材料和试剂

1.带有20-mm微孔的4室35-mm玻璃底培养皿，#1.5盖玻片（ Cellvis ，目录号：D35C4-20-1.5-N）
2.hTERT 永生化视网膜色素上皮（RPE-1）细胞（来自 Irina Kaverina的礼物，范德比尔特大学，田纳西州纳什维尔，目录号：CRL-4000， RRID：CVCL_4388 ）
3.RPE-1 细胞组成型表达 mScarlet-i-H2A 和 miRFP670-CETN2，并在强力霉素诱导型启动子的控制下稳定整合 GFP-PCNT (854-1960) 构建体(Jiang et al. , 2021)
4.强力霉素（ MilliporeSigma ，目录号：D9891 ）
5.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/Hams F-12 50/50 混合物（DMEM/F-12）（Corning，目录号：10-092-CV）
6.青霉素-链霉素溶液，100 × （Corning，目录号：30-002-CI）
7.四环素阴性胎牛血清（ tet-阴性FBS）（Gemini Bio，目录号：100-800）

设备

1.转盘共聚焦显微镜系统（Dragonfly， Andor Technology，Belfast，UK）
旋转圆盘共聚焦模块是 Dragonfly 503 多模态成像系统 ( Andor )，具有双色 TIRF、两个摄像头端口以及 25 µm 和 40 µm 针孔。它有四条激光发射线（405 nm/100 mW 、488 nm/50 mW 、561 nm/50 mW和 643 nm/100 mW ）。该系统的基础是 Leica DMi8 倒置显微镜（Leica， Wetzlar ，Germany），物镜范围从 10 ×到 100 × [10 × /0.40（放大/数值孔径）空气 HCX PL APO，25 × /0.95 水HC PL FLUOTAR、40 × /1.10 水 HC PL APO、63 × /1.40 油 HC PL APO、100 × /1.40 油 HC PL APO 和 100 × /1.47 油 HC PL APO CORR TIRF]。本协议中显示的图像均由 63 × /1.40 油 HC PL APO 物镜获得。本研究中使用的激光线为 488 nm、561 nm 和 643 nm，相应的带通发射滤光片分别为 525 – 550 nm、600 – 650 nm 和 725 – 740 nm。
2.iXon Ultra 888 EMCCD 摄像头（安道尔科技）
3.环境培养箱（ Okolab ，意大利波佐利）

软件

1.Anaconda（ Anaconda，Inc.，纽约，NY）
2.斐济 (ImageJ) ( Johannes Schindelin , Albert Cardona, Pavel Tomancak , RRID: SCR_002285 )
3.Jupyter笔记本（ Jupyter项目， RRID:SCR_018315）
4.Python 编程语言（ Python 软件基金会，RRID：SCR_008394）

程序

A.细胞培养和蛋白质表达的诱导
1.大约 6 × 10 4 –9 × 10 4 个细胞播种到35 毫米玻璃底皿的每个腔室中。让细胞附着在盘子上。在 37 °C提供 5% CO 2的加湿培养箱中使用适当的培养基维持细胞。
注意：我们的研究中使用了Tet-ON-GFP-PCNT (854 – 1960) 细胞，一种 RPE-1 衍生细胞系，通过强力霉素诱导表达 GFP 标记的 PCNT（残基 854 – 1960）（ Jiang et al., 2021 年）。 Tet-ON-GFP-PCNT (854 – 1960) 细胞也稳定且组成性地表达 mScarlet-i-H2A 和 miRFP670-CETN2，它们分别标记细胞核和中心体。将细胞维持在补充有 10% tet阴性 FBS 和 1 ×青霉素-链霉素溶液的 DMEM/F12 培养基中。
2.在成像之前，让细胞达到 40 – 60% 的汇合度（大多数培养的人类细胞在播种后 12 – 18 小时）。
注意：为获得最佳对象跟踪结果，请以低密度播种细胞并将它们均匀分布在盖玻片上，以尽量减少细胞重叠。
3.可选：对于强力霉素诱导细胞系，用 1 μg/mL d oxycycline hyclate ( Dox) 孵育细胞，以在延时显微镜开始前诱导转基因表达（例如，在我们的案例中为3-4 小时）。

B.延时图像采集
注意：使用多个荧光团进行活细胞成像时，选择适当的波长范围、发射滤光片和二向色镜以最大限度地减少光谱渗出伪影非常重要。还应根据经验确定适当的激光功率、曝光时间和采集间隔，以最大限度地提高信噪比，同时最大限度地减少光漂白，尤其是在长时间的延时成像中。我们还建议将感兴趣的细胞集中在视野中，以防止它们在成像过程中移出视野。以下是我们在系统中使用的延时图像采集设置（ Andor Dragonfly旋转磁盘共焦系统）。使用我们当前的算法，TRACES 可以同时跟踪多达三种荧光标记的对象类型，如果其中一个对象可以用于定义细胞随时间的位置（例如，荧光标记的细胞核，例如图中的 mScarlet-i-H2A 1；标记细胞膜或其他细胞器的其他标记也可以使用）。我们使用在 PCNT 冷凝物的形成和运动过程中捕获的一系列图像作为示例来演示该协议中的 TRACES 工作流程（图 1）。

图 1.活细胞图像采集示例。
Tet-ON-GFP-PCNT (854 – 1960 )细胞的时间推移显微照片。在 Dox 诱导后 4 小时左右开始成像。第一个冷凝物形成的时间标记为时间 0。请注意， GFP-PCNT (854 – 1960) 形成相分离的凝聚物，这些凝聚物聚结并移向中心体（用洋红色箭头表示并在插图中放大）。比例尺： 2 0 µm 和2 µm （插图）。

1.（对于大多数培养的哺乳动物细胞）的环绕式环境培养箱内提供5% CO 2的加湿室中。
注意：让显微镜系统在成像前达到所需的温度平衡。
2.相机： iXon Ultra 888 EMCCD
注意：为了最大限度地减少长期实时成像的光毒性，我们建议根据经验确定最低激光功率和曝光时间，以便为感兴趣的对象生成至少 2-3 信噪比的图像。使用高灵敏度相机，例如配备电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD) 的相机也是可取的。
3.物镜：63×/1.40（放大倍率/数值孔径）加上一个 1× 电动放大倍率变换器
4.激光功率： 50–100 mW激光的 1–10%
5.曝光时间： 100 – 200毫秒
6.增益：200
7.针孔尺寸：40 µm
8.Z 堆叠间隔：0.6 µm
9.为了评估共定位或分析荧光标记结构之间的相对空间分布，获取每个 z 堆栈的所有通道，从最长到最短波长。
注意：我们还建议设置足够宽的 z 范围，以解决细胞在长期成像过程中可能偏离焦点的可能性。
10.采集时间间隔：2 – 4 分钟
注意：用户需要根据其特定的成像系统、实验设计和感兴趣的结构来优化成像参数。

数据分析

A.使用斐济进行对象分割和识别
注意：有关斐济安装的说明，请参阅注释部分 A。
1.图像导入和 Z 投影
a.通过选择“文件”>“打开...”在斐济加载延时图像。
注意：我们的图像文件是 16 位的 OME TIFF 格式，可以使用默认集成在斐济的 Bio-Formats 包(Linkert et al., 2010)读取。对于其他图像格式，可能需要将文件转换为 TIFF 格式或直接激活 Bio-Formats Importer 插件以读取数据。
b.对于“生物格式导入选项”，选择“ Hyperstack ”进行堆栈查看，并选择“使用虚拟堆栈”（图 2A）。
注意： Hyperstack视图将图像显示为多维堆栈（时间、通道、Z 切片滑块）。
c.要打开通道单独显示的图像，请选择“默认”作为颜色模式，然后选择“拆分通道”（图 2A）。
d.要执行 Z 投影，请选择“图像”>“堆栈”>“Z 项目 ...”。通过指示将包含在投影中的开始和停止切片来确定堆栈范围。选择适当的投影类型并选择“所有时间框架”（图 2B）。
注意：我们的图像分析中使用最大强度 Z 投影从每个切片的最大强度中选择像素，以构建 2D 延时图像系列。用户可以选择其他更能代表原始数据的投影类型。
e.通过转到 "文件" > "另存为" > "Tiff ..." (图 2C), 将投影图像保存为 TIFF 格式。确保所有投影图像具有相同的图像类型（例如，16 位、32 位）。
f.重复步骤 A1d 和 1e 以处理其他频谱通道（如果有）。

图 2. 图像导入和 Z 投影。
(A) 使用生物格式读取图像文件。 (B) 设置 Z 投影参数。 (C) 将投影图像保存为 TIFF 格式。

2.通过基于强度的阈值分割图像
a.打开斐济给定通道的投影图像（图 3A）。通过“图像”>“调整”>“亮度/对比度...”调整显示范围的下限和上限，以便清晰显示感兴趣的对象，而不是背景信号（图 3B）。
在图 1 所示的 +24 分钟时间范围内对 GFP-PCNT (854 – 1960) 冷凝物的信号进行显示调整前后的示例。图 5 也显示了相同的示例。这调整步骤仅更改显示值，而不更改原始像素强度值（ Ferreira 和 Rasband，2012 ）。
b.要对图像分割应用阈值，首先通过“图像”>“类型”>“8位”将图像类型转换为8位。然后，选择“图像”>“调整”>“阈值...”。调整最小和最大阈值，以便只分割感兴趣的对象，而不是背景信号。选择“红色”覆盖，然后选择“应用”（图 3C）。例如，此处使用 80/255（最小/最大）的阈值来分割 GFP-PCNT (854 – 1960) 冷凝物。
c.从上一步中选择“应用”后，将出现“将堆栈转换为二进制”窗口（图 3C）。在此窗口中，选择“默认”方法和“列出阈值”。然后，选择“确定”（图 3D）。
注意：执行步骤 A2b 和 A2c 会生成一个二进制堆栈图像，该图像显示分割对象（或前景）和背景（例如，图 5，第三列）的像素。虽然我们使用基于IsoData算法的默认阈值方法，但用户可以选择斐济提供的其他方法（例如Intermodes 、 MaxEntropy ），以最好地分割他们感兴趣的对象。如果用户想要在给定延时图像系列的所有时间范围内应用相同的定义阈值，请确保取消选择“计算每个图像的阈值”。
d.将生成的带有分段对象的二进制堆栈图像保存为 TIFF 文件（即，使用图 2C 中所示的相同步骤）。
e.如果已在不同的光谱通道中获取了多个对象，请重复上述步骤以分割其他对象。

图 3. 基于强度阈值的图像分割示例。
以图 1 中 +24 分钟时间范围的 GFP 通道为例，此处显示了分段 GFP-PCNT (854 – 1960) 凝聚物的分步过程，包括打开共焦 z 投影图像 (A ），调整显示范围（B），并应用基于强度的阈值步骤（C，D）。比例尺：20 µm 和 2 µm（插图）。

3.物体识别和测量
注意：此步骤为每个通道中的每个识别对象分配一个唯一的 ID 号并提取测量数据，这些数据将用于对象跟踪。
a.在斐济打开每个分段堆栈图像。
b.通过“分析”>“设置比例...”定义图像比例。然后选择“确定”（图 4A）。

图 4. 物体识别和测量。
(A) 定义图像比例。 (B ) 定义图像坐标。 (C) 指定对象测量和统计参数。 (D) 执行“分析粒子”功能。

c.> “调整” > “坐标...”定义图像坐标。然后选择“确定”（图 4B）。
注意：在物体测量之前设置正确的图像比例和坐标很重要。
d.转到“分析”>“设置测量”以指定要提取的测量和统计数据（图 4C）。
注意：我们选择提取面积和质心进行分析。用户可以选择最适合其量化目的的其他测量。要在此管道中使用 Python 跟踪程序，请确保包含质心测量，因为 TRACES 使用 ( x,y ) 对象坐标进行跟踪。
e.> “分析粒子...”激活“分析粒子”功能。设置适当的大小阈值以掩盖感兴趣的对象并提取测量值。选中“显示结果”、“汇总”和“添加到管理器”，然后选择“确定” （图 4D）。
注意：此步骤中的大小阈值有助于进一步过滤掉从先前基于强度的阈值步骤中被错误分类为分割对象的背景信号（图 3）。圆形阈值——范围从 0.00（细长多边形）到 1.00（完美圆形）（Ferreira 和 Rasband，2012 年） ——也可以应用于分割感兴趣的对象。我们将圆形度阈值设置为0.00–1.00 （图 4D），这意味着我们不设置圆形度阈值并接受所有对象，无论其圆形度如何。选择“显示结果”和“汇总”选项，以便显示测量数据并保存用于对象跟踪。选择“添加到管理器”选项，以便在所有时间范围内将唯一的 ID 号自动分配给每个识别和测量的对象（例如，图 5，第四列）。由于 ID 号是唯一的，因此同一对象将在不同时间范围内由不同的 ID 号表示。
f.选择“是”以处理延时图像系列的所有时间范围。
g.用唯一 ID 号标记的对象保存生成的分段图像（例如，图 5，第四列）。

图 5.三种荧光标记对象类型的显示调整、图像分割和对象识别示例。
以图 1 所示的 +24 分钟时间范围为例，z 投影共焦图像具有原始显示设置（第一列）、调整后的显示设置（第二列）、通过阈值分割的图像分割（第三列）和对象识别通过执行“分析粒子”功能（第四列）显示。请注意，对于每个对象类型，一个唯一的 ID 号（例如，插图，第四列）在延时图像系列的所有时间帧中自动分配给每个识别的对象。比例尺： 2 0 µm 和2 µm （插图）。

h.将对象测量结果 (图 6A) 和帧计数 (图 6B) 数据保存为每个对象类型的 .csv 格式。
注意：斐济将延时图像系列的每个“时间框架”称为“切片”（图 6B）。为了避免混淆时间序列中的“时间框架”和 z 堆栈中的“切片”，“切片”和“切片计数”（最初由斐济定义，如图 6B 所示）随后被重新定义为“帧”和“帧号”，分别在管道中。
i.如果在不同的光谱通道中获取了多个对象，则对其他对象重复上述步骤。图 5 展示了从延时图像系列的单个时间帧（即图 1 中所示的 +24 分钟时间帧）中对三种荧光标记对象类型进行显示调整、图像分割和对象识别的完整过程。

图 6. 斐济导出数据集示例及其使用基于 Python 的集成 df_converter函数。
(A) 从斐济出口的 PCNT 冷凝物的测量结果示例（来自图 1 所示的相同延时系列）。 XM 和 YM，对象的x和y坐标，基于质心。 (B)从斐济导出的 PCNT 冷凝物对象的切片/帧计数数据示例。 “切片”表示延时图像系列中的每个时间帧。 “计数”表示在相应“切片”/时间范围内识别出的凝析物的数量。 (C) df_converter函数执行后 PCNT 冷凝对象的数据帧输出示例。这里，“帧”表示每个对象（具有唯一对象ID）所在的帧号。

B.使用基于 Python 的程序进行对象跟踪
注意：TRACES 对象跟踪程序是用 Python 编写的，并在Jupyter Notebook 中实现。有关 Anaconda 发行版的安装说明，请参阅注释 B 部分，其中包括安装 Python、 Jupyter Notebook 和运行 TRACES 的包。 TRACES 对象跟踪工作流程包括 6 个步骤（第I 至 VI 部分），如下所述（图 7A）。

图 7. TRACES 管道中的对象跟踪、量化和数据可视化。
(A) 对象跟踪的工作流程。 (B) 量化和数据可视化。显示了每个部分中的 TRACES 脚本行的突出显示。有关完整脚本，请参见TRACES.ipynb 。显示了凝聚物数量、到中心体的平均凝聚物距离和单个细胞中的平均凝聚物面积的示例图。有关最终图的示例，请参见Jiang et al., 2021 中的图 4。

1.导入包并定义工作目录（图 7A，第一节）
a.在Jupyter Notebook中打开“ TRACES.ipynb ”。
Jupyter Notebook 应用程序的说明，请参阅注释部分 C。
b.导入包并定义工作目录。
2.加载文件（图 7A，第二节）
a.为每个对象类型加载具有测量结果（例如，图 6A）和帧计数（例如，图 6B）的数据文件。
注意：例如，中心体对象的测量结果文件名为“centrosome_results.csv”。因此，我们将文件加载为“ pd.read_csv ('centrosome_results.csv')”（图 7A，II，第 1 行）。测量结果和框架的数据文件为三种对象类型（中心体、凝聚体和核）加载计数，它们的数据帧变量在脚本中分别命名为“ cen ”、“con”和“h2a”。（图 7A，II）。由于变量名是任意的，用户可以自由选择自己的变量名。
3.使用df_converter函数合并数据集
注意： df_converter函数结合了对象测量结果（例如，图 6A）和框架计数（例如，图 6B）从斐济到具有指定变量顺序的数据帧为每个对象类型（例如，图 6C）；此信息将用于对象跟踪。
注意：应用函数涉及两个一般步骤：（a）定义函数和（b）指定参数并执行函数，然后是（c）数据输出（即生成数据帧），如下例所示。
a.在 TRACES 脚本的第 III 节中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ df_converter (df1, df2)”函数。
b.在第二个单元格中，为每个对象类型指定参数并执行函数。 “df1”和“df2”分别是脚本第二部分中指定的测量结果和帧数的数据帧变量。
注意：例如“ cen_r ”和“ cen_sc ”是测量结果和帧的数据帧变量分别在第 II 节中定义的中心体对象的计数。因此，我们将函数参数指定为中心体对象类型的“ df_converter ( cen_r , cen_sc )”（图 7A，III，第 2 行）。
c.执行上一步（步骤 B3b）中的函数后，将生成每个对象类型的数据框，其中包含以下变量（从左到右）：“ Object_ID ”（对象 ID 号）、“XM”（对象x坐标） )、“YM”（对象y坐标）、“帧”（每个对象所在的帧号）和其他自定义测量值（例如，“面积”）（图 6C）。
注意：确保为每个数据框创建一个唯一的变量名。例如，对象数据框变量分别命名为“ centrosome_df ” 、“ condensate_df ”和“h2a_df”，分别用于中心体、凝聚体和核对象类型。由于变量名是任意的，用户可以自由选择自己的变量名。
4.使用object_grouping函数对单元格内的对象进行分组
注意：细胞核的位置作为细胞位置的代理。为了以单细胞分辨率随时间跟踪亚细胞对象，我们首先通过使用object_grouping函数将每个对象分配到其最近的细胞核，将每个对象分组到其自己的细胞中。该函数首先测量每个时间框架内每个物体到所有原子核的距离然后在时间范围内将每个对象分配给它最近的核基于最小欧几里得距离。
注意：如果用户感兴趣的细胞系不包含细胞核标记，可以使用 Hoechst 或其他荧光染料标记细胞核。或者，其他一般反映细胞位置的细胞质标记也可以用作分组的参考点。
a.在 TRACES 脚本的第 IV 部分中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ object_grouping ( channel_df , h2a_df)”函数。
b.在第二个单元格中，为每个对象类型指定参数并执行函数。 “通道_df ”和“h2a_df”分别是分组和核心对象的数据帧变量，在脚本的第三部分中指定。
注意：例如，“ condensate_df ”和“h2a_df”是数据框变量对于第三节中定义的凝聚体和原子核物体。要将单元格内的冷凝对象分组，请将函数参数指定为“ object_grouping ( condensate_df , h2a_df)”（图 7A，IV，第 2 行）。执行后，凝聚体和中心体对象类型都在细胞内进行分组；结果数据框分组后的变量分别命名为“con_h2a_group”和“cen_h2a_group” 。
5.dist_between_channels函数整合不同对象的时空信息
注意： dist_between_channels函数跨时间框架整合每个细胞内指定对象类型（例如，冷凝物和中心体）之间的测量值（例如，距离、面积）。先前的对象分组步骤仅产生指定的两个对象的成对关系（例如，凝聚体到细胞核，或中心体到细胞核）。这一步是将这两个单独的成对数据集整合到一个数据集中。因此，可以获得三对象关系（例如，凝聚体、细胞核和中心体对象之间的关系）。
a.在 TRACES 脚本的第 V 部分中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ dist_between_channels (channel1_h2a_df, channel2_h2a_df)”函数。
b.在第二个单元格中，指定参数并执行函数。 “channel1_h2a_df”和“channel2_h2a_df”是脚本第四部分中指定的对象分组的数据帧变量。
注意：例如，“con_h2a_group”和“cen_h2a_group”分别是第四节中指定的冷凝物和中心体对象分组的数据框变量。为了整合每个细胞内冷凝物和中心体对象之间的不同测量值，我们将函数参数指定为“ dist_between_channels (con_h2a_group, cen_h2a_group)”（图 7A，V，第 2 行）。执行后，会生成一个集成对象数据框变量“ con_cen_df ”（图 7A，V，第 2 行），其中定义了凝聚物、中心体和细胞核之间的关系。我们将在下一步中使用此数据框进行对象跟踪。
6.object_tracker函数跟踪目标单元格中的对象
注意： object_tracker函数同时跟踪用户指定的细胞的所有三种对象类型（例如，中心体、凝聚体和细胞核）。要使用此功能，用户需要指定跟踪的目标单元格。我们使用核对象 ID 来定义目标细胞。用户可以通过查看二进制分割图像来找到核对象 ID 信息，其中对象由斐济的对象识别和测量步骤生成的唯一 ID 号标记（例如，图 5，第四列）。
注意：当前的 TRACES 跟踪算法仅跟踪非分裂细胞中的对象，因为程序假定每个细胞有一个核对象。我们希望在未来实现用于分裂细胞的目标跟踪功能。
a.在 TRACES 脚本的第 VI 部分，在第一个单元格中运行脚本以定义“ object_tracker ( start_index , end_frame , dataframe )”函数。
b.在第二个单元格中，指定参数并执行函数。 “ start_index ”参数是目标细胞在起始帧的核对象ID。 “ end_frame ”是跟踪的结束帧号。 “ dataframe ”是脚本第五节中指定的集成对象的数据帧变量。
注意：例如，我们要从帧中跟踪目标单元格中的对象编号 5 到 54。目标细胞的核对象 ID 在帧处为“21” 数字 5，“ con_cen_df ”是综合第五节中指定的对象数据帧变量。因此，我们将函数参数指定为“ object_tracker (21, 54, con_cen_df )”（图 7A，VI，第 2 行）。
c.执行后，会生成一个名为“ track_result ”的数据帧，并以名为“track_result.csv”的 .csv 文件自动导出到工作目录（图 7A，VI，第 5 行）。此 csv 文件包含以下列（从左到右）：“ frame_num ”（帧编号）、“orig_c1_index”（冷凝对象 ID）、“orig_c2_index”（中心体对象 ID）、“orig_h2a_index”（核对象 ID）、“ H2A_X”、“H2A_Y”（核物体的x和y坐标）、“c1_XM”、“c1_YM”（凝析物体的x和y坐标）、“c2_XM”、“c2_YM”（中心体物体的x和y坐标）、和“distance_c1_to_c2”（冷凝物到中心体物体之间的距离）。我们将在接下来的步骤中使用这个数据框进行量化。
注意：如果用户想要跟踪延时图像系列中的多个单元格，请指定一个新的目标单元格并重复上述步骤。

C.使用基于 Python 的程序进行量化和数据可视化
1.count_by_frame函数量化对象数量
注意： count_by_frame 函数计算每个时间范围内的对象数在目标单元格中并生成数据可视化图（图 7B，VII）。用户需要指定感兴趣的对象类型进行量化。
a.在 TRACES 脚本的第 VII 节中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ count_by_frame ( track_table , track_table_object_colname ) 函数。
b.在第二个单元格中，指定参数并执行函数。 “ track_table ”参数是第六节中指定的跟踪结果的数据帧变量。 “ track_table_object_colname ”是跟踪结果数据框中感兴趣的对象 ID列。
注意：例如，跟踪结果的数据框变量是“ track_result ”。凝析对象的对象ID列名是“orig_c1_index”。为了量化冷凝物体的数量，我们将函数参数指定为“ count_by_frame ( track_result , 'orig_c1_index')”（图 7B，VII，第 2 行）。
c.执行后，量化数据和绘图（图 7B，VII）会自动以 .csv 和 .csv 格式导出到工作目录。 png文件，分别。
注意：该图显示冷凝对象编号作为目标单元格中帧编号的函数（图 7B，VII）。用户还可以通过指定帧之间的时间间隔将 x 轴从帧数转换为时间。有关最终图的示例，请参见 Jiang et al., 2021 中的图 4B。
2.distance_plot函数量化物体距离
注意： distance_plot函数计算每个时间范围内两种对象类型之间的平均距离（例如，冷凝物到中心体的距离）在目标单元格中并生成数据可视化图（图 7B，VIII）。
a.在 TRACES 脚本的第 VIII 节中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ distance_plot ( track_table )”函数。
b.在第二个单元格中，指定参数并执行函数。 “ track_table ”参数在步骤C1b中定义如上。
注意：例如，跟踪结果的数据框变量是“ track_result ”。为了量化每个时间帧的平均冷凝物到中心体的距离，我们将函数参数指定为“ distance_plot ( track_result )”（图 7B，VIII，第 2 行）。
c.执行后，量化数据和绘图（图 7B，VIII）将自动导出到工作目录，为 .csv 和 . png文件，分别。
注意：该图显示了作为目标细胞中帧数的函数的平均冷凝物到中心体的距离（图 7B，VIII）。用户还可以将 x 轴转换为时间，并结合多个单元格的量化结果。有关最终图的示例，请参见 Jiang 等人 2021 年的图 4C。
3.measure_plot函数测量用户指定的对象属性
注意：用户可以在斐济的物体识别和测量步骤中选择测量物体的其他属性（例如，面积）。用户可以应用measure_plot函数来测量用户指定的属性。图 7B，IX 显示了测量冷凝物体面积的示例。
a.在 TRACES 脚本的第 IX 节中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ measurement_plot ( track_table , track_table_object_colname , object_df , m_type )”函数。
b.在第二个单元格中，指定参数并执行函数。 “ track_table ”和“ track_table_object_colname ”参数在步骤C1b中定义如上。 “ object_df ”是脚本第三部分中指定的感兴趣对象的数据框变量。 “ m_type ”是“ object_df ”数据框中感兴趣的测量类型的列名（图 6C）。
注意：例如，跟踪结果的数据框变量是“ track_result ”。凝析对象的对象ID列名是“orig_c1_index”。冷凝对象数据框是“ condensate_df ”，如脚本第 III 节中所述。 “面积”是“ condensate_df ”数据帧中面积测量的列名（图 6C）。为了量化每个时间帧的平均冷凝水面积，我们将函数参数指定为“ measurement_plot ( track_result , ' orig_c1_index' , condensate_df , 'Area')” （图 7B，IX，第 2 行）。
c.执行后，量化数据和绘图（图 7B，IX）会自动导出到工作目录，为 .csv 和 . png文件，分别。
注意：该图显示了作为目标单元格中帧数的函数的平均冷凝面积（图 7B，IX）。用户还可以将 x 轴转换为时间，并结合多个单元格的量化结果。有关最终图的示例，请参见 Jiang 等人 2021 年的图 4A。

笔记

A.安装斐济
1.按照https://imagej.net/software/fiji/downloads中的说明安装斐济。

B.蟒蛇的安装
1.Anaconda 是 Python/R 编程语言和数据科学包的分发平台。下载的 Anaconda 还包括Jupyter Notebook，这是一个方便的基于 Web 的应用程序，用于生成和编辑 Python/R 语言脚本。
2.按照https://docs.anaconda.com/anaconda/install/中的说明安装 Anaconda。

C.启动Jupyter Notebook
注意：有关详细说明，请点击此链接打开Jupyter Notebook 应用程序。
1.下载“ TRACES.ipynb ”并将其保存在本地文件夹中。
2.要启动Jupyter Notebook，首先打开计算机终端。
3.对于 Mac 用户，在终端中输入“ jupyter notebook”，然后按“Enter”按钮。
4.Jupyter Notebook仪表板将出现在新的浏览器窗口中。
5.选择“ TRACES.ipynb ”在Jupyter Notebook 中打开。

D.Jupyter Notebook上的行号
Jupyter Notebook上没有显示行号，请转到“查看”>“切换行号”。

E.使用manual_correct函数手动更正目标单元格中的错误分组对象
注意：作为分析后的质量控制，用户应通过手动评估原始延时图像中对象的行为与分割对象的行为和导出的量化结果来确认跟踪过程的准确性。有时，某些背景信号可能会在图像处理步骤中被错误地分割为对象，然后将其错误地分组到目标单元中。为了解决这个问题，我们开发了manual_correct功能，供用户从目标单元格中删除错误分组的对象。此步骤是可选的，仅应用于在量化和数据可视化工作流程之前删除错误分组的对象。
1.在 TRACES 脚本的“可选步骤”部分中，在第一个单元格中运行脚本以定义“ manual_correct ( track_table , track_table_object_colname , index_list )”函数。
2.在第二个单元格中，指定参数并执行函数（图 8）。 “ track_table ”参数是第六节中指定的跟踪结果的数据帧变量。 “ track_table_object_colname ”是跟踪结果数据框中感兴趣的对象 ID列。 “ index_list ”是要从目标单元格中删除的错误分组对象的ID 号列表。
注意：例如，如果我们要删除 ID 号为 366 和 375 的两个错误分组的冷凝对象，首先将“ index_list ”指定为“ rm_index_ls = [366,375]”（图 8，第 2 行）。跟踪结果的数据帧变量是“ track_result ”。数据框中的凝聚对象ID的列名是“ orig_c1_index ”。因此，我们将函数参数指定为“ manual_correct ( track_result , 'orig_c1_index', rm_index_ls )”（图 8，第 3 行）。数据框校正后的跟踪结果自动以 .csv 文件的形式导出到工作目录（图 8，第 6 行）。

图 8.使用manual_correct函数删除错误分组的对象。
TRACES 脚本行的一个亮点。有关完整脚本，请参见TRACES.ipynb 。

致谢

我们感谢 Sean R. Collins 博士和 Mark Winey 博士就优化 TRACES 管道提出的建议，以及Jao实验室的所有成员的讨论。该协议改编自之前的工作（ Jiang et al. , 2021 ）。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (1R01GM144435-01 to L.-EJ) 和加州大学戴维斯分校博士前奖学金 (Emmy Werner 和 Stanley Jacobsen 奖学金以及 Floyd 和 Mary Schwall论文年奖学金到 XJ) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争或经济利益。

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