材料和试剂

1. C57BL/6JRccHsd 小鼠（ Envigo ，荷兰）
注意：雌性和雄性小鼠，8-12 周龄。到达设施后，小鼠接受 7 天的适应环境。将小鼠饲养在无特定病原体 (SPF) 的条件下，昼夜循环 12 小时，随意获取饮用水和标准食物（3432 维持维生素强化，辐照 > 25 kGy ，KLIBA NAFAG， 3432.PX .V 20)。环境室温为 20 ± 2 °C，湿度保持在 50 ± 10%。
2. 盐水 0.9% (B. Braun Medical AG, Swissmedic : 29554)
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
3. 眼膏（Vitamin A Blache ，博士伦瑞士公司， Swissmedic ：22398 ）
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
4. 盲肠浆液，如前所述制备(Starr et al., 2014)
储存在-80°C。细菌存活率维持在 99.5% 长达六个月（Starr 等人，2014）。
5. 异氟醚（ Attane TM ，Isoflurane ad us. vet.，Provet AG，Piramal Critical Care， Swissmedic ：56761002 ）
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
6. 丁丙诺啡 0.3 mg/1 mL（Temgesic ® ，Indivior Schweiz AG，Swissmedic：41931）
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
7. 芬太尼 0.1 mg/2 mL ( Sintetica SA, Swissmedic : 53987)
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
8. 美托咪定 1 mg/1 mL （ Medetor ® ad us. vet., Virbac AG, Swissmedic : 58407002）
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
9. 咪达唑仑 15 mg/3 mL（ Dormicum® ，CPS Cito Pharma Services GmbH ， Swissmedic ：44448 ）
在室温下储存。有关保质期，请参阅制造商说明。
10. 三重混合（见食谱）
11. 70% 乙醇（见配方）
在室温下储存。
12. 丁丙诺啡工作溶液（见配方）

设备

缝合材料

1. 带有 RB-1 针的聚丙烯缝合线 4-0（1.5 Ph. Eur.）（Ethicon，目录号：8871H）
2. 聚丙烯缝合线6-0（0.7 Ph. Eur.），带有P-1针（Ethicon，目录号：MPP8697H）
3. Polyglactin 910缝合线4-0（1.5 Ph Eur.），可吸收（Ethicon，目录号：V1224）

针头和注射器

1. 26 G × 3/8''针（BD Microlance TM 3 ，目录号：300300）
2. 25 G × 5/8'' 针（BD Microlance TM 3，目录号：300600）
3. 1 mL Luer lock注射器（BD PlastiPakTM ，目录号：303172）
4. 0.5 mL Insulin-50 注射器，G30 0.3 × 0.8 mm（ Omican ® ，B. Braun Medical AG，目录号：9151117S）

回缩系统

1. 小底板（20 × 30 cm）（Fine Science Tools，目录号：18200-03）
2. 2个短固定器（Fine Science Tools，目录号：18200-01）
3. 2个高固定器（Fine Science Tools，目录号：18200-02）
4. 弹性体（2 m 卷）（Fine Science Tools，目录号：18200-07）
5. 2个钝的牵开器（2.5 mm宽）（Fine Science Tools，目录号：18200-10）
6. 2个锋利的牵开器（0.5毫米宽）（精细科学工具，目录号：18200-08）

手术器械

1. 手术剪 – ToughCut ® （精细科学工具，目录号：14054-13）
2. 学生细剪刀（Fine Science Tools，目录号：91461-11）
3. Adson 镊子（Fine Science Tools，目录号：11027-12）
4. 精致的缝合打结钳（Fine Science Tools，目录号：11063-07）
5. Graefe镊子，1*2 齿（Fine Science Tools，目录号：11054-10）
6. 钝头钳（例如， Fine Science Tools，目录号：11651-10）
7. Crile 止血剂（Fine Science Tools，目录号：13004-14）
8. 持针器 - Durogrip ® （ Aesculap ，目录号：BM012R）

附加设备

1. 蒸汽指示带（3M Health Care，目录号：1322-24MM）
2. 高压灭菌器（MELAG、 MELA tronic ® 23）
3. 秤（Mettler Toledo，目录号：PE 2000）
4. Aesculap Isis 啮齿动物剃须刀（ AgnTho's ，目录号：GT421）
5. 加热垫（ Beurer GmbH，目录号：HK 40）
6. 手术显微镜
7. 手术胶带
8. 兽医手术台加热垫（ Peco服务， Mediheat V500DVstat）
9. 手术单，45 × 37 cm（3M Health Care，目录号：9067）
10. 纤维素交换（ Cosanum AG，目录号：630045212044）
11. 麻醉系统 ( Rothacher Medical GmbH, Combi-vet ® )

注意：此处描述的技术通常会导致无血外科手术。因此，经验丰富的手中不需要烧灼装置。对于没有经验的小动物外科医生，我们建议准备好烧灼装置（例如，低温烧灼套件，FST Fine Science Tools，18019-00）。

程序

A. 手术设备的准备

1. 高压灭菌手术器械。
注意：或者，手术器械可以随后浸入 70% 乙醇（3 分钟）和 ddH 2 O（3 分钟）中。
2. 用 70% 乙醇清洁工作表面、加热板和回缩系统。
3. 用 1-2个手术布盖住加热板，并将加热板温度调整到 37°C。
4. 在加热板上将丁丙诺啡（0.05 毫克/毫升工作溶液）预热至 37°C。
5. 安排手术设备（图 2A - 2C）。
注意：止血器开口宽度最大约为5 毫米（尖端距离）。这有助于生成相同大小的腹膜按钮。 Adson 钳柄上的标签有助于在壁层腹膜的不同部位形成腹膜按钮（图 2B）。

B. 麻醉和术前准备

1. 称量鼠标并记下体重。
2. 将鼠标放入感应室进行麻醉，在医用氧气中使用 5% v/v 异氟醚（1.2 升/分钟）。
3. 将麻醉的鼠标放在手术布/加热板上，以防止体温过低，并通过鼻锥在医用氧气（1.2 L/min）中使用 2.5% v/v 异氟醚保持麻醉。
注意：通过脚趾和眼睛反射评估麻醉深度。如有必要，调整百分比 v/v 异氟醚。在整个手术过程中监测小鼠的呼吸频率。如有必要，调整百分比 v/v 异氟醚。
4. sc ) 股骨注射应用 0.1 mg/kg 体重预热的丁丙诺啡（0.05 mg/mL 工作溶液）。
5. 涂抹眼膏以防止眼睛干燥。
6. 将鼠标转向其背侧并用手术胶带固定四肢，以确保通过鼻锥进行适当的张力和持续的麻醉诱导。
7. 在腹部的每一侧旁边放置两个纤维素交换。
8. 使用啮齿动物剃须刀剃须腹部。
9. 使用两个纤维素交换去除头发，并使用手术胶带去除额外的头发。
10. 使用纤维素交换应用 70% 乙醇对剃过的皮肤进行消毒。
注意：在剃过的皮肤上少量涂抹乙醇，以减少过多的热量损失。

图 2. 设备和术前设置。
A.手术器械和材料放置在覆盖有无菌手术单的加热板上。 B.距离标记显示在 Adson 钳的手柄上，以便在创建腹膜按钮期间提供帮助。止血器的最大打开距离限制在大约 5 毫米，以便在腹膜纽扣形成过程中提供帮助。 C.所列项目对应于 (A) 和 (B) 中的相应字母。

C. 外科手术

1. 剖腹手术
a. 皮肤切口：进行中位垂直切口（约 25 毫米）（图 3A）：
i. 抓住腹部皮肤中线约 25 毫米低于剑突（ Graefe钳）。
ii. 剑突（手术剪刀）延伸，但不超过剑突。切口应为 25 毫米或从耻骨到剑骨，以较短者为准。
注意：确保在这一步不要渗透到腹腔。
b. 在腹膜壁上进行匹配的中位垂直切口（图 3B - 3C）：
i. 线穿孔（例如，使用细剪刀）。
注意：注意不要伤害腹腔内器官。这可以通过向上拉腹壁来实现。一旦白线穿孔，空气就会进入腹腔，将腹壁与下面的器官分开。
ii. 的通路向联合和剑突延伸，以匹配皮肤切口的长度（细剪刀）。
笔记：
1) 注意不要损伤腹腔内脏器。这可以通过在延长切口的同时向上拉腹膜壁来确保。
2)白线没有大血管，这种切口技术不应导致任何可见的出血。如果发生出血，直肌之一腹部肌肉很可能受伤了。这可以通过使用透热疗法来挽救。我们仅使用纤维素棉签清洁皮肤。我们完全不建议在腹腔内使用纤维素，因为这可能会影响难以标准化的粘连形成。
c. 暴露腹腔后，在开口的每个角落放置一个牵开器。调整固定器的距离，确保良好地进入腹腔（图 3D）。

图 3. 剖腹手术。
A.使用手术剪刀和镊子在腹部皮肤上进行正中垂直切口。 B.腹壁用细剪刀穿过白线（黑色箭头）。轻轻向上拉腹壁可防止腹膜内器官损伤。 C.切口长度为 25 毫米（距离 d）或从耻骨到剑突，以较短者为准。 D.如图所示，通过放置四个牵开器来暴露腹膜腔。比例尺 (A – D)：5 毫米。

粘连由三个模块化组件（图 1A - C）引起：腹膜按钮 (PB)、盲肠结扎和穿刺 (CLP) 和盲肠浆液 (CS)。典型的组件组合包括：PB 单独、PB + CLP 和 PB + CS。
2. 模块 1: 腹膜按钮 (PB) 形成 (图 1A)
a. 轻轻地将 Adson 钳的手柄从外侧按到腹膜壁（图 4A）。
注意：通过腹壁可以看到镊子手柄处的辅助距离标记。
b. 将顶叶腹膜的一部分（约 5 毫米）从第一象限的切口外侧夹住 8-10 毫米（图 4B - D ）。
注意：镊子手柄上的标签有助于标准化腹膜按钮的位置。控制最大止血器开口可以促进相同大小的腹膜纽扣的形成（另见注 A.5.）。
c. 使用聚丙烯缝合线 4-0（缝合捆绑钳、持针器）将抓握部分与三个后续手术结在其底部结扎（图 4E - F）。
d. 小心取出止血器（图 4G）。
e. 再重复上述步骤（C2a - d.）三次，在每个腹膜象限中产生一个按钮（图 4H）。
3. 模块 2：盲肠结扎和穿刺 (CLP) 程序（图 1B）
a. 小心地取出牵开器。
b. 使用钝的解剖钳或其他钝的手术工具（例如，持针器）定位盲肠。
注意：盲肠通常位于左下象限。
c. 轻轻调动盲肠并将其放在腹壁前面（图 5A）。
d. 用 polyglactin 910 缝合线4-0 将盲肠 (2 毫米) 结扎。用三个后续的手术结（缝合绑扎钳、持针器）将缝合线绑紧（图 5B - C）。
注意：理论上，严重程度可能会因结扎不同长度的盲肠而有所不同。然而，增加结扎盲肠部分的长度应在提交给当局的研究方案中明确说明，因为这可能导致动物的显着发病率和死亡率。
e. 使用25 G 针通过单次贯穿穿刺对结扎的盲肠进行穿孔（图 5D）。
f. 取下针头。
g. 穿刺两侧的一小部分粪便从结扎的盲肠排出。
h. 将盲肠移入腹腔。

图 4. 手术腹膜纽扣形成。
A.轻轻地将 Adson 钳的手柄压在腹壁上，可以进入腹膜。距离标记（黑色箭头，蓝线）支持标准化的腹膜按钮形成。 B.止血钳用于夹住腹膜壁的 5 mm 部分（距离 d）。 C.夹住腹膜部分。 D.止血器的轻柔缩回确保缝合线的良好接触。 E - F.使用聚丙烯缝合线 4-0 在夹紧的腹膜部分的底部创建三个连续的手术结。 G.右上象限的腹膜纽扣。 H.显示四个腹膜按钮中的两个（白色箭头）。比例尺 (A – H)：2.5 毫米。

图 5. 手术盲肠结扎和穿刺。
A.外露的盲肠。 B – C.使用 polyglactin 910 缝合线 4-0在距先端ceci 2 mm 距离（距离 d）处进行盲肠结扎。使用三个连续的手术结。 D.结扎的盲肠部分的穿孔是通过使用 25 G 针头的单次贯穿穿刺来实现的。缩写： ce = 盲肠。比例尺 (A – D)：2 毫米。

4. 模块 3：盲肠浆 (CS) 管理（图 1C）
a. 37°C 水浴中解冻冷冻 CS 。
b. 彻底混合 CS。
c. 可选：通过在 72 °C 下孵育 20 分钟进行 CS 的热灭活。
d. 100 μL CS（天然或热灭活）或相应的控制直接注入开放的腹腔。
注意：流体体积高达 100 微升通常可以用移液管将其移入腹腔，而不会影响随后的腹腔闭合。如果这种方法导致手术切口部位受到污染，也可以在关闭腹壁后使用 0.5 mL 胰岛素-50 注射器进行 CS。
e. 小心地取出牵开器。
5. 伤口闭合
a. 用全层缝合线（聚丙烯缝合线 6-0、（缝合线）镊子、持针器）关闭肌肉腹膜壁和皮肤。
注意：此连续缝合线和相应结的完整性绝对是最重要的。缝合失败会导致伤口感染或腹部爆裂，从而导致严重的痛苦和死亡。我们建议在开始实验之前对所有研究人员进行正式的小型啮齿动物手术培训。

D. 术后监测

1. 小心地取下固定胶带和鼻锥。
2. 将鼠标放回笼子中，笼子放在加热垫上。
3. 根据当局批准的协议监测小鼠。在我们手中，术前未经治疗的小鼠（C57BL/6 背景）没有发生败血症。尽管如此，由于败血症可能发生在其他人手中或当小鼠在手术前接受免疫抑制方案治疗时，我们强烈建议监测败血症迹象 [例如，鼠败血症评分(Shrum et al., 2014) ]，此外标准疼痛评分表。

E. 附着力评估（术后第 7 天）

1. 工作空间准备：
a. 用 70% 乙醇清洁工作表面。
b. 用手术单覆盖工作表面。
c. 准备高压灭菌手术器械、新鲜纤维素交换剂和手术胶带。
2. 称量鼠标并记下体重。
3. 胰岛素 50 注射器通过sc注射三重混合物（参见食谱，终端实验剂量 6 μL /g 体重）麻醉小鼠。
4. 注射后约 15 分钟通过脚趾和眼睛反射评估麻醉深度。一旦反射消失，鼠标就可以转移到手术单上。
5. 将鼠标转向其背侧，并用手术胶带固定四肢，以确保适当的张力。
6. 使用纤维素交换应用 70% 乙醇对腹部皮肤进行消毒。
7. 用 U 形切口（手术剪、Adson 钳）将皮肤从顶叶侧移向中线，从而暴露中线缝合线周围的腹膜。
8. 剪刀、钝钳）进入腹腔。
注意：在步骤 E7 和 E8 中使用不同组的手术器械，以保持腹腔没有毛发。
9. 粘连 (图 6A - F) 由两个不同的观察者根据所选的粘连评分方法进行评分, 在这种情况下, 腹膜粘连指数 (PAI) 方案 (图 1D, 表 1)。 PAI 评分是基于先前发表的评估粘附强度和血管形成的粘附评分的综合评分（ Mazuji ，1964；Nair，1974； Zühlke等人，1990； Coccolini等人，2013）。总 PAI 汇总了六个不同位置的个体粘连评分：PB 第 1象限、PB 第 2象限、PB 第 3象限、PB 第 4象限、中线切口和肠间。每个位置分数的范围从 0 级（最低）到 4 级（最高）。因此，每只鼠标的总 PAI 可以达到从 0（最小值）到 24（最大值）的值。在图 6A - F 中显示了在术后第 7 天评估的粘连示例：
a. 0 级：无粘附（图 6A）
b. 1 级：脆弱的附着力（图 6B）
c. 2 级：密集粘附（图 6C）
d. 3 级：纤维化和血管化粘连（图 6D）
e. 4 级：完全粘合（图 6E - F）
10. 如果需要，可以收集组织活检，例如腹膜纽扣和腹膜粘连，以进行进一步研究，例如组织学分析或流式细胞术。

图 6. 使用腹膜粘连指数 (PAI) 评估腹膜粘连。
A.腹膜纽扣（白色箭头）是游离的并被间皮覆盖。对应于 PAI 量表的 0 级。 B.腹膜纽扣（白色箭头）与大网膜连接的薄弱粘连，但在腹膜腔打开过程中自发分离。对应于 PAI 量表的 1 级。 C.一个致密的粘连将腹膜纽扣（白色箭头）连接到大网膜，并且直接分离而没有出血。对应于 PAI 量表的 2 级。 D.纤维化和轻微血管化的粘连将腹膜纽扣（白色箭头）连接到网膜。解剖后，会发生出血。对应于 PAI 量表的 3 级。 E.将肠系膜连接到腹壁的粘连完全覆盖了腹膜按钮（白色箭头）（只有缝线显示其位置）。对应于 PAI 量表的 4 级。 F.完全粘连将部分中线切口（黑色箭头）连接到腹腔器官，包括盲肠和肠道。解剖导致器官损伤。对应于 PAI 量表的 4 级。缩写： adh = 附着力； aw = 腹壁； ce = 盲肠；在=肠；我=肠系膜； om =网膜。比例尺 (A – F)：1.5 毫米。

数据分析

有关数据分析的详细信息在原始的、开放获取的出版物中提供（ Zindel等等人，2021a）。简而言之，根据手术后第 7 天的 PAI 评估接受本文所述手术程序（仅 PB、仅 CLP、PB + CLP、PB + CS）的小鼠的粘连。如原始研究的图 1d 所示文章中，单独的 PB 以及单独的 CLP 成功地诱导了相似程度的腹膜粘连。与单独应用每个程序相比，PB 和 CLP 这两种手术程序的组合导致了显着更高的腹膜粘连评分。在原始研究文章的补充图 1e 中，显示 PB + CLP 和 PB + CS 的组合导致可比较的腹膜粘连评分。在我们最近的出版物( Zindel et al., 2021a)中，数据代表每组 (n) 的独立动物。我们通常使用非参数检验 (Wilcoxon) 并使用 R 对多重检验进行校正。多重检验使用 Holm 的顺序 Bonferroni 事后检验进行校正，p = 0.05 被认为是显着性阈值。

笔记

在相关论文( Zindel et al., 2021a)中，只使用了雌性小鼠。然而，从那时起，我们开始同时使用雌性和雄性小鼠。我们的数据并未表明使用该模型的两性之间的粘连形成存在系统性差异。为了减少偏差，我们建议对程序进行培训，直到手术时间、粘附指数或其他质量指标达到稳定状态（即低标准偏差）。经验丰富的外科医生的平均 ( ± SD) 手术时间对于 PB + CLP 手术为 12.3 ( ± 1.5) 分钟，对于 PB + CS 手术为 10.6 ( ± 1.0) 分钟（未发表的数据，每组 n = 46 和 n = 18 只独立小鼠） .即使对于标准化良好的研究人员，所产生的粘附形成（粘附指数）的一些可变性也将保持不变。在我们手中，PB + CLP 的中位 (IQR) 粘附指数为 10 (3)，PB + CS 为 9 (3.25) [ Zindel等人报道。（2021 a ）图 1d-e，图 S1e]。

食谱

1. 70% 乙醇

试剂最终浓度数量
乙醇（绝对） 70% 700 毫升
ddH 2 O 不适用 300 毫升
全部的不适用 1000 毫升

2. 丁丙诺啡工作溶液（剂量 = 0.1 mg/kg 体重）

试剂最终浓度数量
丁丙诺啡 (0.3 毫克/毫升) 0.05 毫克/毫升 1毫升
氯化钠 0.9% 不适用 5 毫升
全部的不适用 6 毫升

3. 三重混合（最终实验剂量 = 6 μL /g 体重）

试剂最终浓度数量
芬太尼 (0.05 毫克/毫升) 0.017 毫克/毫升 1毫升
咪达唑仑 (5 毫克/毫升) 1.7 毫克/毫升 1毫升
美托咪定 (1 毫克/毫升)
盐水 0.9%
全部的 0.17 毫克/毫升
不适用
不适用 0.5 毫升
0.5 毫升
3 毫升

致谢

这项工作基于我们之前在Nature Communications上的出版物（辛德尔等。 , 2021a) 。资金由瑞士国家科学基金会( P1BEP3_181641) 和 Insel Gruppe AG教学与研究部提供的早期职业资助提供。我们感谢 T. Nussbaumer和 R. Tombolini对小鼠的繁殖和饲养。我们进一步感谢 R. Tombolini对手术模型的实验室管理和技术支持。我们感谢 F. Baier 为我们提供了专门的摄像设备和手术文档的技术指导。我们感谢 A. Keogh 的语言支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

瑞士的动物实验是根据瑞士联邦法规进行的，并得到了瑞士伯尔尼州动物实验委员会的批准（BE 18/17 和 BE 55/18）。在加拿大进行的动物实验符合加拿大的立法和政策，并得到了加拿大卡尔加里大学 (AC19-0148 JZ-PA) 的机构动物护理委员会的批准。

参考

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Coccolini ，F.， Ansaloni ，L.，Manfredi，R.， Campanati ，L.， Poiasina ，E.， Bertoli ，P.， Capponi ，MG， Sartelli ，M.，Di Saverio ，S.， Cucchi ，M.，等人。（2013）。腹膜粘连指数（PAI）：为医学和外科“被忽视的冰山”评分的提议。 World J Emerg Surg 8（1）：6。
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