材料和试剂

1. 培养皿60 × 15 mm 500/cs（Fisher Scientific，目录号：FB0875713A）
2. 移液器吸头 2 – 200 µL Eppendorf ® epT.IPS _ （Eppendorf，目录号：022492039）
3. 移液器吸头 50–1,000 µL Eppendorf ® epT.IPS _ （Eppendorf，目录号：022492055）
4. Eppendorf ® Safe-Lock 1.5 mL 微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）
5. Corning ® 15 mL 离心管（Corning，目录号：430791）
6. 玻璃培养基瓶200 mL（ Fisher Scientific，目录号： FB800250）
7. 载玻片（25 × 75 × 0.9mm）和盖玻片（22 × 22mm）（Sigma-Aldrich，目录号： CLS294875X25-72EA； C9802-1PAK)
8. C. elegans菌株（Caenorhabditis 遗传学中心：N2 Bristol）
9. 大肠杆菌菌株 OP50-1（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传学中心，MN）
10. 枯草芽孢杆菌菌株 NCIB3610（Bacillus Genetic Stock Center，目录号：3A1 和 1A96）
11. 1,1'-二十八烷基-3,3,3',3 ',-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（ DiI ，Sigma-Aldrich，目录号：468495）
12. 七水合硫酸镁（MgSO 4 · 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
13. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
14. 磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P2222）
15. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
16. 叠氮化钠（ Sigma-Aldrich，目录号：S8032）
17. NaClO次氯酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：13440）
18. 氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
19. Bacto蛋白胨（BD， Bacto TM ，目录号：211677）
20. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
21. 无水乙醇中的胆固醇胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
22. 100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
23. 二水合氯化钙（CaCl 2 · 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
24. Luria肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
25. M9 缓冲器（见配方）
26. 线虫生长培养基 (NGM) 琼脂（参见食谱）
27. 磷酸钾缓冲液（见配方）
28. 1 M MgSO 4 （参见食谱） 5 mg/mL 胆固醇（参见食谱）
29. 1 M CaCl 2 (见配方)
30. LB 媒体（见食谱）
31. 磷酸盐缓冲液（见配方）
32. 1 N NaOH（见配方）
33. 漂白溶液（见食谱）
34. DiI原液（见配方）

设备

1. 荧光显微镜蔡司（Carl Zeiss，序列号：3108012846）
2. 摇床（ Axyos Technologies，目录号：S04036.tu）
3. 高压灭菌器（ Tuttnauerusa ，型号：6690）
4. 蠕虫选择。蠕虫镐可以购买（Genesee Scientific，目录号：59-AWP）或如Wollenberg所述在实验室制造等人。（2013）。
5. 离心机（Eppendorf，型号：5430）
6. 台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
7. 本生灯（ Humbolt ，目录号：H-5870）

程序

A. C. 线虫维护
1. 大肠杆菌OP50 菌落接种到 200 mL烧瓶中的50 mL LB 肉汤中，并在 37°C 下轻轻搅拌过夜（1 × 10 8 UFC/mL；OD：1–1.2）。
2. 将大约 200 μL的 OP50 液体培养物涂抹到 60 mm NGM 板上。使用前将接种板在 37°C 下孵育过夜。
3. 蠕虫可以分块（每 3-4 天将携带蠕虫的琼脂片从旧盘子转移到新盘子中）。
4. 将蠕虫保持在 20°C。

B. 通过漂白同步线虫
1. 允许先前同步的蠕虫生长到 L4 幼虫阶段（大约 48 小时，参见图 1），然后是成人阶段（约 8 小时）。
2. 通过用 M9 缓冲液洗涤板，在 15 mL 管中恢复妊娠成人（参见配方 1）。
3. 通过在 400 下离心沉淀蠕虫 × g （标准台式离心机上约 1,500 rpm）和室温 2 分钟，弃去上清液。
4. 执行 1 – 3 次洗涤，直到缓冲液中没有细菌。
5. 将 5 mL 的漂白溶液（参见配方 8）加入试管中，在室温下剧烈摇晃长达 5 分钟。漂白超过 5 分钟会杀死鸡蛋。我们在解剖显微镜下跟踪虫体的破坏，当仍然可以看到成虫的痕迹时停止反应，这通常需要 3 到 5 分钟。
6. 通过添加 M9 缓冲液停止反应，直到锥形管的 15 毫升标记。
7. × g快速离心（因为处理可能仍然有效） 1 分钟，弃去上清液。
8. 用 M9 缓冲液填充试管，再清洗颗粒 3 次。
9. 将 1 mL 的 M9 缓冲液添加到颗粒中，或将鸡蛋放入未播种的 NGM 板中，并在所需温度下轻轻搅拌孵育。应提供适当的曝气以获取 L1 阶段的所有动物。在继续进行之前，我们会检查所有蠕虫是否处于幼虫阶段 1。
10. 将 L1 种群转移到先前用相应细菌食物播种的 NGM 琼脂板上，并孵育直到它们达到青年阶段，大约 48 小时后（见图 1）。大多数秀丽隐杆线虫菌株在接种有大肠杆菌OP50 或枯草芽孢杆菌NCIB3610 的 NGM 培养基上保持在 20°C。

图1 。 C. elegans从产卵到成虫的生命周期。
一个。通过解剖显微镜观察的线虫。 B.秀丽隐杆线虫的生命周期。动物在四个幼虫阶段的大小增加。照片是在培养皿上拍摄的（注意除了dauer图像之外的所有图像中的细菌草坪）。比例尺：0.1 毫米。

C. DiI染色
1. 大肠杆菌OP50- 和枯草芽孢杆菌NCIB3610- 菌株喂养的成虫（每种条件大约 100 条蠕虫）被收集、洗涤并重新悬浮在 1 mL 的 M9 缓冲液中，然后与 5 μL 的 1 混合： DiI溶液的 200 倍稀释（从储备溶液制备，参见配方 10）。
2. 在室温下在摇床 (20 × g , ~ 75 rpm) 上孵育 2-3 小时。
3. 用 M9（1–3 次洗涤）清洗蠕虫，并将标记的蠕虫转移到琼脂垫上。

图 2. DiI染色的秀丽隐杆线虫神经元。
由 OP50 或 NCIB3610 细菌定殖的衰老蠕虫的神经元形态变化。由 OP50 或 NCIB3610 细菌细胞（A 和 C 的右侧和底部矩形；和 B，分别）在不同年龄定殖的衰老野生型蠕虫用荧光DiI标记以突出两栖动物神经元形态：A，正常形态或无神经元失利; B、部分神经元改变或部分神经元丢失； C，总神经元退化或总神经元损失。 A-C 中的顶部和底部显微照片（分别为相差和荧光显微镜）代表每个年龄分析的 10 个独立蠕虫图像。 A 中的箭头表示化学感觉蠕虫神经元（即ASK、ADL、ASI、ASH、ASJ 和 AWB）的位置，B 中的箭头表示一些与年龄相关的神经元改变。 D. 与年龄相关的神经变性的半量化。在指定时间取出10 只 OP50 或 NCIB3610 细菌定植的 N2 蠕虫，在 NGM平板上于 20°C 培养，在指定时间进行处理，并用DiI标记以确定与年龄相关的神经元退化程度（不是丢失、部分丢失或失利）。结果表示为蠕虫初始种群的百分比 (n = 100) ± 来自Cogliati的 SEM 图像等人。（2020）经许可。

D. 获取蠕虫的图像
1. 叠氮化钠（叠氮化物作为蠕虫的麻醉剂）将标记的蠕虫安装到载玻片上的 2% 琼脂垫上，并附上盖玻片。
2. 使用 40 ×目标可视化标记的蠕虫。
3. 可以使用 Olympus FV1000 激光共聚焦扫描显微镜使用 Zen 程序随时间检查神经元退化，并可以进行半定量分析。

数据分析

分析蠕虫是否缺乏两栖神经元结构（完全丧失）、是否存在完整且完整的两栖神经元组（无损失）或存在至少一个单一的结构异常，例如波浪状、分枝状或中断的树突（部分丢失）（见图 2）。所有测定至少重复进行三次。使用 OASIS 程序，通过对数秩和 Kaplan-Meier 检验计算平均存活天数、平均值的标准误差 (SEM)、95% 置信度的平均存活天数间隔以及比较平均值的相等 p 值。图中使用了 SEM 值； p < 0.05 被认为具有统计学意义。

笔记

1. 当蠕虫是老成虫时，不要离心，而是让它们自己安顿下来，因为离心会损坏它们，因为它们非常虚弱。
2. 将蠕虫安装在切片上时，将移液器尖端的末端切掉约 0.5 厘米，以形成更宽的开口，这将有助于避免在转移蠕虫时破坏蠕虫。
3. 为了更好地欣赏DiI的染色，在显微镜下观察蠕虫时关掉灯。

食谱

1. M9缓冲器
3克KH 2 PO 4
6克Na 2 HPO 4 ·7H 2 O
5克氯化钠
加水至 1 L 高压釜，然后加入 1 mL 1 M MgSO 4
2. 用于 1 L 培养基的线虫生长培养基 (NGM) 琼脂
3.0 克氯化钠
20 克Bacto琼脂
2.5 克细菌蛋白胨
高压灭菌琼脂，冷却至 55°C，然后加入：
1 mL 1 M MgSO 4
1 mL 的 1 M CaCl 2
1 mL 5 mg/mL 胆固醇的无水乙醇
25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液（参见配方 6）
3. 1 M MgSO 4 · 7H 2 O
6 g MgSO 4七水合物溶解在 50 mL 的 dH 2 O中
高压釜（121 °C 20 分钟）
在室温下储存
4. 5毫克/毫升胆固醇
将 0.25 克胆固醇溶解在 50 毫升 100% 乙醇中
不要高压灭菌
5. 1 M 氯化钙2
5.55 g CaCl 2二水合物溶解在 50 mL 的 dH 2 O中
高压釜（121 °C 20 分钟）
在室温下储存
6. 磷酸钾缓冲液（1 M KPO 4 ，pH 6.0）
108.3 克 KH 2 PO 4
35.6 克 K 2 HPO 4
水高达 1 升
高压釜（121 °C 20 分钟）
在室温下储存
7. LB媒体
20 g LB 肉汤溶于 1 L ddH 2 O
高压釜（121 °C 20 分钟）
8. 漂白液
1 mL 3% 次氯酸盐溶液
2.5 毫升 1 N NaOH
0.5 毫升 dH 2 O
9. 1 N NaOH
将 2 g NaOH 溶解在 50 mL 的 dH 2 O中
10. DiI原液
储备溶液为 2 mg/mL 的二甲基甲酰胺
在 -20 °C 下储存在铝箔包裹的管中
在 M9 中稀释原液 1:200。当你这样做时，一些染料会沉淀。

致谢

这项工作得到了 CONICET ( Consejo Nacional de Investigaciones ) 的支持 Científicas y Técnicas ) 和FONCyT ( Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica ) 在 Pew 拉丁美洲生物科学项目（美国费城）、富布赖特委员会（美国华盛顿特区）和前 Fundación Antorchas （阿根廷布宜诺斯艾利斯）的帮助下。我们修改了来自Stiernagle T. Maintenance of C. elegans的培养基和 NGM 板的制备。蠕虫书。 2006 年 11：1-11。我们从 Montserrat Porta-de-la-Riva等人修改了秀丽隐杆线虫同步。（2012）。基本秀丽隐杆线虫方法：同步和观察。可视化实验杂志； 64，e4019，1-9。该协议基于“ Dil和diO ：用于神经元标记和通路追踪的多功能荧光染料”（Honig 和 Hume，1989 年）。

参考

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2. Cogliati , S.、Clementi, V.、Francisco, M.、Crespo, C.、 Arganaraz , F. 和 Grau, R. (2020)。枯草芽孢杆菌延迟阿尔茨海默病模型秀丽隐杆线虫的神经变性和行为障碍。阿尔茨海默病杂志73（3）：1035-1052 。
3. Godement , P., Vanselow , J., Thanos , S. 和 Bonhoeffer, F. (1987)。一项使用新方法开发视觉系统的研究，该方法对神经元及其在固定组织中的过程进行染色。发展101（4）：697-713。
4. Griffin, E.、Caldwell, K. 和 Caldwell, G. (2017)。使用秀丽隐杆线虫发现阿尔茨海默病的遗传和药理学。 ACS Chem Neurosci 8 ： 2596-2606。
5. Hofmann, MH 和Bleckmann , H. (1999)。温度和钙对固定脑制剂中 DiI 跨神经元扩散的影响。 J神经科学方法88（1）：27-31。
6. Honig, MG 和 Hume, RI (1986)。荧光羰花青染料允许在长期培养中研究已确定来源的活神经元。细胞生物学杂志 103（1）：171-87。
7. Honig, MG 和 Hume, RI (1989)。 Dil 和 diO：用于神经元标记和通路追踪的多功能荧光染料。趋势神经科学12（9）：333-335、340-331。
8. Porta-de-la-Riva, M.、Fontrodona, L.、Villanueva, A. 和 Ceron, J. (2012)。基本秀丽隐杆线虫方法：同步和观察。 J Vis Exp (64)：e4019。
9. 斯蒂尔纳格尔，T. (2006)。秀丽隐杆线虫的维护。蠕虫书。 1-11。 Doi：10.1895/wormbook.1.101.1。
10. Toth, ML, Melentijevic , I., Shah, L., Bhatia, A., Lu, K., Talwar, A., Naji , H., Ibanez - Ventoso , C., Ghose, P., Jevince , A.等。 _ （2012）。衰老的秀丽隐杆线虫神经系统中的神经突发芽和突触退化。神经科学杂志 32（26）：8778-8790 。
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12. Wormatlas.org（秀丽隐杆线虫中的DiI和DiO染色）。
13. Yankner , BA, Lu, T. 和Loerch , P. (2008)。大脑老化。 Annu Rev Pathol 3：41-66。