材料和试剂
1. 1.5 mL微量离心管（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2. 磨砂显微镜载玻片（Bluestar，75 mm × 25 mm，1.35 mm 厚）
3. 显微镜盖玻片（Bluestar，方形 22 毫米，0.13 毫米至 0.16 毫米厚度）
4. 微量离心管支架（VWR，目录号： 211-0207 ）
5. 在透析缓冲液（Roy ）中与 10% 甘油一起储存在 -80 °C 等人， 2021）。纯化的蛋白质必须以等分试样的形式保存在 -20 °C （最多三天，因为这些蛋白质容易沉淀）或 -80 °C （长期使用，≥ 1 周），不要将蛋白质冻融超过两次；这可能会影响蛋白质的稳定性。
6. 酿酒酵母（图 5B）中分离的总 RNA （短期将 RNA 储存在-20°C，长期储存在-80°C）（Garg 等。 , 2020) 。
7. 牛血清白蛋白（BSA；Sigma，目录号：A4503-100G）储存在 4 °C。
8. 氯化钾（ KCl ；Sigma，目录号：P9541-1KG）在室温下储存。
9. N-（2-羟乙基）哌嗪 N-（2-乙烷磺酸）[HEPES 缓冲液； SRL，目录号：16826] 储存在 4 °C。
10. 氯化镁（MgCl 2 ；Sigma，目录号：M0250-1KG）在室温下储存。
11. 氢氧化钾（KOH；Sigma，目录号：V800320-500G）在室温下储存。
12. 酸二乙酯（ DEPC；SRL，目录号：46791）储存在 4 °C。

图 5. 本试验中使用的纯化蛋白和总 RNA。
(A) 纯化的 Edc3-mCherry ，只有-mCherry、Sbp1 和 Sbp1ΔRGG，用于相分离和拆卸实验。 * 代表 Edc3-mCherry 的降解产物。 (B) 0.8% 甲酰胺琼脂糖凝胶电泳描述从酿酒酵母细胞中分离的总 RNA 的质量。条带分别代表 25S rRNA、18S rRNA 和小 RNA 种类。

13. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原的二钠盐水合物（NADH；Sigma ，目录号：N8129-100MG ）储存在-20 °C。
14. 浸油1.516 NA（ Cargille ，目录号： 20130 ）
15. 无绒薄纸（Kimwipes， Kimtech ，目录号：34155）
16. 500 mM KCl （用于试剂制备，参见配方）应储存在 4 °C。
17. 150 mM HEPES-KOH，pH 7.4（用于缓冲液制备，参见配方），应储存在 4 °C。
18. 100 mM MgCl 2 （试剂制备参见配方），应储存在 4 °C。
19. 0.2 mM NADH（有关试剂制备，请参阅配方），等分并储存在 -80 °C。 NADH容易降解；因此，重要的是在无核酸酶水中等分 1mM NADH 并将其储存在 -80 °C 下。
20. 经 DEPC 处理的 H 2 O/无核酸酶 H 2 O（试剂制备参见配方），室温保存。
21. 相分离缓冲液（ PSB ；缓冲液制备，参见配方）必须在冰上制备。所有反应步骤都必须在冰上（或 4 °C ）进行，反应设置完成后，将其转移到相应的温度。
22. 无水乙醇（ EMSURE ® ，Merck，目录号：100983）
23. 70% 乙醇（见配方）
24. DEPC 处理水（见配方）
25. 500 mM 氯化钾 ( KCl )（见配方）
26. 150 mM HEPES-KOH 缓冲液，pH 7.4（见配方）
27. 100 mM 氯化镁 (MgCl 2 )（见配方）
28. 相分离缓冲液 (PSB)（参见配方）

笔记：
1. 将所有缓冲液储存在 4 – 8 °C 。不要将它们存放在室温下。
2. 用乙醇清洗盖玻片和载玻片，并用无绒纸巾擦干。灰尘会阻碍相分离蛋白质的可视化。
3. 除了 DEPC 处理的水或溶液之外，市售的无 RNase 试剂也可用于检测。
4. 70% 乙醇用于清洗或清洁设备。或者，也可以使用RNaseZap等去污剂。

设备

1. 高压灭菌移液器（1–10 µL、2–20 µL、20–200 µL； Finpipette，Thermo Fisher Scientific，目录号：4701070）。在进行检测之前，使用 70% 乙醇清洁移液器。
2. 高压灭菌的 DNase，RNase，无热原微尖端（ Axygen ，目录号： T-300； T-200-Y）
3. 70% 乙醇擦拭剪刀剪鼻尖
4. 30 °C培养箱/加热块（Shalom，目录号：SLM-INC-270）
5. 涡流混合器（ Neuation ，目录号： VM-2110 ）
6. Eppendorf ® Centrifuge 5424R（Eppendorf，目录号：EP5404000537）
7. Deltavision TM Elite 显微镜（GE Healthcare），带 100 ×物镜

软件

1. softWoRx 6.1.3 软件（Applied Precision，LLC）
2. 用于图像处理的斐济 ImageJ 版本 1.53f51（开源， https: //imagej.net/software/fiji/downloads ）
3. Microsoft Excel（美国微软公司）
4. GraphPad Prism 4 用于数据分析（ GraphPad Software Inc.， https: //www.graphpad.com/ ）

程序

A. 准备相分离实验（15-20 分钟）

1. 在进行实验之前，在冰上解冻所有蛋白质和试剂。
2. 将培养箱/干浴保持在 30 °C 。
3. 在进行实验之前，通过将微量离心管嵌入冰中来预冷。
4. 继续前用 70% 乙醇清洁工作台（替代方法：使用RNaseZap等去污剂），因为相分离需要 RNA，RNA 可能会因 RNase 污染或杂质而降解。
5. 为总体积为 120 μL 的反应混合物准备 LLPS 缓冲液，如表 1（10 分钟）所示：
反应一： Edc3-mCherry + PSB
反应 II： Edc3-mCherry + 1 µg RNA + PSB
反应 III： Edc3-mCherry + 0.2 mM NADH + PSB

表 1. 相分离实验的反应。
试剂反应一
（最终浓度）反应一
（最终浓度）反应三
（最终浓度）
500 毫米氯化钾 150 毫米 150 毫米 150 毫米
150 mM HEPES-KOH，pH 7.4 30毫米 30毫米 30毫米
100 毫米氯化镁2 2毫米 2毫米 2毫米
1mM NADH 不适用不适用 0.2 毫米
总 RNA 不适用 1微克不适用
Edc3-mCherry 10微米 10微米 10微米
无核酸酶 H 2 O 将音量调节至 120 µL 将音量调节至 120 µL 将音量调节至 120 µL

B. 相分离反应（图 3）（1 小时 20 分钟）

1. 步骤A5所示制备反应混合物，并将它们放在冰上。
2. 在 30 °C 下孵育反应混合物1 小时，而不会干扰反应管。
3. 取出反应混合物，轻轻涡旋（或敲击）微量离心管以混合相分离的蛋白质。
4. 使用带有切口的 200-µL 尖端（在喷嘴处 3–5 mm 处）将 30 µL × 3 反应分装到 1.5-mL 微量离心管中，并将反应放在冰上。在喷嘴处切割尖端至关重要，因为由于其喷嘴处的吸力或尺寸限制，它可能会影响相分离蛋白质的大小。
5. 为拆卸实验准备并执行步骤 B4中的反应（步骤 C1-C3）。
6. 立即将步骤 B3中的剩余反应进行处理和可视化（步骤 D1-E6）以确认组装。在步骤 D1-E6 中讨论了相分离反应的处理和可视化。

C. 拆卸实验反应（图 4）（1 小时 20 分钟）

1. 步骤 B4的相应反应中添加 10 μM 的纯化 Sbp1 或 Sbp1ΔRGG 或牛血清白蛋白（图 3）。通过轻敲或轻轻涡旋混合反应。
2. 在 30 °C 下孵育反应混合物1 小时，而不会干扰微量离心机支架或反应管。
3. 孵育后将反应保持在冰上以进行孵育后处理（步骤 D1-D3）。

D. 反应的后孵化处理（5 分钟）

1. 以 200 × g旋转反应2 分钟。
2. 使用在其喷嘴处切割的 200 μL 尖端轻轻取出 20 μL 的反应物以丢弃，因为我们不会使用上清液。
3. 步骤 D2的剩余反应放在冰上，以便在显微镜下观察（步骤 E1-E6）。

E. 在显微镜下观察相分离的蛋白质（7 分钟至 15 分钟）

1. 从反应剩余物中取出 5 μL 的反应，并将其放在盖玻片上形成液滴
注意：将盖玻片放在不起毛的薄纸上，以避免从工作台上捕获不需要的颗粒。
2. 将载玻片放在盖玻片上。用拇指从顶部轻轻按压载玻片，将载玻片固定到盖玻片上。确保反应在载玻片和盖玻片之间均匀扩散。
3. 将 2 μL 的 1.516 NA 浸入油移到盖玻片上。
4. 将载玻片安装在显微镜上。
5. 打开mCherry过滤器（激发：587 λ；发射：610 λ）并轻轻使用显微镜的精细聚焦来聚焦组件。此步骤对时间敏感，因为步骤 B6中的程序集在长时间保持在 RT 时可能会变大。成像时间不应超过 7 分钟。练习专注于组件需要一些时间，因为它们在白光下不是很清晰可见。我们建议在进行主要实验之前进行一些模拟实验。我们还建议以交错的方式设置初始反应，以获得足够的时间来可视化每个反应。
6. 组件如图 3 所示。

数据分析

使用 Fiji ImageJ 对相分离组件进行定量（图 6A - C）。
1. 为了有效分析相分离组件，请使用相似的对比度设置以相同的放大倍率捕获所有图像。
2. 打开斐济 ImageJ 软件，可从https://imagej.net/software/fiji/downloads下载。
3. 在斐济，使用菜单打开图像（图 6D）。
4. 选择分析，然后设置比例。默认情况下，斐济应使用元数据设置比例；如果不是，请使用显微镜或软件提供的规格以像素为单位输入距离。输入单位（微米或纳米）。在这种情况下，我们使用了千分尺。检查全局，以便将此测量应用于具有相同放大倍率的所有图像（图 6E）。
5. 单击图像并通过单击工具栏上的图像菜单复制图像，然后从选项中复制。
6. 图像将图像更改为 8 位图像，然后键入 8 位（图 6F）。
7. 在图像菜单下，选择调整，然后选择阈值（图 6G）。
8. 通过滑动条调整阈值，以便仅选择需要分析的组件。然后使用set选项提供下阈值和上阈值。在这里，我们使用了较低的阈值值为 61，上限为 255。在整个分析过程中保持恒定（图 6H - I）。
9. 在分析选项卡下，选择设置测量并检查足以进行数据分析的测量（图 6J）。
10. 然后点击分析并选择分析粒子。检查数据分析所需的显示结果和其他设置。在此处设置最小粒度，以便数据中不包含噪声。然后单击确定（图 6K）。
11. 测量结果将显示在图表中（图 6L）。将这些测量值复制并粘贴到 Excel 中以分析数据，然后使用 GraphPad Prism 创建图表（图 6A - C）。

图 6. 相分离组件的定量。
(A) 图 3 中描述的相分离组件的定量。(B) 图 4A 中描述的拆卸实验的定量。 (C) 图 4B 中描述的拆卸实验的定量。 (D) 斐济软件的菜单栏。 (E) 在斐济设置获取图像的比例。 (F) 在进行分析之前更改图像的位大小。 (G) 调整组件的阈值。（H-I）设置要分析的程序集的阈值。 (J) 设置软件预期的测量类型。 (K) 使用分析粒子选项分析粒子大小。 (L) 将结果窗口中的数据复制并粘贴到 Excel 表中进行分析。图 4A-C 中的数据图表示n = 3 的平均值 ± SEM，其中“n”表示独立实验的数量。双尾配对学生t检验用于计算P值。

笔记

故障排除
使用表 2 中的故障排除解决方案。

表 2. 故障排除表
问题可能的原因解决方案
1 显微镜下的大量蛋白质聚集蛋白质的浓度可能很高。在开始实验之前，尝试不同浓度的蛋白质进行相分离。
蛋白质可能会在 PSB 缓冲液中孵育之前聚集，同时进行纯化。将纯化的蛋白质以 15,000 × g离心10 分钟，收集上清液，量化蛋白质浓度，并将其用于相分离实验。
2 显微镜下未发现相分离蛋白不同的 RNA 结合蛋白需要特定的底物、辅因子等来进行相分离。尽管某些蛋白质单独相分离，但 RNA/DNA、NADH 或 ATP 的存在可能会增加或降低其相分离能力。尝试在不同时间点用不同浓度的蛋白质进行无底物的蛋白质相分离。

如前所述，尝试使用 ATP、GTP 等辅助因子或聚 (A) 或聚 (U) 等 RNA 底物，以帮助蛋白质相分离。

RNA 和 NADH 可能由于反应混合物中的一些污染而降解。尝试在干净且无 RNase 的环境中设置反应。

检查缓冲液的 pH 值和浓度，因为这些变化可能会导致蛋白质的相分离减少或降低。
3 纯化过程中蛋白质的聚集含有低复杂性区域的蛋白质在纯化过程中往往会聚集。使用含 L-精氨酸的裂解缓冲液纯化蛋白质（Roy 等人，2022 年）。
4 载玻片-盖玻片连接处存在气泡整个盖玻片上的反应扩散不充分或载玻片被压在盖玻片上的力道太大。尝试轻轻地将载玻片放在盖玻片上，让反应液先在整个盖玻片上扩散。然后，通过将拇指从一侧滚动到另一侧，轻轻按压载玻片。
5 高噪声信号，同时在显微镜下观察相分离的蛋白质。载玻片或盖玻片中存在灰尘或污垢尝试清洁盖玻片和载玻片，首先将其浸入 100% 乙醇中，然后使用无绒纸巾将其擦干。
使用普通薄纸可能会有问题，因为自由流动的棉绒可能会发出不需要的信号。

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 30 mL 的高压灭菌 H 2 O 添加到 70 mL 的绝对乙醇中，制备 100 mL 的 70% 乙醇。在室温下将其存放在玻璃试剂瓶中。

2. DEPC处理水
在通风橱中将2 mL 的 DEPC（焦碳酸二乙酯）添加到2 L 的MilliQ水中。添加 DEPC 后，将容器存放在黑暗区域过夜，然后高压灭菌。

3. 500 mM 氯化钾 ( KCl )
在 100 mL 的高压灭菌 DEPC 处理过的MilliQ水中加入 3.73 g KCl ，制备 500 mM KCl溶液。用玻璃棒搅拌直到所有盐溶解。制备后储存在 4 °C 。

4. 150 mM HEPES-KOH 缓冲液，pH 7.4
MilliQ水中添加 3.57 克 HEPES 盐，制备 150 mM HEPES 溶液。用玻璃棒搅拌直到所有盐溶解。使用玻璃移液器滴加 1 M 氢氧化钾 (KOH) 溶液，将溶液的 pH 值调节至 7.4。制备后储存在 4 °C 。

5. 100 mM 氯化镁 (MgCl 2 )
通过将 0.95 g MgCl 2盐添加到 100 mL 的高压灭菌 DEPC 处理的MilliQ水中，制备 100 mM MgCl 2溶液。用玻璃棒搅拌直到所有盐溶解。制备后储存在 4 °C 。

6. 相分离缓冲液 (PSB)
根据反应混合物的最终体积制备相分离缓冲液。组分缓冲液的最终浓度如下：
试剂最终浓度体积
500 毫米氯化钾 150 毫米 36 µL
150 mM HEPES-KOH，pH 7.4 30毫米 24 µL
100 毫米氯化镁2 2毫米 2.4 µL
反应体积不适用 120 µL
MilliQ水将体积补足至 120 μL 。

致谢

我们感谢 DBT/ Wellcome Trust India Alliance Fellowship/Grant [IA/I/12/2/500625] 和 DBT India 赠款 [BT/PR40106/BRB/10/1918/2020] 的支持。我们还感谢 DBT-IISc 合作伙伴计划和 DST-FIST 计划对基础设施的支持。 DBT-JRF 用于 RR 的奖学金。该协议以前用于理解 Sbp1 在题为“处理体（P-体）拆卸需要低复杂度 RGG 基序序列”的文章中的拆卸机制。我们感谢Amrendra Kumar 帮助我们解决了 Edc3-mCherry 蛋白的纯化问题。我们感谢Rajyaguru实验室成员的不断投入、支持和鼓励。

利益争夺

作者声明，他们不知道可能会影响本文报道的工作的相互竞争的经济利益或个人关系。

伦理

作者声明在伦理方面没有冲突。

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