材料和试剂

1. 96孔透明平底聚苯乙烯组织培养板（Corning，目录号：3596）
2. 15 mL Falcon 管（Corning，Falcon ® ，目录号：352097）
3. 试剂容器非无菌（VWR，目录号：89094-684）
4. 100％甲醇（ Thermo Fisher，目录号：A412-20 ），储存：室温
5. 蒸馏水，储存：室温
6. NaCl （ Sigma Aldrich，目录号：S3014-1KG ），储存：室温
7. KCl （ Sigma Aldrich，目录号： P9333-1KG ），储存：室温
8. KH 2 PO 4 （ Sigma Aldrich，目录号：P9791-500G ），储存：室温
9. Na 2 HPO 4 ·2H 2 O （ Sigma Aldrich，目录号：71643-1KG ），储存：室温
10. Triton X （ Sigma Aldrich，目录号：X100 ），储存：室温
11. Tween-20 （ Sigma Aldrich，目录号：P9416 ），储存：室温
12. 一抗（不同），储存：4 °C或 -20 °C ，取决于抗体
13. LI-COR 二抗（不同），储存：4 °C
14. 1 × PBS （见食谱）
15. 透化缓冲液（0.2% Triton X in 1 × PBS）（见配方）
16. 1 ×磷酸盐缓冲盐水 Tween-20 (PBST) （参见食谱）

设备

1. LI-COR 封闭缓冲液（ LI-COR，Odyssey，目录号：927-40003 ）
2. 多通道移液器（Mettler-Toledo International，目录号： L12-200XLS ）
3. Finnpipette TM Novus 多通道移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号： 46300800 ）

软件

1. Image Studio Lite（ LI-COR Biosciences， https://www.licor.com/bio/image-studio/ ）

程序

1. 在执行 ICW 之前，将 2,000 到 10,000 个细胞放在单孔中或在 96 孔板中重复放置，在适当的培养基中放置 24 到 48 小时。
注意：包括适当的阳性对照细胞和每个测定只含有培养基的空白孔。细胞数量可能需要针对细胞类型进行优化。
2. 在 -20 °C 下将 100% 甲醇冷却15 分钟。
3. 通过轻弹板去除媒体，然后使用多道移液器去除任何残留媒体（视频 1）。
注意：已确定将板轻弹在一叠纸巾上（将板快速倒置并轻轻敲击）以倾析介质优于机械去除。更少的细胞被破坏。对于贴壁较少的细胞尤其如此。

视频 1. 弹板程序。

4. °C下孵育 20 分钟（不晃动）。
笔记：
a. 甲醇应非常缓慢地沿每个孔的壁向下添加。
b. 请注意，井不会在整个过程中变干。对于 96 孔板中的几个孔，手动多道移液器就足够了。但是，对于高通量实验，建议使用电子多通道移液器（视频 2）。

视频 2. 使用电子多道移液器缓慢添加甲醇的程序。

5. 轻弹板以去除甲醇，然后使用多道移液器去除任何残留的甲醇。
注意：请参阅步骤 3 中的视频 1 了解轻弹过程。
6. 使用 150 μL 的透化缓冲液透化细胞，在室温下轻轻摇动 30 分钟。
7. 轻弹板以去除透化缓冲液，然后使用多通道移液器去除任何残留的透化缓冲液。
注意：请参阅步骤 3 中的视频 1 了解轻弹过程。
8. 使用 50 µL LI-COR 封闭缓冲液在室温下轻轻摇动 1.5 小时
注意：此时，该板可以在4 °C下储存过夜。储存超过 4 天的板需要检查细菌生长情况。
9. 轻弹板以去除阻塞缓冲液，然后使用多通道移液器去除任何残留的缓冲液。
注意：请参阅步骤 3 中的视频 1 了解轻弹过程。
10. °C下孵育过夜，轻轻摇动。
注意：建议使用经过 ChIP 或免疫荧光验证的抗体。每种抗体都需要针对浓度进行优化；由于抗体亲和力的差异，通常使用 1:50–1:500 的稀释度。
11. 小心去除抗体。这可以通过轻弹板或使用多通道移液器来完成，如果抗体将被保存。对于后者，应注意避免用移液器吸头破坏井底的细胞。为避免破坏细胞单层，将板倾斜至 ±45 °，并将移液器吸头放置在井壁和井底的界面处。慢慢地将抗体溶液移入移液器中。
注意：如果需要，一些一抗可以保存并重复使用。但是，必须分别确定每种抗体的重复使用次数。
12. 使用多通道移液器将 150 μL 的 PBST 添加到每个孔中，并在室温下将板放在振动筛上 5 分钟。
13. 轻弹板去除 PBST 。
注意：请参阅步骤 3 中的视频 1 了解轻弹过程。
14. 重复步骤 12 和 13 总共五次。
15. 加入 50 μL 的 1:800 二级抗体，用铝箔盖板以保护抗体免受光线照射，并在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。
注意：由于荧光抗体对光的敏感性，请务必在此步骤后将板盖上铝箔。
16. 小心去除抗体。请参见步骤 11。
17. 使用多通道移液器将 150 μL 的 PBST 添加到每个孔中，并在室温下将板放在振动筛上 5 分钟。
18. 通过轻弹板小心地取出洗涤缓冲液。
19. 重复步骤 17 和 18 总共五次。
20. 用 PBS 清洗 5 分钟，同时摇动盘子。
21. 轻弹板以去除 PBS，吸干板，清洁板底部，然后扫描。
注意：此时，由于板尚未被印迹用于内源控制，因此有必要确保在板中保持一层 PBS 以防止其变干。
22. 为了在 LI-COR Biosciences 软件上扫描板，请根据偏好选择“板”设置并聚焦在“4.0 mm”以及分辨率和质量。
注意：焦点设置为 4.0 毫米通常效果最好。但是，此设置可能需要根据所用印版的制造商进行调整。有关板的位置和软件设置，请参见下面的图 1 和图 2。

图 1. LI-COR 上的板位置，在本例中位于左下角。

图 2. LI-COR 上的印版设置，包括根据印版位置选择的扫描区域。

23. 用内源性对照抗体以 1:500 至 1:1,000 的稀释倍数在室温下重新印迹板 2.5 小时或在 4 °C下过夜。
24. 小心去除抗体。请参见步骤 11。
25. 通过使用多通道移液器添加 150 μL 的 PBST 来清洗每口井，并在室温下在摇床上孵育板 5 分钟。
26. 重复步骤 25 共五次。
27. 在每口井中加入 50 μL 的 1:800 二级抗体，用铝箔盖住盘子，在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。
28. 小心去除抗体。
29. 通过使用多通道移液器添加 150 μL 的 PBST 来清洗每口井，并在室温下在摇床上孵育板 5 分钟。
30. 重复步骤 29 共五次。
31. 用 PBS 清洗 5 分钟，同时摇动盘子。
32. 轻弹板以去除 PBS 并在最终扫描前将板吸干。
33. 使用建议的起始 Odyssey 扫描参数扫描板：
分辨率：84 µM
质量：中等
焦点偏移：4.0 毫米
强度：根据需要进行调整，使阳性样品的信号明显，但阴性对照（即空孔或未与一抗孵育的细胞）不明显。
注意：设置参数参见步骤22中的图2。
34. 在软件的“分析设置”选项卡下选择的特定板格式将创建一个网格，可以调整该网格以匹配扫描图像上的孔以进行进一步分析（参见下面的图 3）。
注意：将印版与扫描仪上的刻度标记平行放置，以便将印版模板与扫描图像对齐，这一点很重要。

图 4-6 显示了使用 ICW 协议识别针对特定基因敲除的克隆的示例。在这种情况下，将靶向 KMT5C 的 Cas9 转染到细胞中，并分离和繁殖单个克隆。使用 ICW 协议，然后评估扩展克隆的 KMT5C 产生的下游组蛋白修饰，组蛋白 4 赖氨酸 20 三甲基化 (H4K20me3)。使用 ICW 协议（图 4）鉴定了具有 KMT5C 活性可变性的克隆，并通过西方印迹确认（图 5）。以类似的方式，使用 ICW 协议筛选过度表达强力霉素诱导型 KMT5C 的克隆（图 6）。

图 3.图片描绘 LI-COR 软件上的分析设置选项，包括底部表格中每个识别孔中信号强度的量化。

图 4. 通过 ICW 量化下游效应器 H4K20me3 标记，选择 KMT5C 敲除的单个克隆。
亲代细胞或 KO 克隆（克隆 ae)在 96 孔板（10,000 个细胞/孔）中一式两份接种。电镀后 48 小时，使用 LI-COR 封闭缓冲液封闭细胞，使用透化缓冲液透化，与 1:400 H4K20me3（活性基序）一抗在4 °C的振荡器上孵育过夜，并使用抗小鼠 LI-检测COR二抗。然后，使用 1:500 浓度的 GAPDH（Cell Signaling）一抗在4 °C的振荡器上扫描并重新印迹板过夜，并使用抗兔 LI-COR 二抗进行检测。

图 5. 通过 ICW 鉴定的克隆，通过蛋白质印迹验证。
× 10 5 个细胞/孔接种在 6 孔板中。电镀后 48 小时，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、量化和分离裂解物。转移到 PVDF 膜上后，使用 LI-COR 封闭缓冲液封闭膜，并在 1:500 H4K20me3 抗体或 1:10,000 β-ACTIN（Cell Signaling）一抗中在4 °C的振荡器上孵育过夜，并分别使用抗小鼠或抗兔LI-COR二抗检测。

图 6. 通过 ICW 定量 H4K20me3 选择多西环素后介导的 KMT5C 诱导的单克隆。
亲本细胞或强力霉素诱导型 KMT5C 单克隆（克隆1-4）以10,000 个细胞/孔在 96 孔板中以 4 个重复接种。在铺板时，将强力霉素 (2 µg/mL) 或等效体积的 PBS 添加到每个细胞系的两个孔中。处理后 48 小时，使用 LI-COR 缓冲液封闭细胞，使用透化缓冲液透化，与 1:400 H4K20me3（活性基序）一抗在4 °C的摇床上孵育过夜，并使用抗小鼠 LI-COR 检测二抗。然后，在 1:500 GAPDH (Cell Signaling) 一抗中，在4 °C的摇床上对板进行扫描和重新印迹过夜，并使用抗兔 LI-COR 二抗进行检测。

笔记

1. 在筛选单个克隆期间，可以将细胞接种在单个孔中，无需计数。然而，计算感兴趣的蛋白质与阳性对照的相对信号，后标准化为内源对照的信号是必要的。
2. 在对感兴趣的蛋白质和内源对照进行印迹后扫描过夜干燥的板（在黑暗中）可以产生更均匀和更清晰的信号。
3. 我们建议通过其他蛋白质定量技术（例如蛋白质印迹或免疫荧光）验证通过 ICW 鉴定的候选单克隆。

食谱

1. 1 × PBS
800 克氯化钠
20 克氯化钾
144 克 Na 2 HPO 4 ·2H 2 O
24 克 KH 2 PO 4
8升蒸馏水

2. 透化缓冲液（0.2% Triton X in 1 × PBS）
50 毫升 1 × PBS
100 µL 海卫 X

3. 1 × PBST
1 L 1 × PBS
1 毫升吐温 20

致谢

我们感谢 Chennan Li 对使用 ICW 协议的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院 NCI-R01CA205420 对 AL Kasinski 的支持。 AS Pal 得到了普渡大学生物科学系的普渡研究基金会 (PRF) 研究补助金的支持，这是一项通过普渡大学普渡大学癌症研究中心管理的 SIRG 补助金，一项癌症预防实习计划研究生研究助学金由普渡大学资助普渡大学，以及普渡大学生物科学系授予的 Bisland 论文奖学金。 AM Agredo 得到了普渡大学管理的罗斯奖学金的支持。 R. 图形摘要是使用 BioRender.com 创建的。在《癌症研究》（Pal 等人，2022 年）发表的原始工作中报告了该协议的使用。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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