材料和试剂

1. 管1.5、15、50 mL（LIFEGENE 目录号：LMCT1.7B、LTB15、LTB50）
2. 多道移液器（Gilson PIPETMAN L 多通道 P12x200L，目录号：FA10012）
3. LB琼脂（1.5% 琼脂，BD Difco TM琼脂，目录号：11793523）
4. 培养皿 90、50 mm （ MINIPLAST，目录号：820-090-01-017、872-050-05-000）
5. 用于塑料培养皿盖的黑色哑光喷漆（RUST-OLEUM 2X Ultra Cover Ultra Matte Spray ）
6. 96孔板（CORNING，目录号：3596）
7. 高效大肠杆菌感受态细胞， rec A -菌株（如 Mach1 或 DH5 α； ThermoFisher ，目录号分别为：C862003 和 18265017）
8. Gibson 组装混合物（NEB，目录号：E2611S）
9. DNA 质粒： pC -CAT - Ub 、 pTarget -N-CAT 和 pE3（可从我们的实验室获得，用于学术用途）。
10. 抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素和氯霉素（FORMEDIUM，目录号：AMP25，CAISSON LABS，目录号： 05212005，CHEM-IMPEX INTERNATIONAL，目录号：0028，FORMEDIUM，目录号：CLA01）
11. Luria-Bertani（LB）培养基（NEOGEN，目录号：NCM0173A）
12. SOC培养基（FORMEDIUM，目录号：SOC0201）

设备

1. 分光光度计（MRC，型号：Spectro-V11D）
2. Vortex（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
3. 恒温水浴（炒电，WBS）
4. 培养箱（用于培养皿和试管摇床，MRC LABORATORY-INSTRUMUNTS，目录号： BOD-80， INFORS HT，Ecotro1 ）
5. 平板办公（US-letter/A4）扫描仪（如爱普生，型号：Perfection V19 或 V37）
6. 读板机-摇床-培养箱 (TECAN, Sunrise)

软件

1. 样品（ https://github.com/PragLab/SAMPLE ）
2. 斐济/ImageJ ( https://fiji.sc 或https://imagej.nih.gov/ij/ ）及其插件时间序列分析器 V3 (Balaji J. 2007); https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ）
3. 分析软件，例如 Excel、 KaleidaGraph 、GraphPad Prism 或SigmaPlot

程序

A. 诱饵和猎物或泛素化蛋白的克隆
1. 我们建议使用Gibson 组装方法进行克隆（Gibson 等人，2009）。然而，可以使用其他方法。
2. 我们不会在这里提供克隆方案，但我们想解决一些关于系统中最终 DNA 质粒结构的重要问题：
a. 我们推荐使用组成型启动子，例如未调节的PTac 。我们建议避免使用IPTG，因为它会抑制生长。 T7 启动子的表达需要诱导型 T7-RNA 聚合酶，因此也不推荐。
b. 在用于表达多个基因（多顺反子）的质粒中，例如pC -CAT- Ub ，也表达 E1 (UBA1) 和 E2（例如酵母 Ubc4）酶，Shine-Dalgarno (SD) 核糖体结合位点 (RBS) 序列必须在每个表达的基因之前设计（Prag et al., 1997）。
c. 为了保持每个质粒的稳定拷贝，我们建议使用兼容的复制起点（图 1）。

B. 质粒DNA的共转化
1. 使用 20 – 50 μL高效 [10 8 cfu /µg DNA (pUC19)]大肠杆菌感受态细胞。我们主要使用我们实验室通过 Inoue 方法制备的 Mach1 T1 R感受态细胞（Inoue et al., 1990; Sambrook and Russell, 2006）。或者，这些细胞可以从ThermoFisher购买。 Mach1 T1 R细胞的好处是它们的生长速度更快，从而加速并促进了研究。然而，可以使用其他细胞，包括 DH5α 、 W3110 或 HMS174。
2. 使用 300 – 500 ng（图 1 ）。
注意：多个质粒的共转化是一种低效的过程，需要高浓度的 DNA。如果三个质粒共转化失败，尝试分步转化，即先转化一个或两个质粒；然后制备含有这些质粒的感受态细胞，并用第三个质粒转化它们。
3. 为了促进共转化，将细胞与 DNA 质粒在冰上孵育 30 分钟，然后在 42°C 水浴中进行 45 秒的热休克。将混合物放回冰上 2分钟，然后加入 1 mL 的 SOC 培养基。在 37°C 的摇动培养箱中孵育 60 分钟。
4. S在预热的 LB 琼脂平板上预加载转化培养物的所有内容物，补充 15 μg /mL卡那霉素和 12.5 μg /mL链霉素（用于转化的标准选择性培养基板的一半浓度；对于三个质粒，使用每种抗生素的第三浓度，并加入 33 μg /mL氨苄青霉素）。
5. 将盘子放在 37°C 的固定培养箱中过夜。
6. 店铺将板放在 4 °C 的冰箱中以备将来使用（最多 1 – 2 周）。

C. 培养起始物的制备
1. 准备 5 – 10 mL LB 培养物（测试、阳性对照、阴性对照等），辅以 15 μg /mL卡那霉素和 12.5 μg /mL链霉素（我们使用 50 mL 试管）。
2. 180 rpm和 37 °C的摇床培养箱中孵育启动器约 1 – 3 小时，或直到培养物达到 0.3 – 0.5 OD 600nm 。
注意：启动器中的增长率可能会有很大差异。如果其中一种菌株先于其他菌株达到 ~0.5 OD 600nm ，则将其从培养箱中取出，并在室温下将其存放在工作台上。培养物应在〜0.4 OD 600nm的早期对数阶段收获。该浓度的显着偏差会影响结果。高 OD溶液可能含有大量死细菌。
3. 为了减少噪音，我们建议将细菌旋转下来，倒入旧的 LB，然后用缺乏抗生素的新鲜 LB 代替。在测得OD 600nm的基础上，加入适当的体积，达到0.4 OD 600nm 。
4. 对于琼脂板上的点样测定，在新的微量离心管中将培养物的OD调整为 0.2，体积为 500 μL 。对于 96 孔板测定，在 10 mL的体积下将OD调整为 0.4。

D. 进行化验
1. 用 96 孔板读数器在液体培养基中进行测定
我们首先确定以下结合或泛素化测定的最佳 CAM浓度。这是通过一系列增加 CAM 浓度的生长实验来完成的，用于比较野生型与阴性对照菌株的生长效率。最佳 CAM 浓度是在野生型和阴性对照之间呈现最大生长差异的浓度（图 2A - 2D）。

图 2. NleG6-2 泛素 E3 连接酶的自泛素化
(A) 在增加氯霉素 (CAM) 浓度（0-浅蓝色、2-红色、4-绿色、6-蓝色、8-洋红色、10-深绿色、12-黄色）下测定 NleG6-2 自泛素化依赖性抗性, 16-青色和 32-棕色μg /ml)。 (B) 作为 A 中所示实验的阴性对照：显示了缺乏泛素化和抗性 ( ΔE1 , ΔE2) 的菌株的耐受性增长。 (C) 基于 A 和 B 中显示的累积增长 (积分) 的相对 IC50。(D) 显示运行下游检测的最佳 CAM 浓度的曲线。 (E) LB 琼脂培养皿上的斑点测定显示 NleG6-2 的自泛素化。选择系统以红色提供 NleG6-2 自泛素化的读数。绿色泛素化（ΔE1，ΔE2）的特定阴性对照。只有 N- 或 C-CAT 片段的阴性对照分别为蓝色和洋红色。全长 CAT (CAT-FL) 的阳性对照为青色。 (F) 条形图中的值表示图 E 中显示的增长曲线的“相对累积增长”（积分）。

a. 和 32 μg /mL 的最终 CAM 浓度培养细菌。首先，准备10 ml LB 培养基，添加 2 × 15 mL 管中的CAM浓度（即0、4、8、12、16、20、24、32 和 64 ）。
b. 我们建议使用多道移液器设置 96孔板。首先，在每个孔中分配2 × CAM LB (75 μL )最终体积的一半。为多通道移液器使用 25 mL 移液储液罐，从低浓度开始，然后重新使用增加 CAM 浓度的储液罐。
c. 从 25 mL移液槽中分取75 μL培养物 ( 2 × OD 600 ) 在每个孔中，然后安装96孔板在振动筛阅读器中。
d. 我们通常在 37 °C下连续摇动培养细菌，并读取OD 600 每隔 20 分钟。典型的检测需要 12 – 24 小时。
e. 对阴性对照重复上述设置。在泛素化级联的情况下，有许多阴性对照选择，包括 C 末端的泛素突变体（如 Ub-R77）、E1 和 E2 酶的缺失或催化死亡突变体，或缺乏 E3 识别的靶标元素。对于 PPI 实验，用不相关的蛋白质替换猎物或诱饵是一种有用的阴性对照。在阴性对照细胞中，我们建议表达相似数量和大小的蛋白质以造成相似的负担。
注意：包含泛素结合域（UBD，例如 Rpn10）的靶标通常会经历 E3 独立泛素化，可用作简单的阳性对照。
f. 如前所述，每个 CAM 浓度的累积增长用于得出代表生长效率的单个值。要达到此值，请在每个 CAM 浓度下从野生型中减去阴性对照的生长，以获得下游实验的最佳浓度（图 2D）。

2. 琼脂板上的基于分裂 CAT的斑点测定
以下两个检测（如图 2E-2F 和图 3A-3C 所示）提供了在常规琼脂培养皿上使用该系统进行点样检测的示例。在这里，我们将重点介绍如何处理和设置这些实验，而在下一个示例（图 4）中，我们将重点介绍如何收集和分析这些点样检测的数据。图 2E-2F 展示了表达 NleG6-2 的自泛素化系统和所示对照的大肠杆菌菌株的生长曲线，以及它们的量化。如下所述，这些测定在琼脂板上进行。同样，在图 3A-3C 中，显示了 Rpn10 的 PPI 和泛素化分析，使用相同的现场分析程序。
a. 准备LB 琼脂迷你 (50 mm) 板，辅以所需的 CAM 浓度（在 2 – 32 μg /mL 之间；如上所述，在 96 孔板测定中）。
b. Spot 2.0 – 2.5 μL调整后的外径600 (0.2)琼脂板上的培养物。我们建议发现每个应变至少三个技术重复来计算标准偏差。
c. 板下方的网格印刷可能有助于点样阵列。
d. 用黑色培养皿盖盖住盘子，然后安装在扫描仪上（图 4）。
注意：将板底面朝下安装在扫描仪上；扫描仪扫描琼脂。黑色盖子可防止塑料盘上的斑点反射。我们用标准黑色哑光喷漆（在内侧，以消除反射）喷涂兼容的培养皿盖，并用 70% 乙醇对盖进行消毒，以供多次使用。或者，可以购买预制的黑色盖子，或使用可以高压灭菌的玻璃培养皿盖子（图 4）。

图 3. 蛋白质-蛋白质相互作用、泛素化和小分子调节剂的分离 CAT 测定。
μg /mL CAM的选择性琼脂培养基上的非共价结合。 (A) 播种后 24 小时的代表性扫描。 (B) 使用时间序列分析器 V3 插件获取的相对增长曲线。在 A 中表示的 36 小时内扫描的量化，具有标准偏差 (n = 3)。 (C) B 中曲线的相对累积增长。B 中显示的积分的单个值（曲线下面积），以具有标准偏差 (n = 3) 的条形图表示。 (D) E1 抑制剂 PYR-41 (50 μM) 在液体培养基 (24 μg /mL CAM)中阻止 Rpn10 泛素化依赖性生长。

e. 在28 – 37 °C 下孵育板12 – 48 小时，并以 0.5 – 2 小时的间隔扫描图像，使用 SAMPLE 软件进一步量化和分析生长效率（延时扫描）。 SAMPLE 软件的这种孵化和使用将在后面的部分中进一步讨论。
图 2D 和 2E 展示了 NleG6-2 自泛素化测定的结果，上面描述了琼脂板上的点样测定。
注：本实验中 CAM 浓度为 12 μ g / mL。在液体或固体培养基上的生长呈现不同的抗生素耐药性。

用于蛋白质-蛋白质相互作用、泛素化和小分子调节剂的分离 CAT 分析
Split-CAT 系统可以报告非共价 PPI、共价 PPI（如泛素化）和小分子调节剂的活性。为了演示这三个实用程序，我们选择了 Ub 受体 Rpn10 作为结合和/或泛素化的报告器（图 3 和视频 1）。 Rpn10 是蛋白酶体的泛素受体之一，它以非共价方式结合泛素。我们发现这种非共价结合将 Rpn10 泛素化导向特定的赖氨酸残基（Keren-Kaplan 等人，2012）。因此，Rpn10 作为结合和泛素化的报告基因（图 3A - 3C）。由于泛素化将动态的非共价结合转变为稳定的共价键（由于细菌中缺乏去泛素化和降解），它显着增加了组装的分裂 CAT 的稳定性，从而提供了对显着更高的 CAM 浓度的抵抗力。 Levin-Kravets等人，2021 年）。此外，与其他 Ub 受体（也称为含 UBD 的蛋白质）一样，Rpn10 直接通过 E2 进行泛素化（Levin- Kravets等人，2016）。这简化了所呈现的系统，因为我们不需要 E3。上述测定是在 LB-琼脂板上进行的，以证明它们的简单性。

视频 1. 细菌生长延时显示 Rpn10：泛素非共价结合与泛素化。

对于小分子筛选，建议使用液体 LB 代替 LB 琼脂，因为它允许使用 96 和 384 孔板。在图 3D 中，我们展示了系统对 E1 抑制剂小分子 PYR-41 的反应（Yang 等人，2007）。请注意，由于 Rpn10 以非共价方式结合泛素（图 3A - 3C），我们将 CAM 浓度从 12 增加到 24 μg / mL 以检测 E1 抑制的影响。在 24 μ g /mL CAM 时，与 Rpn10 结合的非共价泛素不会促进生长，但如图 3D 所示，泛素化会促进生长。由于泛素化（共价结合）而不是非共价结合，分裂 CAT 片段的组装支持在该浓度下的选择性生长。

使用平板扫描仪收集数据
在将细菌发现到 LB 琼脂培养皿上后，将盘子底部朝下安装在位于孵化器中的办公室平板扫描仪上（即，通过琼脂扫描斑点；图 4A）。为了以定义的时间间隔（通常为 30 – 60 分钟）从扫描仪捕获延时图像，我们开发了一个名为 SAMPLE（用于实验室实验的扫描仪采集管理程序，图 4B – 4C）的专用软件，该软件可从我们的网站获得或在github ( https://github.com/PragLab/SAMPLE ) 中。该软件适用于 Windows 7 或更高版本。 SAMPLE 将自动识别连接到计算机的扫描仪，并安装了与 Windows 图像采集 (WIA) 兼容的驱动程序，即扫描仪的原始制造商驱动程序。它允许多个扫描仪使用一台计算机同时监控增长。 SAMPLE 是使用 Python（Python Software Foundation，版本 3.8， https: //www.python.org）编写的，但可作为独立的 Windows 可执行文件使用。图 4B – 4C 显示了该软件的图形用户界面。

图 4. SAMPLE：用于捕获延时扫描的数据采集软件。
(A) 平板扫描仪在孵化器中堆放着黑色覆盖的盘子。 (B) SAMPLE 包括一个简单的图形界面，允许用户初始设置延时扫描的参数。 (C) 第二个窗口显示扫描过程的进度。

扫描和分析的数据量化
使用斐济或 ImageJ 对扫描（图像）进行分析和量化。首先，从http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html下载“Time Series Analyzer V3”插件算法并将其安装到 ImageJ/Fiji 中。

图 5. 使用斐济对检测进行量化。
(A) 将扫描图像序列导入斐济。 (B) 裁剪图像。 (C) 使用“时间序列分析器”和 (D) 量化选定的 ROI选择点。

1. 要导入扫描，请单击“文件”菜单→ 选择“导入” → “图像序列” →选择选定的图像目录→选中“使用虚拟堆栈” →单击“确定”（图 5A）。
2. 裁剪图像以方便分析。选择板的区域→单击“图像”菜单→裁剪（图 5B）。
3. 从“插件”菜单中调用“时间序列分析器V3” →选择“自动ROI（感兴趣区域）属性” →调整为“25 × 25”（像素。） →选中“单击时添加” →单击所需点集的中心（将出现显示 ROI 的圆圈；图 5C）。
4. 点击“时间序列 V3”窗口中的“获取平均值”按钮（“时间跟踪平均值”和“绘图值”窗口，包括绘图和字母数字数据，将出现；图 5D）。
5. 将原始数字数据复制到电子表格（如 MS Excel） →组合不同文化类型的数据。我们建议在至少三个独立的细胞培养物中重复点样测定。
6. 我们忽略派生的标准误差，并使用原始数据来计算标准偏差。
7. 要制作延时电影，可以将“图像序列”保存为各种格式（使用“另存为”选项），例如 AVI 或动画 Gif（参见视频 1 ）。
注意：根据需要更改每个点的 ROI 属性和样本数。在选择所需的 ROI 时，请选择光斑中心的同质区域以避免边际效应。

在斐济量化之后，我们使用 Synergy 软件KaleidoGraph进行数据分析，包括 sigmoidal 曲线拟合和积分计算。其他商用软件，例如SigmaPlot ，可能适用。鉴于对此类软件的访问有限，人们可以跳过曲线拟合并通过使用Microsoft Excel将整个测量的密度随时间求和来估计累积增长，并将其呈现为具有适当标准偏差的条形图。

致谢

我们感谢宜兰来自耶路撒冷希伯来大学医学院的Rosenshine ，感谢您提供 NleG6-2 的质粒 DNA。这项研究得到了以色列科学基金会（赠款编号 651/16 和 1440/21）和德意志癌症研究合作计划的支持 Krebsforschungszentrum (DKFZ) 和以色列科技部 (MOST)，以及以色列癌症研究基金 (ICRF) 的加速资助计划，奖励编号：940283。目前的协议源自 Split-CAT 系统的原始论文，由 Levin- Kravets等人发表在分子生物学杂志(JMB) 上。（2021 年）。

利益争夺

GP 拥有Coltac治疗有限公司的股权，其他作者声明没有竞争利益。
公司及专利：专利：US10982252、US20200385706 和 US20210356467。

参考

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