材料和试剂

蛋白质纯化
1. 15 mL Bior uptor TPX 管（ Diagenode ，目录号：NC1463349）
2. 10 kDa透析膜（Sigma-Aldrich，目录号：0530-100FT）
3. 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Sigma-Aldrich，目录号： 11411446001）
4. 溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
5. 磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
6. 聚（乙烯亚胺）（Sigma-Aldrich，目录号：P3143）
7. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
8. 磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
9. 磷酸二氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
10. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
11. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
12. HEPES（Affymetrix USB，目录号：16928）
13. 硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
14. 磷酸纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：C3145）
15. Trizma碱基或 Tris 碱基（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
16. NaOH（SDFCL，目录号：20252KO5）
17. HCl（ Qualigens ，目录号：Q29147）
18. Amicon Ultra-15 centricon10 kDa NMWCO（Millipore，目录号： UFC901008）
19. 牛血清白蛋白（BSA），分析标准（Millipore Sigma，目录号：P5619）
20. 裂解缓冲液（见配方）
21. 磷酸纤维素结合缓冲液（见配方）
22. 洗涤缓冲液 1（参见配方）
23. 洗涤缓冲液 2（参见配方）
24. 洗脱缓冲液（参见配方）
25. 存储缓冲区（见配方）

MST 实验
1. PCR板（ Axygen ，目录号：14-222-320）
2. 硫酸铁（II）铵（Sigma-Aldrich，目录号：09719）
3. 乙酰辅酶A （Sigma-Aldrich，目录号： A2056 ）
4. MonolithTM NT.115 系列，优质毛细管（NanoTemper Technologies GmbH，目录号：MO-K025–200 Count）
5. Monolith His-Tag 标记试剂盒 RED-Tris-NTA（NanoTemper Technologies GmbH，目录号：MO-L008）
6. MST 缓冲液（见配方）
7. 1 × PBS-T（见配方）

设备

1. 培养箱（New Brunswick Scientific Innova 4230）
2. Bioruptor® _ 超声仪（ Diagenode UCD 300）
3. 离心机（久保田 6500）
4. 超速离心机（贝克曼 L8-70M）
5. 磁力搅拌器（IKA 大鱿鱼）
6. 蠕动泵（Pharmacia LKB 泵 P-1）
7. 移液器（ Gilson TM PIPETMAN Classic TM移液器P2、20、200 和 1000）（Gilson，目录号：F144801、 F123600G、 F123601G和F123602G ）
8. Monolith NT.115 仪器（NanoTemper Technologies GmbH）

软件

1. Nanotemper Technologies 的MO.Control 2 ( https://nanotempertech.com/monolith-mo-control-software/ )
2. Nanotemper Technologies 的MO.Affinity Analysis 3 ( https://nanotempertech.com/monolith/monolith-nt115/ )
3. GraphPad Prism 5 版本 5.03 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )

程序

用于 MST 检测的带 His 标签的 Mom 的部分纯化
细胞提取物制备
注意：在 4°C 或冰上执行所有步骤。 SDS PAGE 分析的每个步骤中的等分样品（图 1）。
1. 重悬 2 g 细胞颗粒（大肠杆菌C41 表达妈妈，图 1，泳道1-2 ）（参见配方 1）。将 PMSF 添加到 1 mM 的最终浓度。
2. 预冷Diagenode 生物破坏者。将 2 mL 的细胞悬浮液分配到 6 个 15 mL TPX 管中，并在高功率设置下使用 20 个循环（30秒开，45 秒关）进行超声处理。
3. 4 ° C 和 100,000下离心 2 小时 × g在超速离心机中。离心后获得的上清液和沉淀分别称为 S100 上清液和 S100 沉淀（图 1，泳道3-4 ）。

图 1. 用于微量热泳 (MST) 的带 his 标签的野生型 (WT) 和突变型 Mom 蛋白的部分纯化。
His-tagged WT Mom（上图）、R101A Mom（中图）和 Y149A Mom（下图）在E.coli C41 pNC1细胞中过表达，部分纯化如下。对未诱导（泳道 1）和 IPTG 诱导（泳道 2）培养物的粗细胞提取物进行 100,000 × g超速离心，分析上清液（泳道 3）和沉淀部分（泳道 4）。使用 PEI 沉淀从 S100 上清液中去除核酸（泳道 5-6 ），并使用0-35 % 和35-65%的硫酸铵馏分（泳道 7-8 ）分离细胞蛋白。 His-tagged Mom 蛋白在纯化的各个阶段用红色箭头表示，纯化的非 his-tagged Mom 蛋白加载到泳道 9。进行缓冲液交换以从含有 Mom 的硫酸铵级分中去除硫酸铵 (35 – 65%，泳道 10)，并将透析部分加载到 PC 柱上。收集流穿部分（泳道 11），洗涤色谱柱以去除弱结合蛋白（泳道12-13 ）。用高盐缓冲液进行洗脱（泳道 14 – 16）。对于使用光密度法进行蛋白质定量，对 PC洗脱液进行透析和浓缩；将1 μ L、2 μ L、4 μ L、8 μ L 和 10 μ L（泳道 17 – 21）的浓缩蛋白与已知量（100、200、400 和 800 ng）的 BSA 标准品（泳道 22 – 25）和Genetix 3 彩色预染蛋白标记物（泳道 26）。在 15% SDS PAGE 凝胶上分析样品。

去除核酸
1. 将聚乙烯亚胺 (PEI) pH 7.4 逐滴添加到上述步骤的 S 1 00 上清液中，直至最终浓度为 1%，同时在磁力搅拌器上连续搅拌。
2. 20,000 × g离心所得悬浮液10 分钟，以沉淀 PEI-核酸复合物（图 1，泳道 6）。
3. 将上清液（称为 PEI 上清液，图 1，泳道 5）倒入新试管中。

细胞蛋白质的分馏
硫酸铵沉淀是一种用于分离细胞蛋白质的技术。它基于称为盐析的效应，其中在较高的盐浓度下，蛋白质溶解度通常会降低，从而导致沉淀（ Green and Hughes, 1995 ）。因为沉淀是由于溶解度降低而不是变性，所以沉淀的蛋白质可以很容易地使用标准缓冲液重新溶解。使用透析去除硫酸铵后，该蛋白质非常适合进一步的色谱分离或纯化程序。

1. 使用两个硫酸铵饱和度，0 – 35% 和 35 – 65% ( Wingfield, 2001 )分馏上述步骤中的PEI 上清液，如下所示。
2. 对于 0 – 35% 的饱和度，称取所需量的硫酸铵晶体，并慢慢地将其逐粒添加到 PEI 上清液中，同时在磁力搅拌器上不断搅拌，使盐完全溶解。
3. 出现沉淀后，将悬浮液在冰上孵育 10 分钟，然后在 4 ° C下以 20,000 × g离心 15 分钟。
4. 收集上清液并将其置于 35 – 65% 硫酸铵饱和度（如上）。硫酸铵沉淀后获得的颗粒（图 1，泳道 7-8 ）可以在 4 ° C的冰上过夜储存。

磷酸纤维素活化/平衡
1. 将 1 g 纤维素磷酸盐 P1 溶胀到3-4 mL 树脂中。用 25 体积的 MilliQ 水清洗大约 25 g 的磷酸纤维素粉末。
2. 对于所有洗涤步骤，通过在 1 L 烧杯中旋转树脂并使其静置 10 分钟，轻轻搅拌树脂，然后倒出液体。洗涤量是相对于处理过的磷酸纤维素的干重计算的，因此这里的体积是 25 × 25 = 625毫升。
3. 用 95% 和 50% 蒸馏乙醇各 10 卷洗涤树脂。
4. 随后，用 25 体积的 0.5 N NaOH 清洗树脂。
5. 之后，用 75 – 100 体积的 Milli Q 水清洗树脂，直到倾析出的液体的 pH 值小于 10。
6. 向树脂中加入 25 体积的 0.5 N HCl，搅拌均匀。让树脂在与步骤 4 完全相同的时间下沉降。
7. 接下来，用 75 体积的 MilliQ 水清洗树脂。

磷酸纤维素色谱
1. 的35-65% 硫酸铵颗粒重新悬浮在磷酸纤维素结合缓冲液中（参见配方 2 ），并针对 1 L 磷酸纤维素结合缓冲液进行透析，在 3 小时内更换两次透析缓冲液。
2. ° C下以 20,000 x g离心透析过的悬浮液10 分钟。
3. – 5.0 mL/min的流速将上清液（图 1，泳道 10）施加到 50 mL 预平衡的磷酸纤维素柱上。收集流出液（图 1，泳道 11）并将其装回色谱柱。再重复此步骤两次，以确保妈妈与树脂完全结合。
4. 用洗涤缓冲液 1 和 2 各 3 个柱体积洗涤树脂（参见配方 3 和 4）（图 1，泳道12-13 ）。
5. 用 0.5 柱体积的高盐洗脱缓冲液洗脱 Mom（参见配方 5）（图 1，泳道 14 – 16）。
6. 用储存缓冲液透析洗脱的蛋白质（参见配方 6）并使用Amicon Ultra-15 和 10 kDa MWCO 膜浓缩。
7. 分装浓缩蛋白，液氮速冻，-80 ℃保存。

蛋白质定量
使用 SDS-PAGE 光密度测定法对纯化的蛋白质进行定量。与 Bradford 测定等分光光度法不同，基于 SDS PAGE 的蛋白质定量具有在复杂的蛋白质混合物中定量特定目标蛋白质的优势，因此对于估计 MST 的蛋白质浓度更可靠。在水中制备的 2 mg/mL BSA 标准储备液进一步稀释至 10 ng/ μL 、20 ng/ μL 、40 ng/ μL和 80 ng/ μL ；将10 μL的每种稀释液加载到凝胶中（图 1，泳道 22 – 25），同时加入一系列体积增加两倍（ 1 μL 、2 μL 、4 μL 、8 μL、10 μL ）的测试样品（图 1，泳道 17 – 21）。通过比较特定目标带的密度与 BSA 标准的密度来估计测试样品中目标蛋白质的浓度。

MST 协议
用荧光染料标记蛋白质
此步骤的说明基于使用来自 NanoTemper Technologies 的 Red-Tris-NTA 染料和耗材。 Monolith NT His-tag Labeling Kit 有助于使用 NT647 荧光染料对少量 His-tagged 蛋白进行位点特异性、免纯化标记。该试剂盒可用于标记任何带有多组氨酸标签（至少6个组氨酸）的蛋白质或肽，并且可以在30分钟内完成标记。染料与 His 标签有效结合（亚纳摩尔亲和力），染料与 His 标签蛋白的近乎完全结合避免了进一步的纯化步骤或去除多余的染料。此外，His 标签的特异性使该方法能够很好地处理不纯或部分纯化的蛋白质制剂。使用 Tris-NTA 染料的另一种方法是用荧光标记（例如GFP）标记感兴趣的蛋白质，在这种情况下不需要进一步标记。请注意，染料（或标签）必须与安装在 Monolith 仪器中的过滤器兼容，并且染料或标签不应阻塞任何潜在的配体结合位点。
一些缓冲液成分——例如，咪唑、多组氨酸标记的配体、组氨酸、ATP、还原剂如 TCEP、DTT 和 2-巯基乙醇——可能会干扰标记反应，它们的浓度不应超过 Nanotemper 规定的限制（表格1）。
1. × PBS-T的小瓶中加入 8.0 mL 水以获得 1 × PBS-T（参见配方 8）
2. 250 pmol RED-Tris-NTA 染料悬浮在 50 μL的 PBS-T 中，以获得 5 μM染料溶液。
3. μL染料 (5 μM ) 和 98 μl 1 × PBS-T制备 100 nM 染料溶液。
4. μL的体积中将蛋白质浓度调整为 200 nM 。
注意：蛋白质浓度应使用考马斯蓝染色 SDS 凝胶上的带密度测定法估算，在定量细胞提取物或部分纯化的蛋白质制剂中感兴趣的蛋白质时尤其重要。
5. 将 100 μL的蛋白质 (200 nM ) 与 100 μL的染料 (100 nM) 混合。
6. 在室温下孵育 30 分钟。
7. × g下将样品离心 10 分钟。
注意：此步骤对于减少 MST 数据中的噪声至关重要。 MST 数据中的噪声可能来自蛋白质的沉淀或聚集。由于蛋白质的内在不稳定性或由于缺乏相互作用的伙伴、稳定剂或最佳缓冲条件（与天然细胞环境不同），可能会发生聚集。
8. 蛋白质被标记并准备好用于结合测定。

表 1. Tris-NTA 染料与常用缓冲液组分的兼容性（由 Nanotemper Technologies 推荐）。

* NanoTemper Technologies 建议一般避免使用带有红色染料的 TCEP。
**我们发现 7 mM β-巯基乙醇与我们的微量热泳 (MST) 分析兼容
*** Zn 2+ 、Co 2+和 Cu 2+离子竞争与 RED-tris-NTA 的结合。因此，仅允许使用低纳摩尔浓度的所列离子。

结合试验
在 PCR 管或板中制备配体的系列稀释液
1. 以 2 ×浓度制备 25 μL的配体（例如，对于 5 mM 的最终浓度，以 10 mM 的浓度制备配体）。
注意：结合反应中的最高配体浓度应至少为 20 × K d以覆盖饱和度以及结合曲线基线中的足够数据点。例如，测得的 Mom 对Fe 2+/3+的结合亲和力和乙酰辅酶 A 在 10 – 100 μm范围内，为了获得令人满意的结合曲线，在 MST 缓冲液中分别以 1 mM 和 10 mM 的浓度制备配体。在结合亲和力完全未知的情况下，可以根据假设的 K d值经验性地测试一些配体浓度范围。有关配体浓度范围估计，请参阅 NanoTemper Technologies Concentration Finder 工具。
2. 将 10 μL的 PBS - T 添加到 PCR 管 2-16 中。
3. 将 20 μL的配体转移到 PCR 管 1 中。
4. 将 10 μL的配体从 PCR 管 1 转移到 PCR 管 2，并通过上下移液多次混合。将 10 μL转移到 PCR 管 3 并混合。对 PCR 管 4 – 16 重复该过程。从 PCR 管 16 中丢弃额外的 10 μL 。
5. 将 10 μL标记的蛋白质添加到每个孔 (1 – 16) 中，并通过移液器混合。最终目标蛋白浓度为 50 nM。该浓度应用于计算K d值。在室温下孵育样品 5 分钟。
注意：在结合缓冲液中加入最终浓度为 7 mM 的 2-巯基乙醇可降低数据中的噪音。此外，使用优质涂层毛细管代替标准毛细管解决了蛋白质粘附在毛细管玻璃表面的问题。标记后以 15,000 × g旋转样品10 分钟也降低了数据噪声。
6. 加载毛细管并在 25°C 下使用 40% LED 功率和中等 MST 功率开始样品测量。对于每次测量，重复实验 3 次，并使用 NanoTemper MO 分析软件进行数据分析。
笔记：
a. 推荐设置为 40% LED 和中等 MST 功率。在 25 nM 的最终染料浓度下，在 Monolith NT.115 上，LED 40% 处的预期荧光强度约为 300 计数。
b. 标记蛋白的浓度应低于您预期的 K d 。标记的蛋白质可以稀释到 10 nM。在 LED 功率为 100% 的情况下，通常可以实现200 – 250 个计数的荧光强度。 Nanotemper Technologies 不建议使用 < 200 计数的荧光强度进行 MST 测量。

数据分析

1. MO 控制软件首先执行毛细管扫描，以确保浓度在检测限内，如果蛋白质粘附在毛细管壁上，毛细管扫描轨迹中的肩峰或双峰就证明了这一点，而不是平滑、对称的曲线 (图 2）。
注意：如果蛋白质粘附在毛细血管上，请通过添加去污剂或添加剂（例如 Tween-20、2-巯基乙醇、BSA）或改变缓冲液的 pH 值或离子强度、更换不同的缓冲液来优化结合条件，或使用优质涂层毛细管。对于所有的妈妈-配体相互作用测量，使用优质涂层毛细管，结合缓冲液包括最终浓度为 7 mM的 2-巯基乙醇。

图 2. 代表性实验的毛细管扫描、微尺度热泳 (MST) 迹线和剂量响应。
显示了使用 MO 控制软件运行的代表性 MST 实验的典型输出。典型的采集运行 10 分钟。

2. MO.Affinity Analysis 程序 ( NanoTemper )进行数据分析。三个重复被合并形成一个数据集。
3. 选择合适的绑定模型。 K d _ 模型适用于绝大多数调查的交互，而当调查的交互已知为合作时，希尔模型很有用。我们选择了K d模型，这是从质量作用定律导出的标准拟合模型。
4. 勾选“ TargetConc ”框以将荧光标记的浓度固定为 50 nM 或其他（如果稀释）。
5. 该程序将计算K d值和相关的置信度。在 68% 的置信度内， K d在给定范围内。这个数字越低，人们对给定的K d就越有信心。
6. MST 评估策略可以选择默认或手动来评估数据以及沿 MST 跟踪的默认或自定义时间点。
7. 检查结合曲线。大于 5 的信噪比是可取的，而大于 12 则表明检测效果很好。溶液中的游离染料可能会损害信噪比。如果标记前蛋白质的浓度被高估，则存在过量的染料。 Nanotemper Technologies 建议重新检查蛋白质浓度或将蛋白质与染料之间的比例提高到例如4:1。改变激光功率，为分析提供更好的信噪比，也会有所帮助。
8. 为了比较多个数据集，例如各种 Mom 突变体，基线校正的归一化荧光，通过在MO.Affinity分析程序中选择“Fraction bound”选项绘制每个数据集的幅度归一化。
9. 数据被导出到 GraphPad Prism 软件，并重新绘制曲线（图 3）。

2+/3+相互作用的微尺度热泳 (MST) 分析。
His-tagged 野生型 Mom (WT) 和突变体被荧光标记并针对指定浓度的配体乙酰 CoA (A)和 Fe 2+/3+进行滴定（乙）。绘制归一化荧光用于热泳分析。所示数据代表三个独立实验。误差线代表 n = 3 次测量的标准偏差（改编自 Karambelkar等人，2020）。

食谱

1. 裂解缓冲液
10 mM HEPES-NaOH pH 7.4
1 mM 2-巯基乙醇
1 M 氯化钠
1 毫米 PMSF
1毫克/毫升溶菌酶
2. 磷酸纤维素结合缓冲液
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
1 mM 2-巯基乙醇
400 毫米氯化钠
3. 洗涤缓冲液 1
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
1 mM 2-巯基乙醇
400 毫米氯化钠
4. 洗涤缓冲液 2
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
1 mM 2-巯基乙醇
600 毫米氯化钠
5. 洗脱缓冲液
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
1 mM 2-巯基乙醇
1.5 M 氯化钠
6. 存储缓冲区
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
1 mM 2-巯基乙醇
300 毫米氯化钠
7. MST 缓冲区
10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)
300 毫米氯化钠
7 mM 2-巯基乙醇
8. 1 × PBS-T（磷酸盐缓冲盐水-吐温）
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
10 毫米钠2 HPO 4
1.8 毫米 KH 2 PO 4
0.05% 吐温 20

致谢

献给 Stanley Hattman (1938-2020) 的记忆，他的开创性工作为噬菌体 Mu DNA 修饰领域的许多激动人心的发现奠定了基础。该协议详细报告了使用 MST 对噬菌体 Mu DNA 修饰蛋白 Mom 的生物分子相互作用进行样品制备和定量分析，并且源自我们之前发表的工作（ Karambelkar等人，2020 年）。这项工作由印度政府科学技术部、生物技术部向 VN 提供的各种赠款资助。 VN 是印度政府科技部的 JC Bose 研究员。 SK得到了印度科学与工业研究委员会的奖学金支持。我们感谢 Ujjwal Rathore 协助进行数据分析，并感谢 Nanotemper 技术的 Saji Menon 和 Sivaramaiah Nallapeta 为微尺度热泳技术提供技术援助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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