材料和试剂

动物
定时怀孕 (13d; TP13) C57BL/6 小鼠(雌性, Daihan - Biolink Co., Chungbuk , Korea )

文化产品
1.微管（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2.15 mL锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
3.100 mm 培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150466）
4.T-25 烧瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：156367）
5.汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：14170-112）
6.75％无水乙醇（ Daejung Chemicals & Metals，目录号：4023-2304）
7.胰蛋白酶 2.5%（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：15090-046）
8.聚-D-赖氨酸（PDL）（Sigma-Aldrich，目录号：P7280-5MG）
9.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：11995-065）
10.青霉素-链霉素（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：15140-122）
11.胎牛血清（FBS）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：16000-044）
12.GlutaMAX TM （ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：35050061）
13.Dulbecco 磷酸盐缓冲盐（DPBS）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：14190-144）
14.台盼蓝染色剂（0.4%）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：15250-061）
15.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650-5X5ML）
16.牛血清白蛋白组分V （BSA）（Merck ，目录号：10735086001 ）
17.CD11b（小胶质细胞）微珠（美天旎） Biotec ，目录号：130-093-634 ）
18.MS 色谱柱（美天旎 Biotec ，目录号：130-042-201)
19.培养基（500 mL）（参见食谱）
20.70% 乙醇（ 100 毫升）（见食谱）
21.0.25% 胰蛋白酶（10毫升）（见食谱）
22.PB 缓冲液 (50 mL)（参见配方）

设备

1.光学显微镜（Olympus，型号： SZ-ST）
2.洁净工作台（LabTech，型号：LCB-1201V）
3.解剖工具
a.蚊子钳（KASCO，目录号：S8-099）
b.显微解剖钳（KASCO，目录号：50-2000-1）
c.微型剪刀（ Medro Instruments，目录号：02-027-10）
d.电子钳（KASCO，目录号：11-412-11）
4.离心机（ LaboGene ，目录号：1248R ）
5.（ Marienfeld Superior，目录号：HSU-0650030）
6.CO 2细胞培养箱（ PHCbi ，目录号：MCO-18AC-PK）
7.37°C水浴（DAIHAN Scientific，目录号：DH.WHB00106）
8.磁性电池分离器（美天旎 Biotec ，目录号：130-042-102)

软件

1.ImageJ（美国国立卫生研究院， https://imagej.net ）
2.棱镜 7（GraphPad， https : //graphpad.com ）
3.生物渲染（生物渲染， https://biorender.com ）

程序

混合的神经上皮-小胶质细胞祖细胞培养物形成融合层，有助于小胶质细胞的存活和产量。解剖和培养的处理步骤如下：
注意：此步骤应在干净的工作台上执行。

A.第 1 步：小鼠小胶质细胞的分离和培养
1.培养箱（5% CO 2，37 °C）中用 5 mL 的 PDL 将 T-25 培养瓶涂上 2 小时。用 5 mL 蒸馏水清洗烧瓶底部 3 次，并在使用前干燥。
2.准备培养实验所需的工具和试剂。用 70% 乙醇喷洒解剖工具和工作区。在 37°C 水浴中加热培养基。
3.从饲养笼中收集TP13 小鼠。对于每只小鼠，使用注射器通过肌内 ( im ) 途径以 0.03 mL 的剂量将戊巴比妥注射到腿部肌肉（生理盐水中 100 mg/kg）。
4.使用微型剪刀，切开腹壁。使用微解剖钳提起子宫角并用剪刀剪掉子宫。将提取的子宫转移到冰冷 ( 4°C) HBSS。
5.在室温 (20–25°C) 下, 在含有 20 mL HBSS 的 100 mm 盘中用微型剪刀切割肌肉子宫组织。然后，用两个电子钳抓住肌肉子宫组织并拉开以取出小鼠胚胎。通过在每个胚胎之间的区域切割子宫来分离胚胎。胚胎可能会自发弹出或用镊子轻轻按压后出来。
6.在室温下将 20 mL 的 HBSS 添加到单独的 100 mm盘中。
7.将 6 – 10 个胚胎转移到盘中（图 1）。
8.用一只手，用镊子拿起一个胚胎。用另一只手，切掉眼睛上方的头部皮肤（图 2，视频 1）。
9.将解剖的组织转移到微管中。加入 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶，用微型剪刀将组织切成几块。用 1 mL 移液器上下移液几次，然后将管置于37°C 的细胞培养箱中 3 分钟。
10.将细胞悬浮液转移到 15 m L锥形管中。在室温下加入 10 mL DPBS ，并在室温下以 300 × g将 15 mL 锥形管离心5 分钟。
11.用 5 mL 的加热培养基吸出上清液并重新悬浮颗粒。
12.使用血细胞计计算细胞密度。
13.将细胞悬浮液以 200,000 个细胞/cm 2的密度接种到涂底 T-25 烧瓶中。添加培养基以在烧瓶中达到 7 mL 的最终体积。将烧瓶放入细胞培养箱中，温度为 37°C，CO 2为 5% 。
14.第二天更换新鲜培养基，然后每 2-3 天更换一次，以去除细胞碎片。
15.接种 14-21 天后，检查 T-25 烧瓶中的细胞密度（图 3）。当细胞达到 90% 汇合时，将它们分成两个烧瓶。
笔记：如果混合细胞达到汇合，但不需要立即使用小胶质细胞，则可以储存混合培养物。混合培养物也可以在由含有 20% FBS 和 10% DMSO 的液氮（约 -196 °C）的 DMEM 组成的冷冻培养基中长时间冷冻。
解冻混合细胞时，将储备小瓶在 37°C 的水浴中溶解 3 分钟，然后用培养基稀释。

B.第 2 步：从 NEL 培养物中纯化小鼠小胶质细胞
1.要收集小胶质细胞，加入 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶并孵育 3 分钟。
2.点击 T-25 烧瓶并在 15 mL 锥形管中收集条件培养基中的浮动细胞。
3.× g的速度将管离心5 分钟。完全吸出上清液。
4.7个总细胞的90 μL冷 PB 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
5.添加 10 μL的 CD11b（小胶质细胞）微珠。
6.充分混合并在 4°C 下在黑暗中孵育 15 分钟。
7.10 7 个细胞加入 1 mL 的冷 PB 缓冲液清洗细胞，并以 300 × g离心5 分钟。完全吸出上清液。
8.在 1，500 μL的 PB 缓冲液中重新悬浮多达 10 7 个细胞。
9.在合适的磁激活细胞分选分离器 (MACS) 的磁场中放置一列。通过用 500 μL的 PB 缓冲液冲洗柱子来准备柱子。
10.将细胞悬液涂在柱子上。收集含有未标记细胞的流通液，并通过添加缓冲液 3 次执行传递步骤，每次在柱水库为空后（MS 柱：500 µL × 3)。
11.将 1 mL 的 PB 缓冲液移到柱上。通过将柱塞牢固地推入柱中，立即冲洗掉磁性标记的细胞。这是目标细胞（小胶质细胞）部分（图 4）。
注意：为了提高小胶质细胞的纯度，建议在第二个 MS 柱上富集阳性部分。使用新色谱柱重复步骤 B9 至 B11 中所述的磁分离过程。

图 1. 用于神经上皮层 (NEL) 培养的小鼠胚胎处理。
首先，通过切割每个胚胎之间区域的子宫组织来分离小鼠胚胎。其次，将胚胎转移到一个装有冷 HBBS 的新盘子中——每 6-10个胚胎使用一盘新鲜的 HBBS 。第三，使用微解剖钳解剖胚胎的头部皮肤。

图 2. NEL 培养的小鼠胚胎解剖。
在显微镜下使用显微外科器械解剖小鼠胚胎的 NEL。

图 3. NEL 培养中的可扩展小胶质细胞。
箭头指向 NEL 支持的小胶质细胞祖细胞。比例尺 = 100 μm 。

图 4. 从培养的 NEL 中分离和纯化小胶质细胞 21 天。
用小胶质细胞标记 IBA-1、CX3CR1 和 TMEM119 对细胞进行染色。明场显微镜图像显示细胞形态。比例尺 = 100 μm 。

视频 1. NEL 解剖和培养的步骤。

食谱

1.培养基（500 毫升）
试剂最终浓度数量
记忆体不适用450 米长
胎牛血清10%50 米长
笔/链球菌
谷氨酸1%
0.5 ×5毫升
500 µL
全部的不适用505.5 米长

2.70% 乙醇
试剂最终浓度数量
乙醇（绝对）70%70 米长
H 2 O不适用30 米长
全部的不适用100 米长

3.戊巴比妥溶液，1 安瓿 (2 mL)
试剂最终浓度数量
100毫克戊巴比妥3毫克2 米长
盐水不适用8 米长
全部的不适用10 米长

4.0.25%胰蛋白酶
试剂最终浓度数量
2.5%胰蛋白酶0.25%1毫升
DPBS不适用9 米长
全部的不适用10 米长

5.PB缓冲液
试剂最终浓度数量
牛血清白蛋白0.5%0.25 克
DPBS不适用50 米长
全部的不适用50 米长

致谢

这项研究得到了韩国政府 (MIST) (2021M3E5D9025027) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 赠款的支持。参考我们之前的论文（You et al ., 2021）对协议进行了修改和编写。我们感谢Dahye Kim 提供了很好的插图。

利益争夺

不存在利益冲突。

伦理

所有实验程序均经 CHA 大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) (IACUC200116) 批准。

参考

1.You，MJ，Rim，C.，Kang，YJ 和 Kwon，MS（2021 年）。一种在小鼠中获得可储存和可扩展的成人样小胶质细胞的新方法。神经炎症杂志18（1）：294。