材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有试剂均可在室温下储存。

A.供体菌株的构建
1.枯草芽孢杆菌168 (Mori et al., 2022)
2.B. subtilis YNB211 (Mori et al., 2022)
3.G. kaustophilus MK244（森等人，2022）
4.pUCG18T (Mori et al., 2022)
5.LB培养基（2％琼脂）（BD Difco ，目录号：240230）
6.10% SDS（Nacalai Tesque，目录号：30562-04）
7.溶菌酶（Wako，目录号：129-06723）
8.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（Wako，目录号：311-90151），储存在4°C
9.70% 乙醇
10.99.5% 乙醇
11.KOD -Plus- Neo 聚合酶（Toyobo，目录号：KOD-401），储存于-20°C
12.用于电泳凝胶的琼脂糖（ME，Nacalai Tesque，目录号：01133-24）
13.用于设计 PCR 引物的In silico Molecular Cloning 软件（In Silico Biology, Inc.，目录号：IMCGF01）
14.用于五个片段的 PCR 反应的引物对
a.片段 A1：
aprE-U-f1 ccggtacttgccaccacatcataac
aprE- Ur cagtaacctcatcaagccaagctacctctcgctatttccgtagagactcg
b.片段 A2：
aprE-D-f2 gacagaggaattagatacattcgcgttaatcaacgtacaagcagctgcac
aprE -Dr ggccgagcagtattcgaatgtcaag
c.片段 B1：
degA -Uf gtagcttggcttgatgaggttactg
度A-U-r2 catcggtcataaaatccgtatccttggttactttcatcgctcatcattc
d.片段 B2：
度A-D-f2 ctgcaaggcgattaagttgggtaacagtgaaatcgtaaggatgtgagcag
度A-博士 cgcgaatgtatctaattcctctgtc
e.片段 C1：
看-f aaggatacggattttatgaccgatg
kan -r2 gttacccaacttaatcgccttgcag
15.用于连接五个片段的重组 PCR 反应的引物。
a.aprE-U-f3-嵌套 caccgagctcatagcttgtcgcgatcacctcatcc
b.aprE-D-r2-嵌套 tgctttcgctgattacaacattggtgacgctgcct
16.DNA 纯化试剂盒（Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System，Promega，目录号：A9281）
17.7.5 mg/mL硫酸卡那霉素水溶液（Wako，目录号：113-00343）
18.解决方案 A（见配方）
19.解决方案 B（见配方）
20.100 ×微量元素（见食谱）
21.TKE 缓冲液（见配方）
22.50× TAE 缓冲液（见配方）
23.用于转化的 C-1 和 C-2 培养基（参见配方）

B.transconjugant (transformant) 的偶联和选择
1.7.5 mg/mL硫酸卡那霉素水溶液（Wako，目录号：113-00343）
2.70％乙醇中的10mg / mL氯霉素储备溶液（Wako，目录号：030-19452）
3.100 mM IPTG水溶液（ Nacalai Tesque ，目录号：367-93-1)
4.LB培养基（见食谱）
5.LBMSM 培养基（见配方）

C.Southern印迹分析
1.用于扩增模板 DNA 以合成 RNA 探针的引物
a.km-probe-f taatacgactcactatagggtatggctctcttggtcgtc
b.Km-probe-r tctgattccacctgagatgc
2.用于电泳凝胶的琼脂糖（SP， Nacalai Tesque ，目录号：01163-76）
3.DNA Molecular Weight Marker II，DIG 标记（Roche，目录号：11218590910）
4.DNA 纯化试剂盒（Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System，Promega，目录号：A9281）
5.T7 RNA聚合酶（Roche，目录号：10881767001），储存在-20°C
6.DIG RNA 标记混合物，10× 浓度（Roche，目录号：11277073910），储存在-20°C
7.限制酶
a.克拉我（宝，目录号：1034A），储存在-20°C
b.囊Ⅱ （Takara，目录号：1079A），储存在-20°C
8.DIG Easy Hyb （Roche，目录号：11603558001），储存于 4°C
9.阿默舍姆 Hybond -N+（GE Healthcare，目录号：RPN82B）
10.杂交袋（Hybridization Bags Hybri -Bag Hard，COSMO BIO，目录号：S-1001）
11.封闭试剂（Roche，目录号：11096176001）
12.Anti-Dig oxigenin-AP，Fab 片段（Roche，目录号：11093274910），4°C 储存
13.CSPD，即用型（Roche，编号：11755633001）， 4 °C 储存
14.20 × SSC 缓冲区（见配方）
15.马来酸缓冲液（见配方）
16.变性溶液（见配方）
17.中和溶液（见配方）
18.高纯度洗涤液（见配方）
19.低严格洗涤溶液（见配方）
20.检测缓冲液（见配方）

设备

A.供体菌株的构建
1.热循环仪（例如，Takara Bio、Thermal Cycler Dice Touch TP350 或同等产品）
2.离心机（例如 TOMY、MX-307 或同等产品）
3.分光光度计（例如GE Healthcare、 NanoVue Plus 或同等产品）
4.琼脂糖凝胶电泳仪（例如，Takara Bio、 Mupid ® -2plus或同等产品）
5.培养箱（例如PHCbi 、MIR-H163 或同等产品）

B.transconjugant (transformant) 的偶联和选择
1.两个恒温摇床，一个设置在 37 °C，另一个设置在 60 °C（TAITEC、 Bioshaker BR-43FM-MR 或同等产品）
2.离心机（TOMY、MX-307 或同等产品）
3.两个培养箱，一个设置为 37 °C，另一个设置为 60 °C（ PHCbi 、MIR-H163 或同等产品）
4.分光光度计（SHIMADZU、UV-1800 或同等产品）
5.300 mL 带挡板锥形瓶

C.Southern印迹（或：Southern印迹分析）
1.热循环仪（Takara Bio、Thermal Cycler Dice Touch TP350 或同等产品）
2.分光光度计（GE Healthcare、 NanoVue Plus或同等产品）
3.琼脂糖凝胶电泳仪（Bio-Rad、Sub-Cell GT Cell或同等产品）
4.转移装置（Bio Craft、Vacuum Transfer BS-31或同等产品）
5.紫外线交联剂（UVP、 CL-1000，或同等产品）
6.摇床（Bio Craft、 Labo Shaker BC-730 或同等产品）
7.化学发光成像仪（Bio-Rad、 ChemiDoc XRS+或同等产品）

程序

A.供体菌株的构建
1.从细菌菌株中分离 DNA
a.在 37°C 下在 5 mL 的 LB 培养基中培养细菌细胞，一夜之间摇晃。
b.8,152下离心收集试管中 1.5 mL 培养物的细菌细胞 × g在室温下保持 3 分钟。
c.将细胞悬浮在 500 μL 的 TKE 缓冲液中，其中含有 1 mg 新添加的溶菌酶。
d.在 37°C 下孵育管 30 分钟。
e.添加 50 μL 的 10% SDS 并彻底混合。
f.加入 500 µL苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1 ) 并剧烈混合。
g.在 20,380 离心管 × g 4 °C 10 min ，然后将 200 µL 上清液转移至新管中；避免转移白色界面。
h.向试管中加入 500 µL 99.5% 乙醇，混合并在冰上静置 10 分钟，然后在 20,380 下离心 × g 5 分钟。弃去上清液。
i.用 0.7 mL 的 70% 乙醇仔细清洗 DNA 颗粒，并将样品在 37 °C 下放置 10 分钟，以蒸发残留的乙醇。
j.加入 100 μL蒸馏水，在 37°C 下放置 10 分钟，轻轻溶解 DNA。
k.NanoVue Plus等分光光度计测量 DNA 浓度。
2.设置重组 PCR 反应以生成“基因盒”
Δ iolQ GK :: kan磁带的示意图组织，用耐热卡那霉素抗性基因替换G. kaustophilus的iolQ GK编码区，在该协议中用作示例（图 1）。该基因盒通过重组PCR产生，如下连接五个PCR片段。
a.使用 KOD -Plus-neo 聚合酶通过 PCR 分别扩增五个片段（A 1、A2、B1、B2 和 C1）。用于扩增每个片段的特定引物对在上面的“材料和试剂”部分中列出。强烈建议通过琼脂糖凝胶电泳检查每个 PCR 片段的正确扩增。 PCR反应的组成和进行如下：

PCR反应：
组分体积最终浓度
10× PCR 缓冲液5 μL 1×
2 mM dNTPs 5 μL 每个 0.2 毫米
25 毫米硫酸镁4 3微升 1.5 毫米
引物（每种 10 μM ） 0.75 –1.5 μL 每个0.15 –0.3 μM
模板 DNA变量质粒/PCR 片段 DNA
~50 纳克/50微升
基因组 DNA ~200 ng/50 μL
KOD -Plus- Neo (1 U/ μL ) 1 μL 1 U/50 μL
H 2 O变量
总计50 μL

热循环仪条件：
初始变性98 °C 2 分钟
30 个循环98 °C 10 秒
68℃ 30 秒/千字节
保持4 °C

b.使用 DNA 纯化试剂盒纯化 PCR 反应，并通过测量 OD 260nm确定纯化 DNA 的浓度。
c.1:1:1:1:1的摩尔比混合所有放大和纯化的片段。
d.使用引物 aprED-r2-nested 和 aprEU-f3-nested 运行重组 PCR 以重组五个片段。 PCR反应与上述相同，但设置热循环仪条件如下：

热循环仪条件：
初始变性98 °C 2 分钟
30 个循环98 °C 10 秒
68℃ 2.5 分钟
保持4 °C

图 1. 生成Δ iolQ GK :: kan盒（重组产物）的策略。
使用 A.14 中提到的引物对通过 PCR 扩增五个片段。两个片段对应于枯草芽孢杆菌的“上游”和“下游”区域四月位点和分别命名为 A1 和 A2。对应于G. kaustophilus MK244 iolQ GK上游和下游序列的另外两个片段分别命名为 B1 和 B2；含有pUCG18T卡那霉素抗性基因的DNA片段命名为C1。片段 A1 和 A2 设计为大约 1 kb 长，片段 B1 和 B2 大约为3 kb。特定引物（如箭头所示）列在“材料和试剂”部分。弯曲箭头的彩色区域对应于设计用于与最终重组产物中的侧翼区域重叠的5 '延伸。重叠的序列用不同的颜色表示。五个单独的 PCR 片段通过 PCR 连接在一起形成一个长的“基因盒”片段。

3.转型
pLS20 的存在降低了能力水平（Singh 等人，2012 年）。因此，建议分两步生成最终的枯草芽孢杆菌供体 YNB213。首先，将PCR产生的五片段重组产物用于转化感受态枯草芽孢杆菌168细胞。其次，然后使用从该转化的卡那霉素抗性转化体中分离的染色体 DNA 转化感受态枯草芽孢杆菌YNB211 细胞，该细胞含有 pLS20catΔoriT 并含有oriT pLS20 和存在于染色体上yhfK和amyE基因座处的oriT pLS20和 IPTG 诱导型rap pLS20 ，分别（ Miyano等人，2018 年；Mori 等人，2022 年）。枯草芽孢杆菌的转化如下进行：
a.生长一株枯草芽孢杆菌，在 LB 2% 琼脂板上过夜（约 16 小时）以形成菌落。
b.拿起一个新鲜的菌落，用它在试管中接种 5 mL 的 C-1 培养基，使细胞在 37°C 下生长，剧烈摇动（至少 200 rpm）2.5 小时。
c.通过在室温下以 6,000 rpm 离心 3 分钟收集细胞。
d.将细胞颗粒悬浮在新试管中 10 mL 的 C-2 培养基中，并在 37°C 下摇动试管 40 分钟。
e.将 1 mL 的 C-2 培养基培养物转移到含有少于 100 μL DNA 溶液（1-10 μg/mL）的新管中。
f.在 37°C 下摇动试管 2 小时。
g.将培养物传播到含有适当抗生素的平板上以选择转化体。

B.转偶联子的偶联和选择（图 2）
基于之前的发现，添加山梨糖醇 ( Kanaavičiūtė et al., 2015)、MgCl 2和马来酸-NaOH 缓冲液 (Wyrick and Rogers, 1973) 可有效提高电穿孔转化效率和稳定 L 型细胞，我们开发了一种改良的培养基，名为 LBMSM，适用于提高由缀合介导的G. kaustophilus转化的效率。
1.供体培养物的制备
a.生长枯草芽孢杆菌 YNB213 在含有10 µg/mL 氯霉素的 LB 2% 琼脂板上过夜，在 37 °C 下形成菌落。
b.拿起一个新鲜的菌落，用它接种 5 mL 含有 10 μg/mL 氯霉素的 LB 液体培养基，在试管中在 37°C 下预热。
c.在 37°C 下生长过夜，以 200 rpm 的速度摇动。
d.在 37 °C 下预热的 300 mL 带挡板锥形瓶中，在 10 mL 含有 1.0 mM IPTG 的 LBMSM 培养基中稀释培养物，使 OD 600达到0.05（使用分光光度计检查）。
e.在 37°C 下生长细胞，以 200 rpm 的速度摇动，直到 OD 600达到 0.6 – 0.8，并将其用作供体培养物。
2.受体培养物的制备
a.种植G. kaustophilus MK244在 60 °C 的 LB 2% 琼脂板上过夜，形成菌落。
b.拿起一个新鲜的菌落并将其接种到 1 0 mL 的 LB 液体培养基中，在 300 mL 锥形瓶中预热至 60 °C。
c.在 60°C 下生长细胞 2 小时，以 200 rpm 的速度摇动。
d.在 300 mL 带挡板的锥形瓶中，在 60 °C 预热的 10 mL LBMSM 培养基中稀释培养物（使用分光光度计将 OD 600调整为 0.01）。
e.让细胞在 60°C 下生长，以 200 rpm 的速度摇动，直到 OD 600达到 0.6 – 0.8，用分光光度计测量，并将其用作受体培养物。
3.交配
a.在消毒的 300 mL Erlenmeyer 烧瓶中混合 2 mL 的供体培养物和 8 mL 的受体培养物。
b.将混合培养物在 37°C 下放置 90 分钟，然后让细胞在 60°C 下生长 180 分钟，并以 200 rpm 的速度摇动。
4.转接合子的集落形成
a.将交配培养物转移到试管中并在8,152处离心 × g 2 分钟，并将颗粒重新悬浮在 1.2 mL 的 LB 液体介质中，在 60 °C 下在 1.5 mL 管中预热。
b.将悬浮液涂抹在含有 7.5 μg/mL 卡那霉素的 LB 2% 琼脂板上，在 60°C 下预热（每个培养皿直径 9 厘米，200 μL）。
c.作为阴性对照实验，将供体和受体细胞分别涂抹在含有 7.5 μg/mL 卡那霉素的 LB 2% 琼脂板上，在 60 °C 下预热。
d.在 60°C 下孵育板过夜，并对菌落数进行评分。
5.受体菌落形成
a.对交配培养物的一小部分 (~ 100 µL)进行取样, 将其稀释 10 7倍, 并将 100 µL稀释液涂抹在 LB 2% 琼脂板上。
b.在 60°C 下孵育板过夜，并对菌落数进行评分。

图 2. 结合过程的示意图。
供体菌株B. subtilis YNB213 和受体菌株G. kaustophilus MK244 独立生长。通过将两种培养物以 1 比 4 的比例混合供体和受体细胞进行交配，然后进一步孵育以增强菌落形成。

C.Southern印迹分析
Southern 印迹分析使我们能够检测染色体 DNA 样本中的特定 DNA 序列，这通常涉及四个连续的步骤，包括 ( i ) 用限制性内切酶将染色体 DNA 片段化，(ii) 通过电泳分离 DNA 片段，(iii) 转移膜上的 DNA，和 (iv) 使用探针检测膜上的 DNA。为染色体 DNA 的片段化选择合适的限制性内切酶非常重要。在本协议的情况下，我们决定使用Cla I 和Sac II（图 3）。对于膜上的 DNA 检测，使用带有 DIG 标记的 RNA 探针的基于荧光的非放射性技术来检测目标 DNA。
1.DIG 标记 RNA 的制备
a.使用 KOD -Plus-neo 聚合酶和引物对 Km-probe-f 和 Km-probe-r 运行 PCR 以扩增对应于卡那霉素抗性基因的片段。 PCR反应的组成和进行如下：

PCR反应：
组分体积最终浓度
10× PCR 缓冲液5 μL 1×
2 mM dNTPs 5 μL 每个 0.2 毫米
25 毫米硫酸镁4 3微升 1.5 毫米
引物（各 10 μM ） 0.75 – 1.5 μL 每个0.15 –0.3 μM
pUCG18T DNA可变~50 ng/50 μL
KOD -Plus- Neo (1 U/ μ L) 1 μL 1 U/50 μL
H 2 O变量
总计50 μL

热循环仪条件：
初始变性98 °C 2 分钟
30 个循环98 °C 10 秒
68℃ 30 秒/千字节
保持4 °C

b.使用 DNA 纯化试剂盒，纯化扩增的 DNA 作为体外转录的模板。
c.按照制造商提供的协议，使用 T7 RNA 聚合酶和 DIG RNA 标记混合物对模板 DNA 进行体外转录。此步骤生成一个 DIG 标记的 RNA 探针。
d.将 DIG 标记的 RNA 探针储存在-80°C，直到使用。
2.基因组 DNA 的消化和电泳
a.提取基因组 DNA 并测量 OD 260以确定它们的浓度。
b.在 37°C 下用适当的限制酶消化 3 μg 基因组 DNA 至少 1 小时以完成消化。
c.将消化的 DNA 与大小标记（DNA 分子量标记 II，DIG 标记）平行进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳。
d.在 100 V 下运行电泳 1 小时。
3.印迹、杂交和检测
a.将琼脂糖凝胶依次浸泡在 150 mL 的 ( i ) 0.25 M HCl (30 分钟)、(ii) 变性溶液 (30 分钟) 和 (iii) 中和溶液 (30 分钟) 中。
b.将凝胶中的 DNA 转移到带正电荷的尼龙膜（ Amersham Hybond -N+)，按照供应商的指示使用转移装置 (Vacuum Transfer BS-31)。
c.用紫外线交联剂 L-1000 将转移的 DNA 交联到膜上，累积辐射设置为 0.07 J/cm 2 。
d.在50°C 下用 30 mL 的 DIG Easy Hyb填充袋子至少 10 分钟以进行预杂交。
e.将含有探针的水溶液煮沸 10 分钟，然后将样品放在冰上快速冷却，从而使 DIG 标记的 RNA 探针变性。
f.将膜浸泡在装有 30 mL 的 DIG Easy Hyb的袋中，该袋中含有 100 ng/mL 的变性DIG 标记的 RNA 探针，在 42 °C 下轻轻摇晃过夜。
g.在室温下用 150 mL 的低严格性洗涤溶液洗涤膜两次，每次 5 分钟，并轻轻摇动。
h.在 65°C 下用 150 mL 的预热高严格性洗涤溶液洗涤膜两次，每次 15 分钟，并轻轻摇动。
i.用 150 mL 的马来酸缓冲液轻轻摇动，短暂清洗膜。
j.在室温下将膜浸泡在 150 mL 马来酸缓冲液中稀释的封闭试剂中 30 分钟，以防止抗体的非特异性结合。
k.4体积抗地高辛-AP、Fab 片段的30 mL 封闭试剂孵育 30 分钟（每 100 cm 2膜应使用 20 mL 封闭试剂）。
l.用 150 mL 的洗涤缓冲液洗涤膜两次，每次 15 分钟，轻轻摇动。
m.将膜转移到新的杂交袋中，用 30 mL 检测缓冲液平衡 3 分钟。
n.丢弃检测缓冲液，在 37 °C 下用 30 mL 含有 CSPD 的检测缓冲液孵育膜5-10 分钟（每 100 cm 2膜应使用 20 mL 检测缓冲液）。
o.ChemiDoc XRS+检测化学发光信号。

图 3. 供体、受体和转导菌株染色体相关区域的物理图。

数据分析

A.偶联和选择转偶联子
CFU transconjugant / CFU受体的值来评估效率，通常约为 1.0 × 10 -9 。

1.过夜孵育的含有卡那霉素的板上出现的菌落数。计算CFU transconjugant如下：

CFU 转偶联剂= 每板菌落数的平均值 ± SD × 1.2 mL/200 μL / 10 mL

例如，当在三个平板上分别形成 3、3 和 5 个菌落时：
CFU 转偶联物= 3.7 ± 1.2 ×1.2/0.2/10 = 2.2 ± 0.7

2.过夜孵育的板上出现的菌落数。计算CFU收件人如下：

CFU接受者= 每板菌落数的平均值 ± SD × 10 7 × 1 mL/100 μL

例如，当在三个平板上分别形成 18、13和 11 个菌落时：
CFU接受者= 14.0 ± 3.6 × 10 7 × 1.0 /0.1 = 1.4 ± 0.36 × 10 9

B.Southern印迹分析
1.为膜上的化学发光信号拍照，以显示含有卡那霉素抗性基因的 DNA 片段条带（图4 ）。
2.估计每个带的长度与与样品平行电泳的大小标记 DNA 的位置有关。
3.检查染色体的物理图，以确保卡那霉素抗性基因已插入所需位置。在这种情况下，卡那霉素抗性基因的正确插入通过膜上特定条带组合的出现得到证实：来自用于Sac II消化的转导结合体和供体的 5,456 bp 条带，来自转导结合体的 8,581 bp 条带或来自供体的 6,172 bp 条带用于Cla I消化，以及来自转导和供体的 3,583 bp 条带用于Sac II和Cla I双消化。

图 4.Southern 印迹分析结果。
Sac II（泳道 1-3）、 Cla消化的受体（泳道 1、4 和 7）、转导（泳道 2、5 和 8）和供体（泳道 3、6 和 9）菌株的染色体 DNA I（泳道 4 – 6）和Cla I & Sac II（泳道 7 – 9）与大小标记 DNA 片段 (M) 平行进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行 Southern 印迹分析，以探查卡那霉素抗性基因。

食谱

1.LB培养基
试剂最终浓度数量
LB（迪夫科伦诺克斯）2%20 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

2.LBMSM
试剂最终浓度数量
LB（迪夫科伦诺克斯）2%20 克
H 2 O500 毫升
将上述溶液在 121 °C高压灭菌20 分钟后，加入以下单独灭菌的溶液。
1.25 M 山梨糖醇0.5M400 毫升
0.4 M 氯化镁20.02 万50 毫升
0.4 M 马来酸-NaOH 缓冲液 (pH 7.0)0.02 万50 毫升
全部的1,000 毫升

3.解决方案 A
试剂最终浓度数量
K 2 HPO 40.16 万5.6 克
KH 2 PO 40.088 M2.4 克
(NH 3 ) 2 SO 40.03 M0.8 克
柠檬酸钠·2H 2 O0.0068 M0.4克
H 2 O
全部的200 毫升
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

4.解决方案 B
试剂最终浓度数量
MgSO 4 ·7H 2 O0.010 米0.5克
葡萄糖0.056 M2克
H 2 O
上述高压灭菌后，添加以下单独灭菌的溶液。
2 mg/mL FeCl 3 ·4H 2 O4.02 × 10 -6 M80 µL
0.1 mg/mL MnSO 4 ·5H 2 O1.66 × 10 -7米80 µL
100 ×微量元素× 0.2400 µL
全部的200 毫升

5.100 ×微量元素
试剂最终浓度数量
CaCl 2 ·2H 2 O4.97 × 10 -3米0.73 克
氯化锌21.25 ×10 -3 M0.17 克
CuCl 2 ·2H 2 O2.52 × 10 -4米0.043 克
CoCl 2 ·6H 2 O2.52 × 10 -4米0.06 克
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O2.48 ×10 -3 M0.06 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
121 °C高压灭菌20 分钟。

6.C-1 培养基
试剂最终浓度数量
解决方案 A2.5 毫升
解决方案 B2.5 毫升
将上述溶液在 121 °C 高压灭菌 20 分钟后，加入以下单独灭菌的溶液。
5% 酵母提取物0.05%50 µL
10% 酪蛋白氨基酸0.10%10 µL
5 mg/mL L-色氨酸50 微克/毫升50 µL
全部的5 毫升

7.C-2 培养基
试剂最终浓度数量
解决方案 A5.0 毫升
解决方案 B5.0 毫升
将上述溶液在 121 °C 高压灭菌 20 分钟后，加入以下单独灭菌的溶液。
5% 酵母提取物0.05%10 µL
10% 酪蛋白氨基酸0.10%10 µL
5 mg/mL L-色氨酸5微克/毫升10 µL
全部的10 毫升

8.50×TAE 缓冲液
试剂最终浓度数量
三（羟甲基）氨基甲烷2M242 克
醋酸1M57.1 毫升
Na 2 EDTA·2H 2 O0.5M18.6 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

9.TKE 缓冲区
试剂最终浓度数量
1 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 8.0)0.1M10 毫升
0.5 M Na 2 EDTA (pH 8.0)0.05 M10 毫升
1 M氯化钾0.1M10 毫升
H 2 O70 毫升
全部的100 毫升
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

10.20 ×SSC
试剂最终浓度数量
柠檬酸钠·2H 2 O0.3M88.2 克
氯化钠3M175.3 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
用 14 N HCl 将 pH 值调节至 7。
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

11.马来酸缓冲液
试剂最终浓度数量
马来酸0.1M11.61 克
氯化钠0.15 M8.77 克
氢氧化钠0.18 万7.2 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
将 pH 值调节至 7.5。
高压灭菌器在 121 °C 下 20 分钟。

12.变性溶液
试剂最终浓度数量
氯化钠1.5M87.6 克
氢氧化钠0.5M20 克
H 2 O
全部的1,000 毫升

13.中和液
试剂最终浓度数量
1 M Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.5)0.5M500 毫升
氯化钠1.5M87.6 克
H 2 O
全部的1,000 毫升

14.低严格洗涤液
试剂最终浓度数量
20×SSC0.1×SSC30 毫升
10% SDS0.2%12 毫升
H 2 O
全部的600 毫升

15.高纯度洗涤液
试剂最终浓度数量
20×SSC2×SSC180 毫升
10% SDS0.2%12 毫升
H 2 O
全部的600 毫升

16.检测缓冲液
试剂最终浓度数量
特里斯0.1M12.1 克
氯化钠0.1M5.84 克
氯化镁2
0.05 M4.76 克
H 2 O
全部的1,000 毫升
将 pH 值调节至 9.5。

致谢

作者感谢 Valeria Verrone 和 Anil Wipat对原始研究论文做出了不可或缺的贡献，该协议源自 Mori 等人。（2022 年）。这项研究得到了 KAKENHI 18H02128 的支持。

利益争夺

该协议与专利相关，仅允许在学术研究中使用。特别是菌株YNB211和YNB213的分布需要签订适当的材料转让协议。

参考

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