesque ，目录号：12593-64）
34. RO-3306 原液（见配方）
35. 4-OHT 原液（见配方）
36. BrdU 原液（见配方）
37. PTEMF 缓冲液（见配方）
38. 用于抗体工作溶液的 FBS（参见配方）
39. 抗体工作解决方案（见食谱）
40. DAPI 原液（见配方）
注意：在我们的实验室中，我们通常使用 DAPI、Alexa 488 和 Alexa 594 对 DNA 和两种感兴趣的蛋白质进行三重染色。荧光团的其他组合也是可能的。

设备

1. 细胞培养箱（ASTEC，型号：SCA-165D）
2. 吸水器（例如 FLINN Scientific，型号：AP1136）
3. 配备冷却 CCD 摄像头、LED 照明源和滤光片的宽场荧光显微镜可对 Alexa 488、Alexa 594 和 DAPI（例如 Keyence、BZ-X700）进行成像。类似的传统荧光显微镜将是适用的。
4. 40×物镜[例如，尼康，CFI （无色差无穷大）Plan Apo λ 40×/0.95 NA ]。也可以使用更高放大倍率的物镜，例如 63 倍镜头。

软件

1. 显微镜操作软件（例如 Keyence、BZ-X 查看器软件）

程序

A. 细胞同步和 LacI 结合的诱导
1. 将 U2OS 40-2-6 细胞以 4 × 10 4 个细胞置于 0.5 mL 的 D-MEM 培养基中，并为 4 孔室载玻片的每个孔添加 8% FBS，使细胞 50 % – 60% 与明天。
2. 在 37°C 下用 5% CO 2在细胞培养箱中孵育细胞过夜。
3. 将 RO-3306 添加到最终浓度为 7 μM 的 D-MEM 培养基中，每口井中添加 8% FBS。
4. （可选）为了在 S 期诱导 LacI 结合，将 4-OHT 添加到 1 μM 的最终浓度。
注意：S 期的 LacI 结合会引起额外的复制压力；然而，它并没有增加 MiDAS 的频率，可能是因为 MiDAS 的容量有限（Ishimoto 等人，2021）。
5. 培养细胞 RO-3306 在 37 °C 下 20 小时以在 G2 后期同步细胞。
6. 孵育 16 小时后，为了在 G2 期诱导 LacI 结合，加入 4-OHT 至终浓度为 1 μM（在 RO-3306 存在下用 4-OHT 处理 4 小时），与 RO-孵育剩余 4 小时3306。

B. 释放到有丝分裂并用 BrdU 标记
1. 孵育 20 小时后，细胞现在处于 G2 后期。
2. 用 1 mL 的 1× PBS 清洗细胞 3 次，预热至 37 °C，以去除 RO-3306。
3. 添加 0.5 mL 的预热 D-MEM 培养基，辅以 8% FBS。
4. 同时，将 BrdU 添加到 10 μM 的最终浓度以标记新生 DNA。
5. 在 37°C 下孵育细胞 20 分钟，使细胞进入前期。
注意：快速清洗和处理细胞以限制暴露于室温 (RT)，这可能会干扰细胞周期进程。将 PBS 和 D-MEM 预热至 37 °C 对于快速和同步进入有丝分裂也至关重要。

C. LacI 的细胞固定、透化和免疫染色
1. 用带有黄色尖端 (200 μL ) 的吸水器轻轻去除生长培养基。
2. 小心地将 1 mL 的冰冷 PBS 添加到每个井中。
3. 轻轻取出 PBS，并小心添加 1 mL 的 PTEMF 缓冲液，以同时固定和渗透细胞。
4. 在 RT 孵育 20 分钟。
5. 吸出 PTEMF 缓冲液并从载玻片上拆卸腔室。拆卸过程中注意不要让电池变干。
注意：玻璃载玻片可以用手处理，但应使用镊子从 Coplin 罐中的溶液中取出和转移载玻片。
6. 将幻灯片浸入含有 50 mL 冰冷 PBS 的 Coplin 罐中清洗幻灯片，每次 3 次，每次 5 分钟。
7. 将幻灯片放在朝上的矩形盘中，并用棉签去除孔周围疏水区域中多余的 PBS。快速不要让细胞变干。
8. 加入 95 μL初级抗LacI抗体溶液（稀释 1:500，参见配方）。
9. 关闭矩形盘的盖子并在 RT 下孵育 1 小时。
10. 通过倾斜纸巾上的幻灯片轻轻排出抗体溶液。
11. Coplin罐中用冰冷的 PBS 清洗载玻片3 次，每次 5 分钟。
12. 将幻灯片放在朝上的矩形盘中，并用棉签去除多余的 PBS。快速不要让细胞变干。
13. 加入 95 μL的 Alexa 594 二级抗兔抗体溶液（稀释 1:1,000，参见食谱）。
14. 关闭矩形盘并在 RT 下孵育 1 小时。
15. 从现在开始，将样品避光，以避免荧光染料的光漂白。

D. BrdU 的再固定、DNA 变性和免疫染色
1. 通过倾斜纸巾上的幻灯片轻轻排出抗体溶液。
2. Coplin罐中用 50 mL 的冰冷 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
3. 通过将载玻片浸入含有 100% 甲醇（在 -30 °C 冰箱中预冷过夜）的 Coplin 罐中 10 分钟重新固定样品在板凳上（在 RT）。
4. Coplin罐中用 50 mL 的冰冷 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
5. 为了使 DNA 变性，将载玻片浸入含有 50 mL 1M HCl 的 Coplin 罐中，在 RT 中 15 分钟。
BrdU免疫染色需要 DNA 变性；但是，用 HCl 处理过多可能会导致步骤 E3 中的 DAPI 染色较弱。
6. 在 Coplin 罐中用冰冷的 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
7. 将幻灯片放在朝上的矩形盘中，并用棉签去除多余的 PBS。快速不要让细胞变干。
8. 加入 95 μL初级抗BrdU抗体溶液（稀释 1:200，参见配方）。
9. 关闭矩形盘并在 RT 下孵育 1 小时。
10. 通过倾斜纸巾上的幻灯片轻轻排出抗体溶液。
11. Coplin罐中用冰冷的 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
12. 将幻灯片放在朝上的矩形盘中，并用棉签去除多余的 PBS。快速不要让细胞变干。
13. 加入 95 μL的 Alexa 488 二级抗小鼠抗体溶液（稀释 1:1,000，参见食谱）。
14. 关闭矩形盘并在 RT 下孵育 1 小时。

E. DAPI 染色和镶嵌
1. 通过倾斜纸巾上的幻灯片轻轻排出抗体溶液。
2. Coplin罐中用 50 mL 的冰冷 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
3. 将载玻片浸入含有 DAPI 工作溶液（0.2 μ g /mL，避光）的 Coplin 罐中，在 PBS 中在 RT 中 15 分钟。
4. Coplin罐中用 50 mL 的冰冷 PBS 清洗载玻片，每次 3 次，每次 5 分钟。
5. 将载玻片放在纸上，朝上放置，用棉签去除多余的 PBS，注意防止细胞变干。
6. 中加入一滴Fluoro -KEEPER 抗褪色剂。
7. 用一个安装玻璃盖玻片，确保避免气泡。
8. 擦去盖玻片边缘多余的Fluoro -KEEPER 抗褪色试剂。
9. 在盖玻片边缘用指甲油密封，让它在室温下干燥并固化至少 2 小时或过夜。
10. 继续进行显微镜检查或将载玻片在 4°C 下储存1-2个月，保持避光。

F. 图像采集
1. 使用荧光显微镜对幻灯片进行成像。
2. 使用 DAPI 通道查找包括前期/前中期细胞的区域，并使用 Alexa 594 通道专注于 LacI 病灶。
3. 在同一字段位置连续获取每个通道（DAPI、Alexa 488 和 Alexa 594）的图像，而无需更改焦点（图 2）。
4. 要评估在 lacO 阵列上对 MiDAS 的感应，请计算BrdU病灶与lacO阵列的共定位频率。手动评分具有 LacI 焦点的前期/前中期核的数量和 BrdU 信号在 LacI 焦点上形成焦点的核频率。虽然前期/前期细胞在这种情况下富集，但在前期/前期和中期细胞中可以观察到与 lacO病灶共定位的 BrdU 病灶。相反，如先前报道的（Ishimoto 等人，2021），在 G2 阻滞细胞（未从 RO-3306 释放）中未检测到 BrdU 掺入。
注意：这些图像应与没有 BrdU 标记的对照检测（图 2，底部）进行比较，以确认 BrdU 信号的特异性。

图 2. lacO阵列上的有丝分裂 DNA 合成的代表性图像。
LacI和 BrdU的共定位由白色箭头表示。比例尺 = 10 μm 。

食谱

1. RO-3306 原液
将 DMSO 中的 RO-3306 溶解至 1 mM 的库存浓度，并将等分试样储存在 -80 °C。使用前预热至 37 °C。
2. 4-OHT 原液
将 4-OHT 在 100% 乙醇中溶解至 125 μM 的库存浓度，并将等分试样储存在 -30°C。使用前预热至 37 °C。
3. BrdU 原液
将 BrdU 在盐水中溶解至 10 毫克/毫升（32.5 毫米）的库存浓度，并将等分试样储存在 -80°C。
4. PTEMF 缓冲液
20 毫米管道，pH 6.8
10 毫米 EGTA
0.2% 海卫 X-100
1 毫米氯化镁2
4% 甲醛
注：配制不含甲醛的溶液，用 0.22 μm 滤膜过滤，4℃保存。每次实验都新鲜添加甲醛。
5. FBS 用于抗体工作溶液
将硫柳汞加入 FBS 至 0.1% 的浓度，并用 0.45 μm 过滤器过滤。在 4 °C 或 -30 °C 下长期储存。
6. 抗体工作解决方案
在补充有 10% FBS 的 1× PBS 中稀释抗体。为每个实验新鲜准备。
a. LacI的检测
一抗：兔抗-LacI，1:500
二抗：Alexa 594 anti-Rabbit, 1:1,000
b. BrdU的检测
一抗：小鼠抗 BrdU， 1:200
二抗：Alexa 488 抗小鼠，1:1,000
7. DAPI 原液
将 DAPI 溶解在水中至 1 mg/mL 的库存浓度，避光。储存在-30°C。

致谢

这项工作得到了日本科学促进会 (KAKENHI JP15K18478 和 JP22H02603)、福冈健全健康癌症研究基金和持田纪念医学和药物研究基金会的资助。该协议改编自我们之前的工作（Ishimoto 等人，2021）。 MiDAS 检测的基本方法最初由 Ian Hickson 博士的实验室开发（Minocherhomji et al., 2015; Bhowmick et al., 2016）

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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