材料和试剂
材料
1.平板电泳仪和 Multiphor II 电泳装置（带陶瓷冷却板），GE Healthcare，IL，USA（或同等产品）
2.电源
3.低温恒温器，Modell MultiTemp III，（Cytiva，乌普萨拉，瑞典）
4.电吹风
5.卧式摇床
6.pH计
7.涡流混合器
8.水浴（最高 90 °C）
9.移液器和吸头
10.塑料试管 12 x 55 mm
11.玻璃和塑料实验室托盘，大约 14 x 26 x 6 cm
12.玻璃板，浮法玻璃，11.5 x 23.0 x 0.2 cm（或同等尺寸）
13.电泳板夹
14.用于凝胶板的橡胶密封件，U 形切口，约 1.5 mm 厚
15.矩形切割橡胶密封件，长 10 毫米，宽 4 毫米，厚 1.5 毫米
16.一次性注射器、插管和锁定锥
17.用于琼脂糖凝胶的 GelbondFilm 124 x 258 mm（产品：80112932；Cytiva，Uppsala，瑞典）
18.色谱纸 1CHR（ Whatman WHA1001917 ；Sigma，Vienna，Austria）和 3CHR（Whatman WHA3003917；Sigma，Vienna，Austria ）
19.纸巾/厨房卷纸
20.实验室天平

试剂
1.净化水
2.琼脂糖 SEAKEM HGT（产品 50040；Lonza，Rockland，USA）
3.Agarose Biozym Plaque Agarose （产品 840101；Biozym Scientific GmbH，奥尔登多夫，德国）
4.三（羟甲基氨基甲烷）
5.十二烷基硫酸钠颗粒 (SDS)
6.乙二胺四乙酸二钠盐 EDTA
7.氯化钠
8.甘氨酸
9.溴酚蓝
10.海卫 X100
11.Na 2 HPO 4 · 2H 2 O
12.NaH 2 PO 4 · H 2 O
13.抗体兔抗人 VWF（产品 A0082 DAKO，Agilent Technologies，Glostrup，丹麦）
14.山羊-抗-兔-IgG-ALP-偶联的二抗。（产品 111-055-003；Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA）
15.AP 偶联底物试剂盒（产品 1706432，BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA）
16.人类正常血浆池（例如，Precision Biologics，Rockville，USA）
17.0.9% 氯化钠
18.分离凝胶缓冲液（参见配方）
19.堆积凝胶缓冲液（见配方）
20.样品缓冲液（见配方）
21.电泳仪运行缓冲液（见配方）
22.溴酚蓝溶液（见配方）
23.用于免疫染色的 PBS 缓冲液（在凝胶染色中）（参见食谱）
24.洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液（见配方）

设备

1.密度计 GS-900（ BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA ）
2.Software Image Lab (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) 和/或 Image Quant TL (Cytiva, Uppsala, Sweden)
3.带冷却装置的 Multiphor II 电泳系统（图 1）。
4.微波炉

图 1.电泳系统：冷却装置（左）和平板装置（右）

程序

A.为手工琼脂糖凝胶准备玻璃盒
1.在平面玻璃板上，将矩形橡胶密封件（长 10 毫米；宽 4 毫米；厚 1.5 毫米）粘在玻璃板的长边（纵向边缘下方 1.5 厘米） —— 14 块以规则间隔的距离。这些将形成样品的装载井（图 2A）。
2.在工作台上放置一个单独的平面玻璃板（11.5 × 23.0 × 0.2 厘米）。将gelbond薄膜剪成23厘米长。用几滴纯净水，将凝胶粘合膜及其疏水侧固定在玻璃板上，避免气泡（图 2B）。
3.弄湿 U 形橡胶密封件并将其放在凝胶薄膜上（图 2C）。将另一块玻璃板与装载橡胶密封件放在顶部，使其形成铸模（盒式）（图 2D）。
4.用夹子固定玻璃盒（图 2E）。

图 2. 凝胶盒的制备。
B.分离胶的浇注
注意：热液体，小心处理。穿戴防护设备以防止受伤。
1.准备 1% 的琼脂糖凝胶。用 50 mL 的分离凝胶缓冲液悬浮 0.5 g 琼脂糖 SEAKEM HGT，并在微波炉中加热溶液（例如，900 W；当液体开始起泡时中断加热，从烤箱中取出，轻轻搅拌；重复该过程直至完全溶解）。将此溶液吸入 50 mL 注射器中，用锥形关闭注射器，并在约 90 °C 的水浴中孵育约 30 分钟。
2.将玻璃盒直立放置在 60 ± 5 °C 的预热水浴中。要浇注凝胶，在注射器上放置一个套管，然后将热琼脂糖慢慢填充到玻璃盒中（在玻璃盒的上侧），直到加载井下方约 1 厘米。
3.将玻璃盒从水浴中取出，让凝胶凝固。在室温 (RT) 下保持约 1 小时，直立。

C.浓缩胶的浇注
注意：热液体，小心处理。穿戴防护设备以防止受伤。
1.在微波炉中用 25 mL 的浓缩凝胶缓冲液悬浮 0.2 g 琼脂糖 SEAKEM HGT，直至完全溶解。冷却至大约 60 – 70 °C，将琼脂糖移至分离凝胶顶部，直至到达盒式磁带的上端。
2.程序F保留少量浓缩胶。
3.让凝胶在 RT 下设置约 1 小时。小心取下夹子和上玻璃板，打开玻璃盒。用粘合剂琼脂糖凝胶取出凝胶粘合膜。

D.准备电泳仪
1.打开低温恒温器以将平板陶瓷板冷却到大约 10°C。
2.将运行缓冲液（每个平板室约 1 L）添加到凝胶室两端的储液罐中。
3.在陶瓷板上滴几滴运行缓冲液，然后将凝胶放在凝胶粘合膜的顶部，加载孔位于阴极侧。
4.浸有电泳缓冲液的滤纸（1CHR）如下放置：五层纸（23 cm × 15 cm），一端在阴极缓冲容器中，另一端贴在凝胶的阴极端（不要与凝胶），并在顶部另外五层稍微重叠琼脂糖凝胶（与样品应用孔保持约 1 厘米的距离）。在凝胶的阳极端重复相同的步骤，用五层 23 cm × 15 cm 的纸和五层 23 cm × 23 cm 的纸。

E.样品制备/装载
注意：热液体，小心处理。穿戴防护设备以防止受伤。
1.使用 0.9% NaCl 作为稀释剂，将样品和检测控制稀释到相同的 VWF 浓度（最好是 1 IU VWF:Ag/mL）。
2.将 0.2 g Biozym Plaque Agarose 与 10 mL 样品缓冲液混合，在微波炉中加热直至完全溶解。在水浴中冷却至约 60 °C。
3.混合 50 μL 稀释样品、50 μL 样品缓冲液、10 μL 溴酚蓝溶液和 100 μL Biozym Plaque Agarose。
4.在 60 ± 5 °C 下孵育 20 ± 5 分钟。
5.每个加载井加载 50 μL 的体积。

F.电泳
1.盖上盖子，开始电泳。
2.运行时间：15-20 小时。
3.运行条件：25 mA 恒定 1-3 小时，直到样品完全从孔中流出。中断运行以用浓缩凝胶 (30 µL) 填充空井。用 8-10 mA 继续分离 14-16 小时，直到溴酚蓝线到达凝胶末端。

分离后，VWF 多聚体通过直接凝胶内染色或印迹转移后进行可视化。下面的协议仅描述了凝胶内程序。

G.在凝胶免疫染色中
干燥凝胶
1.凝胶运行完成后，取下滤纸并在水平摇床上用纯净水洗涤凝胶约 1-3 小时，换水至少 5 次。溴酚蓝线应该不再可见。
2.将凝胶按压 45 分钟：将两张用纯净水浸泡过的色谱纸 (3CHR) 放在凝胶上，再放两张干纸和五张厨房毛巾。将一个玻璃板放在上面，然后用大约 2 kg 的重量按压（例如，将两个 1 L 的瓶子放在上面）。
按压后，取出所有纸片，将凝胶固定在工作台上，并用吹风机小心地将凝胶干燥约 30 分钟。
免疫染色
注意：以下程序用于检测人类 VWF。为了可视化来自其他物种的 VWF，需要选择适当的抗体。

一抗：兔抗人-VWF (A0082)
1.将凝胶放入托盘中。
2.抗体在洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液中稀释至 1 µg/mL。制备每凝胶 100 mL 的溶液，然后添加到托盘中。
3.在温和搅拌（摇床）下孵育凝胶约 16 小时。
4.倒出抗体溶液，用洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液洗涤凝胶 5 小时。

二抗：山羊抗兔IgG-ALP偶联
5.用洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液将二级抗体稀释至 0.6 μg/mL（每凝胶 100 mL）。
6.将凝胶放入稀释的二抗中，轻轻搅拌孵育约 16 小时。
7.倒出二级抗体，在洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液中洗涤凝胶 1 小时。
8.在 PBS 缓冲液中重复洗涤过程 3–4 小时以进行免疫染色（不含 Triton X100），至少更换缓冲液五次。

根据 AP-Kit (Bio-Rad) 的包装插页进行免疫染色
9.从 AP-Kit 中制备含有 4 mL 试剂盒缓冲液、1 mL 试剂 A 和 1 mL 试剂 B 的溶液。用纯净水填充至 100 mL。
10.使用新托盘。将凝胶放入染色溶液中，在室温下在摇床上孵育约 10-30 分钟。孵育时间取决于条带强度。条带必须清晰可见，没有明显的背景污点。
11.将凝胶放入纯净水中以停止染色。用纯净水清洗约 20 分钟。
12.用胶带将凝胶水平固定在两侧，然后通过风干或吹风机干燥凝胶。

数据分析

凝胶可以通过并排分析进行视觉分析——多聚体的数量，可以用肉眼计数，可以记录（图 3）或通过光密度测定（图 4）。

数字 3 . VWF 多聚体凝胶。
多聚体凝胶。泳道 1-4：重组 VWF。泳道 5：正常人血浆池。

对于光密度分析，使用光密度计 (GS 900) 扫描凝胶并使用适当的软件（例如 Image Lab 或 Image Quant TL）进行分析。
对于每个泳道，分离凝胶顶部和最低多聚体带（对应于 VWF 二聚体）之间的距离被指定为 1.0 的迁移值。然后测量样品泳道中最大 VWF 多聚体带的距离并表示为该距离的一部分，表示为相对迁移距离(R f )。因此，样品车道中所有其他多聚体占据的 VWF 二聚体带的总迁移距离的比例为 1-R f （图 4）。

图 4.光密度分析（详细信息在 Turecek 等人，2021 年进行了描述）。
VWF：将测试样品的 Ag 浓度调整到 1 IU/mL 并在 1% 琼脂糖凝胶上分离，然后进行免疫染色和光密度测定。多聚体图案（左）和密度图（右）。 “a”是最大 VWF 多聚体的迁移距离，“b”是最小 VWF（二聚体）的迁移距离，迁移值为 1.000。

为了能够在不同的电泳凝胶运行之间进行比较，该值报告为在同一凝胶上分离的正常血浆样品的 1-R f值的百分比。增加的百分比值表明测试样品中存在 UHMW VWF 多聚体。
在本例中，最大 VWF 多聚体的相对迁移距离 (Rf) 为 0.392。因此，VWF 多聚体（从最小到最大）占据的分离通道比例为 1-Rf，在本例中，计算为 1.000 – 0.392 = 0.608。测试样品的 1-Rf 值可以计算为在同一凝胶上运行的对照样品的 1-Rf 的百分比，以使结果标准化。

食谱

1.分离凝胶缓冲液
酸碱度pH 8.8 ± 0.1
原料0.375 M Tris
0.1% SDS
制备：用大约 800 mL 的纯净水溶解 45.43 g Tris 和 1 g SDS，用 25% HCl 将 pH 值调节至 8.8 ± 0.1，并加注至 1,000 mL。

2.S粘胶缓冲液
酸碱度酸碱度 6.8 ± 0.1
原料0.125 M Tris
0.1% SDS
制备：用大约 400 mL 的纯净水溶解 7.57 g Tris 和 0.5 g SDS，用 25% HCl 将 pH 值调节至 6.8 ± 0.1，并填充至 500 mL。

3.样品缓冲液
酸碱度pH 8.0 ± 0.1
原料0.01 M Tris
0.001 M EDTA
2% SDS
制备：用约 80 mL 的纯净水溶解 0.121 g Tris、0.0372 g EDTA 和 2.0 g SDS，用 25% HCl 调节至 pH 8.0 ± 0.1，并加注至 100 mL。

4.电泳仪运行缓冲液
酸碱度pH 8.4 ± 0.1
原料0.05 M Tris
0.384 M 甘氨酸
0.1% SDS
制备：用 2,000 mL 纯化水溶解 12.11 g Tris、57.65 g 甘氨酸和 2.0 g SDS。 pH值自动达到8.4±0.1。

5.B溴酚蓝溶液
原料溴酚蓝
样品缓冲液
制备：在 50 mL 样品缓冲液中溶解 0.1 g 溴酚蓝。

6.洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液
原料海卫 X100
用于免疫染色的 PBS 缓冲液
制备：在 1000 mL 的 PBS 缓冲液中稀释 10 g Triton X100 用于免疫染色。

7.PBS-B 缓冲液（在凝胶染色中）
酸碱度pH 7.4 ± 0.1
原料0.01 M Na 2 HPO 4 · 2H 2 O
0.01 M NaH 2 PO 4 · H 2 O
0.154 M 氯化钠
制备：将两种缓冲溶液混合至 pH 7.4 ± 0.1。
PBS溶液二级磷酸盐的制备：
将 17.8 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O 和 90 g NaCl 溶解在 10L 纯净水中。
PBS溶液初级磷酸盐的制备：
将 5.52 g NaH 2 PO 4 · H 2 O 和 36 g NaCl 溶解在 4L 纯净水中。
用PBS 溶液初级磷酸盐稀释大约 5 L 的PBS 溶液次级磷酸盐，使其达到 pH 7.4 ± 0.1。

8.洗涤缓冲液/抗体稀释缓冲液
原料海卫 X100
用于免疫染色的 PBS 缓冲液
制备：在 1000 mL 的 PBS 缓冲液中稀释 10 g Triton X100 用于免疫染色。

致谢

Fritz Elsinger 于 1980 年代中期在我们的实验室实施了基本协议。从那时起，我们一直在使用所描述的电泳方法进行 VWF 多聚体分析。多年来，该协议通过细微的改进不断优化。这些是与许多研究该方法的技术人员合作制定的。我们感谢 Alena Kratochwil、Ingrid Neunteufl、Gertrude Maurer、Gabriele Müllner、Nina Pruckner、Astrid Bogat 和 Jul lia Lasnik 的专家技术支持。

利益争夺

HG、PLT 和 MS 是武田旗下公司 Baxalta Innovations GmbH 的员工，PLT 持有相关的武田专利和武田股票。

参考

1.Aihara, M.、Sawada, Y.、Ueno, K.、Morimoto, S.、Yoshida, Y.、de Serres, M.、Cooper, HA 和 Wagner, RH (1986)。使用亲和素-生物素过氧化物酶复合物通过免疫酶染色可视化血管性血友病因子多聚体。血栓血红蛋白55（2）：263-267。
2.Bryckaert, M., Rosa, JP, Denis, CV 和 Lenting, PJ (2015)。冯维勒布兰德因子和血小板。细胞分子生命科学72（2）：307-326。
3.Favaloro, EJ, Pasalic, L., Henry, B. 和 Lippi, G. (2021)。 ADAMTS13 的实验室测试：TTP 诊断/排除等实用程序。 Am J Hematol 96（8）：1049-1055。
4.Lillicrap, D. (2013)。 von Willebrand 病：发病机制理解、诊断和治疗的进展。血液122（23）：3735-3740。
5.Meyer, D.、Obert, B.、Pietu, G.、Lavergne, JM 和 Zimmerman, TS (1980)。 von Willebrand 病中因子 VIII/von Willebrand 因子的多聚体结构。实验室临床医学杂志95（4）：590-602。
6.Peyvandi, F.、Kouides, P.、Turecek, PL、Dow, E. 和 Berntorp, E.（2019 年）。血管性血友病替代疗法的演变：从血浆部分到重组血管性血友病因子。血液 Rev 38：100572。
7.Ruggeri, ZM 和齐默尔曼, TS (1981)。 VIII因子/von Willebrand因子的复杂多聚体组成。血液57（6）：1140-1143。
8.Seth, R., McKinnon, TAJ 和 Zhang, XF (2022)。 von Willebrand 因子/ADAMTS13 失衡对 COVID-19 凝血病的贡献。 Ame J Physiol Heart Circ Physiol 322（1）：H87-H93。
9.Schneppenheim, R. 和 Budde, U. (2011)。 von Willebrand 因子：多域和多功能蛋白质的复杂分子遗传学。 J Thromb Haemost .9，增刊 1：209-15 。
10.Turecek, PL, Gritsch, H., Pichler, L., Auer, W., Fischer, B., Mitterer, A., Mundt, W., Schlokat, U., Dorner, F., Brinkman, HJ, van Mourik , JA 和施瓦茨, HP (1997)。在患有血管性血友病的狗中重组血管性血友病因子的体内表征。血液90（9）：3555-3567。
11.Turecek, PL, Peck, RC, Rangarajan, S., Reilly-Stitt, C., Laffan, MA, Kazmi, R., James, I., Dushianthan, A., Schrenk, G., Gritsch, H. 等人。（2021 年）。重组 ADAMTS13 可降低重症 COVID-19 患者血浆中异常上调的血管性血友病因子。血栓形成研究201：100-112。
12.Turecek, PL, Schrenk, G., Rottensteiner, H., Varadi, K., Bevers, E., Lenting, P., Ilk, N., Sleytr, UB, Ehrlich, HJ 和 Schwarz, HP (2010)。重组血管性血友病因子候选药物的结构和功能。 Semin Thromb Hemost 36（5）：510-521。
13.Turecek, PL, Spannagl, M., Kragh, T., Allmaier, G., Turecek, M., Schrenk, G., Gritsch, H., Obermann-Slupetzky, O., Ewenstein, BM and Valentino, LA (2017 ）。超大多聚体在重组人血管性血友病因子中的作用——对体内模型和血管性血友病患者的物理和生化研究和发现的回顾。 Hamostaseologie 37（S 01）：S15-S25 。
14.Vangenechten, I. 和 Gadisseur, A. (2020)。改善冯维勒布兰德病的诊断：冯维勒布兰德因子多聚体分布的参考范围。 Res Pract Thromb Haemost 4(6):1024-1034 。