材料和试剂

1. 0.2 µm 注射器过滤器，Filtropur S，PES（Sarstedt，目录号：83.1826.001）
2. Eppendorf Safe-Lock 微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：EP0030123611）
3. 1.5 mL微量离心管（Eppendorf Safe-Lock，目录号：EP0030123611）
4. 微量测试板，96 孔，透明（Sarstedt，目录号： 82.1581.001）
5. Nalgene TM PPCO 离心瓶（Thermo Scientific，目录号：3141-0250PK）
6. 玻璃实验室瓶（VWR，目录号：215-1514、215-1515、215-1517、215-1518 ）
7. 15 mL 反应管（Sarstedt，目录号 62.554.002）
8. 黑色微量滴定板（Sarstedt，目录号：82.1581.120）
9. D-（+）-葡萄糖一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：49159）
10. M17肉汤（Oxoid，目录号：CM0817）
11. 细菌琼脂（Oxoid，目录号：LP0011T）
12. 硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：7783-20-2）
13. Na 2 HPO 4 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：71643）
14. NaH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
15. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）。
16. 蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P2308）
17. 2-丙醇≥99.0%，GPR RECTAPUR ® （VWR Chemicals，目录号： 20839.366）
18. 盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
19. 三氟乙酸，适用于 HPLC，≥99.0%（Sigma-Aldrich，目录号：302031）
20. 乙腈，LiChrosolv ® Reag 。欧元。（默克密理博，目录号：1000302500）
21. α-氰基-4-羟基肉桂酸（Bruker，目录号：8201344）
22. Bruker MTP 384 Target Plate Ground Steel BC（Bruker，目录号：8280784）
23. 肽校准标准 II（Bruker LabScape Daltonics，目录号：8222570）
24. 碘化丙啶（Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：P1304MP）
25. 脑心浸液肉汤（脱水）（Thermo Scientific，Oxoid，目录号：CM1135B）
26. GenElute TM细菌基因组 DNA 试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：NA2120-1KT）
27. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
28. KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：795488）
29. MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
30. （NH 4 ） 2 SO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
31. Nisin（Sigma-Aldrich，目录号：N5764-5G）
32. Micrococcin P1（Cayman Chemical，目录号：17093）
33. MOPS（3-吗啉代丙磺酸）（Sigma-Aldrich，目录号：69947）
34. 解决方案 A （见配方）
35. 解决方案 B （见配方）
36. 磷酸钠洗涤缓冲液（见配方）
37. PBS（磷酸盐缓冲盐水）（见食谱）
38. HCCA 基质溶液（见配方）
39. 李斯特菌最小缓冲液（LMB）（见食谱）

设备

1. ÄKTA 净化器 w/ Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900、Frac-900 ( Pharmacia Biotech )
2. HiPrep SP XL 16/10（GE Healthcare，目录号：28936540）
3. RESOURCE RPC 1 mL（Cytiva，目录号：17118101）
4. TS-100 Thermo-Shaker（Biosan，目录号： BS-010120-AAI）
5. -86 °C超低温冰箱（Thermo Scientific，型号：8708）
6. 培养箱（Termaks，型号：KBP6395LL）
7. Microfuge 16（贝克曼库尔特）
8. Finnpipette TM F2 GLP 试剂盒（Thermo Scientific，目录号：4700880）
9. Finnpipette TM F2 多通道移液器（Thermo Scientific，目录号：4662030）
10. pH 计（梅特勒-托利多® F20）
11. SPECTROstarNano（BMG LABTECH，德国）
12. 高速离心机 Avanti J-26 XP w/ JA-14 转子 (Beckman Coulter)
13. 默克 Milli-Q Integral 10（默克密理博）
14. 超声波浴（VWR，型号：USC100T）
15. NanoDrop 2000/2000c（Thermo Scientific，目录号：ND-2000C）
16. Hidex Sense 多模式酶标仪
17. 旋转摇床（I26，New Brunswick Scientific）
18. Infinite M200 荧光酶标仪 (Tecan)
19. IKA RCT 磁力搅拌器（IKA，目录号：0003810000）

软件

1. Unicorn 5.11 支持ÄKTA （ Cytiva， https ://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/unicorn-5-11-p-03388 ）

程序

A. 细菌素纯化
1. 中取出一瓶产生细菌素的培养乳酸乳球菌LMGT 4215（乳酸链球菌素 Z 生产商），并将其置于冰上或冷块中。
2. 将培养物无菌转移到补充有 0.5% wt/vol 葡萄糖 (GM17) 的 M17 琼脂板上，并带有无菌环并划出以获得单个菌落。
3. 在 30°C 下孵育 24 小时。
4. 从带有无菌循环的盘子中取出一个菌落，并将其转移到含有 10 mL GM17 肉汤的无菌培养管中。将试管 O/N（过夜）置于 30°C，不要摇晃。
5. 第二天，用早先制备的培养物（1% 接种物，v/v）接种 1 L 的 GM17。将瓶子在 30°C 下放置 20 – 24 小时，不要摇晃。
注意：细菌素的生产通常在早期稳定生长期达到峰值，但这可能因菌株而异。因此，如果产量很重要，则必须对每个新的细菌素生产者进行监测。如果培养物长时间孵育，细菌蛋白酶可以消化目标细菌素并降低甚至消除抗菌活性。优化每个细菌素生产者的孵育时间很重要。此外，细菌素的生产可能取决于生长培养基、温度和通风——所有这些参数也应针对特定的细菌素生产商进行优化（Telke 等人，2019 年）。
6. 在室温下将细菌素生产者的培养物 (1 L) 转移到离心瓶 (落地式离心机)。旋转细胞（10,000 × g ，20 分钟，4°C）。将上清液 (SN) 小心地分配到一个新的 1.5 – 2 L 瓶中。丢弃细胞沉淀。
注意：立即继续下一步，以避免上清液中的细菌生长。
7. 取一份 SN ( 1-2 mL) 来分析 SN 中的初始细菌素浓度。立即将 SN 等分试样在 100°C 下加热 5 分钟，以对蛋白酶进行灭菌和灭活。储存在 -20°C 直至使用。
8. 向冷的无细胞 SN（4°C）中加入硫酸铵干盐，以达到 50% (w/v) 饱和度；使用磁力搅拌器充分混合，直到所有盐溶解。将 SN 与硫酸铵 O/N 在 4°C 下进行蛋白质沉淀。
备注：
a. 使用硫酸铵饱和度计算器（例如： http ://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm ）。将硫酸铵浓度增加到 70% 的饱和度可以提高产量，因为更多的细菌素会沉淀。
b. 细菌素在水中是非结构化的，这意味着不需要仔细和逐渐添加硫酸铵。在我们的实验室中，该过程只需几分钟。加入硫酸铵后，溶液可在 4°C 下放置几天而不会丧失细菌素活性，因为蛋白酶不太可能在高浓度的硫酸铵下具有活性。然而，一些细菌素由于氧化而失去活性，例如片球菌素 PA-1 (Fimland et al., 2000)；在这种情况下，不建议长时间存放在硫酸铵中。
9. 离心硫酸铵溶液（12,000 × g 、45 分钟和 4 °C ），并小心丢弃离心瓶中的 SN，以避免重新悬浮蛋白质颗粒，因为蛋白质颗粒的损失会降低产量。
10. 将 Milli-Q 水中的所有蛋白质颗粒轻轻重悬至总体积 150 mL（100 – 150 mL/L 的上清液起始体积）。使用 5 mL 移液器去除并重新悬浮颗粒。将总体积转移到新瓶子或烧杯中。通过添加 1 M HCl 将蛋白质溶液的 pH 值调整为 4。
注意：降低 pH 值可确保细菌素肽带正电荷，从而提高与阳离子交换柱的结合。
11. 将阳离子交换柱 HiPrep 16/10 SP-XL 柱连接到配备馏分收集器的 ÄKTA purifier 系统。将最大压力限制设置为 0.5 MPa（该色谱柱的最高压力限制）以避免可能损坏色谱柱。
12. 用 pH 值为 4 的 Milli-Q 水清洗泵 A，用 1 M NaCl（无缓冲）清洗泵 B。
13. 用 5 CV（色谱柱体积；100 mL）调节至 pH 4 的 Milli-Q 水平衡色谱柱。
14. – 7 mL/min的流速将其应用于色谱柱。将流出物收集在新瓶中。
15. 用 5 CV 在 pH 4 的 Milli-Q 纯水再次清洗色谱柱（此步骤可以省略）。
16. 将泵 A 入口置于 20 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7) 中，并用 5 CV (100 mL) 清洗色谱柱。将流出物收集在新瓶中。
17. 在 20 分钟内以 5 mL/min 的流速用 0 M 到 1 M NaCl（无缓冲）的线性梯度洗脱细菌素。将馏分收集器设置为收集 20 个 5 mL 的馏分。使用微量滴定板测定法检查每个级分以及初始热处理的 SN、阳离子交换流过和“洗涤”级分的抗微生物活性（见下文）。将用 NaCl 洗脱的活性部分汇集起来进行反相色谱 (RPC) 纯化。
注意：为防止细菌素聚集，建议使用 1 M HCl 将合并的活性组分的 pH 值降低至 2。如果阳离子交换洗脱液要储存很长时间和/或纯化的细菌素分子很大（>40 个残基）和疏水性，这一点尤其重要。储存细菌素的推荐温度为 -20°C。
18. 使用连接到 ÄKTA purifier 系统的资源 RPC 柱 (1 mL) 执行 RPC 纯化。首先，用 0.1% (v/v) 三氟乙酸 (TFA; 溶液 A) 制备 200 mL Milli-Q 水和 0.1% (v/v) TFA 的 200 mL 2-丙醇（溶液 B）。分别用溶液 A 和 B 清洗泵 A 和泵 B。将最大压力限制设置为 4 MPa（该 RPC 色谱柱的最高压力限制）以避免潜在地损坏色谱柱。用至少 10 mL 的溶液 A 平衡 RPC 柱。
19. 将泵 A 入口从溶液 A 更改为来自阳离子交换色谱（洗脱液）的汇集活性组分。以 3 – 5 mL/min 的流速将洗脱液应用到色谱柱上。
20. 流速为 1.0 mL/min 的溶液 B的线性梯度 (0 – 100%) 洗脱细菌素。
– 50% 溶液 B下洗脱。
21. 将馏分收集器设置为从 RPC 柱中收集每个馏分 1 mL。总共收集 30 – 40 个分数。
22. 在微量滴定板测定中从每个部分中取出 10 μL 的等分试样进行抗菌活性测试（参见下面的微量滴定板协议）。

B. 微量滴定板测定
1. 添加 100 µL GM17 将肉汤培养基加入微量滴定板的 A1 至 A11 孔。在 A12 井中加入 200 μL 作为对照；这口井应该没有增长。
2. 将 100 μL 的热处理上清液或阳离子交换分数（流过、洗涤流过、洗脱分数）添加到 A1 中，总体积为 200 μL。
笔记：
a. 对于反相分数，使用 10 μL 的每个反相分数加上 90 μL 的生长培养基，使每口井的总添加量为 100 μL。
b. 如果预测纯化的细菌素（BAGEL4，AntiSMASH，见下文）由两种或多种不同的肽组成，则各个肽可以洗脱成不同的级分，从而导致抗微生物活性低或没有抗微生物活性。在这种情况下，我们建议汇集对应于峰的部分，并查看抗菌活性是否恢复。然后可以进行棋盘分析以确定肽在哪两个部分中。
c. 在超过 5-6小时的孵育过程中，对细菌素有抗性的突变体的生长可以取代野生型菌株的生长；因此，避免过夜孵育。
3. 通过上下吹打 4-5 次混合 A1 中的液体。
4. 从 A1 中取出 100 µL 并转移到 A2 中，上下移液 4 – 5 次以混合。将 100 μL 从 A2 移动到 A3，依此类推，直到 A10。
5. 在 A10 中混合后，丢弃含有 100 μL 液体的尖端。
6. 将指示剂（已知对您的细菌素敏感，例如乳酸乳球菌IL1403 或无害李斯特菌LMGT 2785 用于乳酸链球菌肽）进行 25 倍稀释的 O/N 培养物，例如，将 1 mL O/N 培养物放入 24 mL 的 BHI 肉汤中。
7. 在 A11 井中加入 100 μL 的稀释培养物。现在 A11 中有 200 µL 没有细菌素；这是正常细胞生长的阳性对照。
8. 继续将 100 µL 稀释的指示培养物添加到 A10，然后是 A9，依此类推，直到 A1，但不更换吸头。现在所有 A1 – A12中都有 200 µL 的液体。 A12 永远是透明的（纯肉汤），A11 会变得浑浊（只有细菌）。
注意：其他部分可以使用微量滴定板的其余部分 (B1-H1) 进行测试。将测试样品应用到孔中后，使用多通道移液器。
9. 下孵育5-6 小时。
10. 使用 SPECTROstar Nano 等分光光度计测量 A 600的生长。一个细菌素单位 (BU) 定义为在 200 µL 培养物中抑制指示菌株生长至少 50% 的细菌素量（即，≤ 50% 的不含细菌素的对照培养物的浊度）。图 1 第 5 栏中的抗微生物剂的量为 1 BU 或 5 BU/mL。如果一开始将 10 µL 的 RPC 馏分添加到 1 号井中，则 RPC 馏分的活性为 3,200 BU/mL。
注意：使用此处介绍的细菌素纯化方案，我们通常在无细胞上清液中从 320 BU/mL 开始实现 60-70% 的收率。

图 1. 微量滴定板检测示例。
对来自同一 RPC 级分的 8 份乳链菌肽 Z（每份 10 µL）进行了针对乳酸乳球菌IL1403 的抗菌活性测试。将板在 30°C 下孵育 5 小时，然后在 600 nm 处读取光密度。具有明显抑制作用的孔（与第 11 列孔中的 OD 相比超过 50%）显示为黄色（第 1-5 列），没有细菌素的培养物显示为棕色（阳性对照；第 11 列），没有或少于 50 个的培养物白色为 % 抑制，蓝色为 GM17 肉汤对照（阴性对照；第 12 列）。

C. 蛋白酶敏感性
1. 将 Milli-Q 水中的蛋白酶 K 重组为 20 mg/mL。
2. 稀释指示菌株L. lactis IL1403（用于乳酸链球菌肽 Z）；均匀地倒在 GM17 琼脂板上。让软琼脂凝固3-5 分钟，盖子部分关闭。
3. 滴2-3 µL的细菌素产生 O/N 培养物（或含有细菌素的溶液）。在产生细菌素的培养物附近滴 2 μL 蛋白酶 K 溶液 4-5毫米（确保滴不混合）。让板干燥5-10 分钟，然后在适当的温度下孵育 O/N。第二天，如果抗菌剂对蛋白酶 K 敏感，板上将出现“新月”形状，见图 2。
注意：圆形和高度修饰的细菌素对蛋白酶 K 具有弹性。

图 2. 蛋白酶 K 下降（用黑点表示）降解乳酸乳球菌LMGT 4215 (A) 产生的乳链菌肽 Z，使其对指示培养乳酸乳球菌IL1403 (B) 失去活性。

D. 热稳定性
1. 使用离心机（10,000 × g ，3 分钟）旋转细菌素生产者的 O/N 培养物。也可以通过使用 0.2 µm 过滤器过滤对 SN 进行进一步消毒。
2. 取 1 mL 的无细胞 SN 并将其平均分配到两个离心管中。将一根管子放在室温下，将另一根管子放在 100°C 的加热块（或水浴）中 5 分钟。使用如上所述的微量滴定板测定比较两个管（加热和非加热）中的抗菌活性。
注意：细菌素是热稳定的分子，加热后不会失去活性。如果加热后抗菌活性丧失，很可能是由于抗菌酶/蛋白质（高分子量）所致。

E. 马尔迪 TOF MS
1. 如配方部分所述准备 MALDI 矩阵解决方案。通过涡旋彻底溶解α-氰基-4-羟基肉桂酸 (HCCA) ，然后进行超声处理 (5 分钟)。
注意：虽然许多替代基质，例如 2,5-二羟基苯甲酸 (DHB)，都可以很好地工作，但我们发现 HCCA 对细菌素分析特别有用。
2. 根据制造商的说明，通过将肽校准标准 II 溶解在 0.1% TFA 中来制备校准标准。将肽校准标准品以 4 – 5 µL 等分试样形式储存在 -20°C 直至使用。
注意：为获得最佳结果，建议经常校准质量轴。这是通过从涵盖有用质量范围的校准标准中获取光谱来实现的，该标准可以从多个供应商处获得。
3. 向 1 – 2 µL RPC 纯化的细菌素样品中加入等体积的基质溶液，例如，在 0.2 mL PCR 管中，并通过上下吹打数次彻底混合。在 MALDI 目标板上的一个点上涂抹一小滴 (0.5-1 µL ) 并让液滴空气干燥。
注意：为获得最佳质量准确度结果，请始终将样品放置在校准点旁边，校准点的制备方式与样品点相同。
4. 将目标板安装在目标框架中，将框架插入仪器，等待离子源完全抽空。加载适当的（正反射模式）采集方法。将仪器设置为 20 kV 的加速电压（离子源 1）、大约 18 kV 的离子源 2、大约 21 kV 和 11 kV 的反射电压 1 和 2，以及大约 140 的 PIE（延迟提取）设置ns。要抑制低质量（主要是矩阵）信号，请使用 400 – 600 的偏转设置。
注意：所述程序适用于使用 Bruker Daltonics Ultraflex 和 Ultraflextreme MALDI-TOF/TOF 仪器进行的分析。对于其他系统，可能需要调整样品制备和仪器设置。
5. 将光标定位在适当的位置并开始发射激光。调整激光强度以实现最大分辨率。通过多次拍摄达到所需的峰值强度和信噪比；相反，增加激光强度可能会导致分辨率和质量精度较差。一旦积累了可接受的光谱，通过使用三次增强函数将峰分配到理论单同位素 m/z 值列表来校准仪器。可接受误差小于 5 ppm 的校准；通常，达到<2 ppm。一旦校准光谱被接受，仪器的质量轴被校准，继续从您的样品点采集数据。图 3 显示了乳链菌肽的一个代表性示例。

图 3. 从最活跃的 RPC 馏分获得的 MALDI TOF MS 谱图。
3329.6 m/z 的质量与乳酸链球菌素 Z（包含一个未修饰的 Ser/Thr）的预测质量很好地对应。

F. 全基因组测序和分析
1. 根据制造商的说明，使用 GenElute 细菌基因组 DNA 试剂盒从 1.5 mL 的过夜培养物中制备细菌素生产者的基因组 DNA。
2. 确保样本满足测序实验室设定的最低要求。对于 Novgene 的微生物基因组测序，Qubit 的样品浓度应≥ 10 ng/µL，最小体积为 20 µL。 DNA 总量应≥ 200 ng。 DNA 应在琼脂糖凝胶上迁移为大约 20 – 25 kb的单条带， NanoDrop 的OD 260/280应为 1.8 – 2.0。
3. 将样品运送给您的测序提供商（例如，Novogene）进行细菌全基因组测序（100 ×覆盖率，双端 150 bp）。
4. 使用您的测序提供商的 Web 界面下载测序结果。两个文件应与样本相关联，并具有用于正向读取的后缀 _R1/_1 和用于反向读取的 _R2/_2。
5. https://www.patricbrc.org创建一个帐户，该帐户提供免费的生物信息学分析，例如组装。
注意：大多数汇编软件都是免费分发的，可以在您的个人计算机上执行（例如 SPAdes、MEGAHIT、ALLPATHS-LG、IDBA-UD、MIRA 和 Velvet）。但是，大多数研究人员无法使用这些工具，因为它们需要熟悉命令行界面和 GNU/Linux（或 Linux 的 Windows 子系统）。
6. 在 Web 界面中，转到 WORKSPACES 和“Genome Groups”。转到“上传”，然后“选择文件”。选择两个测序文件。然后“开始上传”。
7. 选择第一个文件，然后选择“编辑类型”并在下拉菜单中选择“读取”。对这两个文件执行此操作。
8. 转到“服务”，然后转到“组装”。在“Paired read library”框中，选择read file 1作为名为_R1或_1的文件。对于读取文件 2，选择名为 _R2 或 _2 的文件。
9. 在“Parameters”框中选择“Assembly strategy”下的SPAdes，将输出文件夹设置为“/home/Assemblies”。为程序集指定一个输出名称。
10. 点击“Paired read library”框中的右箭头，然后点击底部的“Assemble”。
11. 组装完成后，转到“工作区”并选择“家”。双击“Assemblies”目录，然后在具有先前选择的程序集名称的目录上。
12. 选择名为 *contigs.fasta 的文件，然后单击右侧绿色栏中的“DWNLD”下载文件。
13. 将文件提交到http://bagel4.molgenrug.nl和https://antismash.secondarymetabolites.org以识别细菌素基因，参见图 4A。
14. 分析已识别的基因并将理论单同位素质量与 MALDI TOF MS 获得的质量进行比较。可以使用 PeptideMass ( https://web.expasy.org/peptide_mass/ ) 等工具计算质量，参见图 4B。

图 4. AntiSMASH 搜索结果。
AntiSMASH 正确识别来自乳酸链球菌肽 Z 生产者 (A) 的组装重叠群中的羊毛肽簇。预测核心肽的理论单同位素质量在位于 AntiSMASH 窗口 (B) 右下方的面板中提供。假设 1 个未修饰的 Ser/Thr (3331.0 Da)，在替代权重中正确预测了 MALDI TOF MS 测量的质量。

G. 碘化丙啶成孔试验
1. 在黑色 96 孔板的孔中将含有 40 μM 碘化丙啶的 PBS 中的 RPC 纯化抗菌剂稀释至总体积为 100 μL。包括三种对照，一种不含抗微生物剂，一种含有不形成孔的抗微生物剂，如微球菌素 P1，另一种含有已知的致孔剂，如市售的乳链菌肽 A。
2. 准备 20 – 50 mL 过夜培养的指示剂，例如GM17 中的乳酸乳球菌IL1403。在 PBS 中清洗细胞一次并重新悬浮至 OD 600为 1。
3. 将 100 μL 的细胞悬浮液添加到含有稀释抗菌剂和阴性对照的孔中。
4. 立即将 96 孔板放入 Hidex Sense 读板器中，每 10 分钟（动力学）测量一次荧光，持续 3 小时，激发波长为 535/20 nm (515 – 555 nm)，发射波长为 630/40 nm (590 – 670 )纳米）；有关代表性结果，请参见图 5，有关碘化丙啶测定原理，请参见图 6。
注意：根据仪器的设置和动态范围，许多荧光计可以产生非常大的值。在这里，我们只对样本之间的差异感兴趣；通过将所有样品的读数除以相同的常数（例如，从含有微球菌素 P1 的孔中读取的第一个读数，使该值等于 1）获得相对荧光值。

图 5. 碘化丙啶孔形成试验。
对于商业乳酸链球菌素 A（绿色）以及纯化的乳酸链球菌素 Z（灰色）部分，观察到指示孔形成的荧光增加。带有微球菌素 P1（黄色）的孔（不形成孔但通过抑制蛋白质合成杀死细胞）或未添加抗菌剂的对照孔（NC；蓝色）显示荧光没有增加。

图 6. 基于碘化丙锭的孔形成测定的原理。
完整的细菌膜对碘化丙啶分子是不可渗透的（左）。膜破坏使 PI 扩散到细菌中并与 DNA 相互作用，导致荧光强度增加（右图）。三角形代表溶液中 PI 的荧光发射（小三角形，左）以及与 dsDNA 相互作用时（大三角形；右）。

H. 使用 pHlourin 生物传感器评估孔形成
1. 从生物传感器细菌的单个菌落中接种 5–10 mL 含有 10 µg/mL 氯霉素的 BHI，例如无害李斯特菌/pNZ-pHin2 Lm （生物安全级别 1）或单核细胞增生李斯特菌/pNZ-pHin2 Lm (BSL 2)（ Reich等人，2022 年），并在 37°C 下在摇动条件下（130 rpm）孵育过夜。
2. 第二天早上，通过在 4,500 × g下离心10 分钟来收获细菌，用等体积的 PBS 洗涤，并测量 OD 600 （通常在 3-4 之间）。再次离心并在李斯特菌最小缓冲液 (LMB) 中以 3的 OD 600重悬细菌（Crauwels等人，2018 年）。
3. 在黑色 96 孔微量滴定板中制备样品，如下所示：
a. 对于多个样品中的活动的一般分析，将每个样品分配 100 μL 到微量滴定板的孔中。包括 100 μL LMB（无孔形成）和含有 10 μg/mL 商业乳链菌肽 A 制剂（最大孔形成）的 100 μL LMB 的控制。
b. 为了对多达 8 个样品中的活动进行更深入的分析，每孔填充 100 μL LMB 的样品行数与要分析的样品一样多。将 100 μL 的样品添加到一行的第一口井中，并通过移液混合。通过使用多通道移液器将 100 μL 转移到下一个井中，准备水平稀释行，确保始终混合良好。重复直到第 11 列，然后从第 11 列的孔中丢弃 100 μL。如步骤 3a 中所述，将第 12 列中的孔用于阳性和阴性对照。
注意：第 12 列用于阴性和阳性对照，例如，使用 A12/B12/C12 孔作为阴性对照，使用 D12/E12/F12 作为阳性对照。
4. 使用多通道移液器，将 100 μL 的 LMB 悬浮传感器细菌添加到所有井中。通过洗牌实验室工作台上的板仔细混合。
5. 在黑暗中在 RT 中孵育 30 分钟。
6. 使用在 400 和 480 nm 处激发的无限 M200 多板阅读器 (Tecan) 测量每口井 520 nm 处的荧光发射。
7. 在结果文件中，将 400 nm 激发的发射值除以 480 nm 激发的发射值。通过绘制比较比率值，例如，作为条形图（图 7）。孔的形成导致细胞内 pH 值的崩溃，从而导致荧光比的降低。

图 7. 通过 pHluorin2 荧光评估膜完整性的原理。
生物传感器细菌组成型表达 pH 敏感荧光蛋白 pHluorin2，其显示双峰激发光谱，最大值在 400 和 480 nm。在完整细胞中，两个激发峰处的荧光强度比由细胞内 pH 值定义（左）。如果 pH 稳态被膜损伤化合物破坏，细胞内 pH 下降至测定缓冲液的 pH（pH 6.2），这导致 pHLuorin2 在右侧两个激发峰处的荧光强度发生比例变化）。计算两个激发最大值（400 和 480 nm）处的荧光强度比可以区分完整细胞和破坏细胞（中）。

食谱

1. 解决方案 A
试剂最终浓度数量
三氟乙酸 (99%) 0.1% 0.1 毫升
H 2 O 不适用 99.1 毫升
全部的不适用 100 毫升

2. 解决方案 B
试剂最终浓度数量
2-丙醇 ( ≥99.0% ) 不适用 99.9 毫升
三氟乙酸 (99%) 0.1% 0.1 毫升
全部的不适用 100 毫升

3. 磷酸钠洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
NaH 2 PO 4 (1 M) 650 µL
Na 2 HPO 4 (0.5 M) 2670 微升
H 2 O 不适用 96.68 毫升
全部的不适用 100 毫升

4. PBS（磷酸盐缓冲液）
试剂最终浓度数量
氯化钠 137 毫米 8 克
氯化钾 2.7 毫米 0.2克
Na 2 HPO 4 10毫米 1.44 克
KH 2 PO 4 1.8 毫米 0.24 克
H 2 O 不适用高达 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升

5. HCCA基质溶液
试剂最终浓度数量
肝癌 15毫克/毫升 15毫克
TFA (10%) 0.1% 10 µL
乙醇 50% 500 µL
乙腈 49.9% 490 µL
全部的不适用 1毫升

6. 李斯特菌最小缓冲液 (LMB)
试剂最终浓度数量
拖把 100 毫米 2.09 克
KH 2 PO 4 4.82 毫米 65.6 毫克
Na 2 HPO 4 11.55 毫米 206 毫克
硫酸镁4 1.7 毫米 20.5 毫克
(NH4) 2 SO 4 0.6 毫克/毫升 60 毫克
葡萄糖 55毫米 1.09 克
氢氧化钠 (1 M) 不适用至 pH 值 6.5
全部的不适用 100 毫升

致谢

该项目已获得欧盟地平线 2020 研究和创新计划下的生物基工业联合承诺的资助，资助协议编号为 790507，并通过国家研究与发展中心获得 2014-2021 年挪威资助（资助编号NOR/POLNOR/上一页生态/0021/2019-00) 。 TFO 承认挪威研究委员会的资助（项目编号 275190）。
碘化丙啶孔形成测定已改编自 Chehimi等人。 (2010),王等人。（2014 年）和 Boix-Lemonche等人。（2020 年）。挪威通过国家研究与发展中心拨款 2014-2021 年； NOR/POLNOR/PrevEco/0021/2019-00。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. Acedo, JZ, Chiorean, S., Vederas, JC 和 van Belkum, MJ (2018)。革兰氏阳性菌的细菌素结构多样性不断扩大。 FEMS 微生物第 42(6) 版：805-828。
2. Alvarez-Sieiro, P., Montalban-Lopez, M., Mu, D. 和 Kuipers, OP (2016)。乳酸菌的细菌素：扩大家族。应用微生物生物技术100(7):2939-2951。
3. Blaser, M. (2011)。停止杀死有益细菌。自然476（7361）：393-394。
4. Boix-Lemonche, G.、Lekka, M. 和 Skerlavaj, B. (2020)。一种基于荧光的快速微孔板测定法，用于研究膜活性抗菌肽与全革兰氏阳性细菌的相互作用。抗生素（巴塞尔） 9（2）：92。
5. Chehimi, S., Pons, AM, Sable, S., Hajlaoui, MR 和 Limam, F. (2010)。 thuricin S 的作用方式，一种来自苏云金芽孢杆菌的新型 IId 类细菌素。 Can J Microbiol 56（2）：162-167。
6. Cotter, PD, Ross, RP 和 Hill, C. (2013)。细菌素 - 抗生素的可行替代品？ Nat Rev 微生物11(2): 95-105。
7. Crauwels, P., Schafer, L., Weixler, D., Bar, NS, Diep, DB, Riedel, CU 和 Seibold, GM (2018)。细胞内 pHluorin 作为传感器，用于轻松评估单核细胞增生李斯特菌中细菌素诱导的膜损伤。前沿微生物9：3038。
8. Desiderato，CK，Sachsenmaier，S.，Ovchinnikov，KV，Stohr，J.，Jacksch，S.，Desef，DN，Crauwels，P.，Egert，M.，Diep，DB，Goldbeck，O.，等。（2021 年）。通过筛选工具的组合鉴定产生对单核细胞增生李斯特菌有活性的细菌素的潜在益生菌。国际分子科学杂志22（16）：8615。
9. Diep, DB 和 Nes, IF (2002)。革兰氏阳性菌中核糖体合成的抗菌肽。 Curr 药物目标3(2)：107-122。
10. Eijsink, VG, Axelsson, L., Diep, DB, Havarstein, LS, Holo, H. 和 Nes, IF (2002)。乳酸菌生产II类细菌素；生物战和通信的一个例子。安东尼范列文虎克81（1-4）：639-654。
11. Field, D.、Cotter, PD、Hill, C. 和 Ross, RP (2015)。生物工程羊毛硫抗生素治疗成功。前微生物6：1363。
12. Fimland, G., Johnsen, L., Axelsson, L., Brurberg, MB, Nes, IF, Eijsink, VG 和 Nissen-Meyer, J. (2000)。类片菌素细菌素中的 C 末端二硫键使细菌素活性对温度的依赖性降低，并且是抗菌谱的主要决定因素。细菌杂志182（9）：2643-2648。
13. Frieri, M.、Kumar, K. 和 Boutin, A. (2017)。抗生素耐药性。 J 感染公共卫生10(4): 369-378。
14. Garsa, AK, Kumariya, R., Sood, SK, Kumar, A. 和 Kapila, S. (2014)。细菌素的生产及其回收和纯化的不同策略。益生菌抗菌蛋白6（1）：47-58。
15. Goldbeck, O., Desef, DN, Ovchinnikov, KV, Perez-Garcia, F., Christmann, J., Sinner, P., Crauwels, P., Weixler, D., Cao, P., Becker, J.,等人。（2021 年）。建立在谷氨酸棒杆菌中重组产生片霉素 PA-1。代谢工程68：34-45。
16. Hagihara, M.、Crandon, JL 和 Nicolau, DP (2012)。抗生素联合治疗对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染的疗效和安全性。专家意见药物安全11（2）：221-233。
17. Högberg , LD, Heddini, A. 和 Cars, O. (2010)。全球对有效抗生素的需求：挑战和最新进展。趋势药理学31（11）：509-515。
18. Holo, H., Nilssen, O. 和 Nes, IF (1991)。乳球菌素 A，一种来自乳酸乳球菌亚种的新细菌素。 cremoris：蛋白质及其基因的分离和表征。细菌杂志173（12）：3879-3887。
19. Khameneh, B.、Diab, R.、Ghazvini, K. 和 Fazly Bazzaz, BS (2016)。细菌耐药机制的突破以及对抗它们的潜在方法。微生物病原体95：32-42。
20. Nes, IF, Yoon, SS 和 Diep, D. (2007)。乳酸菌中核糖体合成的抗菌肽（细菌素）：综述。食品科学生物技术16：675-690。
21. Nissen-Meyer, J. 和 Nes, IF (1997)。核糖体合成的抗菌肽：它们的功能、结构、生物发生和作用机制。拱微生物167（2-3）：67-77。
22. O'Brien, GJ 和 Mahanty, HK (1994)。 Colicin 24，一种来自大肠杆菌尿路致病菌株的新型质粒携带的大肠杆菌素。质粒31(3)：288-296。
23. Oftedal, TF, Ovchinnikov, KV, Hestad, KA, Goldbeck, O., Porcellato, D., Narvhus, J., Riedel, CU, Kjos, M., Diep, DB 和 Howell, KS (2021)。 Ubericin K，一种针对甘露糖-PTS 的新型成孔细菌素。微生物学谱9(2)：e00299-00221。
24. Ovchinnikov, KV, Chi, H., Mehmeti, I., Holo, H., Nes, IF 和 Diep, DB (2016)。来自革兰氏阳性细菌的新型无前导多肽细菌素组。应用环境微生物82(17)：5216-5224。
25. Reich, SJ, Stohr, J., Goldbeck, O., Fendrich, B., Crauwels, P. 和 Riedel, CU (2022)。改进的荧光李斯特菌 spp.用于通过流式细胞术分析抗菌素的生物传感器。微生物学打开11 ： e1304。
26. Telke, AA, Ovchinnikov, KV, Vuoristo, KS, Mathiesen, G., Thorstensen, T. 和 Diep, DB (2019)。通过增加基因剂量和优化培养条件，无领导菌素 Garvicin KS 的产量增加了 2000 多倍。前微生物10：389。
27. Wang, G., Feng, G., Snyder, AB, Manns, DC, Churey, JJ 和 Worobo, RW (2014)。杀菌性 thurincin H 导致蜡样芽孢杆菌F4552的独特形态变化，而不影响膜通透性。 FEMS 微生物快报357（1）：69-76。
28. Weixler, D., Berghoff, M., Ovchinnikov, KV, Reich, S., Goldbeck, O., Seibold, GM, Wittmann, C., Bar, NS, Eikmanns, BJ, Diep, DB 和 Riedel, CU (2022 ）。使用谷氨酸棒杆菌在两步过程中重组生产羊毛硫抗生素乳酸链球菌肽。微生物细胞事实21（1）：11。
29. Willing, BP, Russell, SL 和 Finlay, BB (2011)。改变平衡：抗生素对宿主-微生物群共生的影响。 Nat Rev 微生物9（4）：233-243。
30. 世界卫生组织。（2018 年）。抗菌素耐药性和初级卫生保健（WHO/HIS/SDS/2018.56）。世界卫生组织。