材料和试剂

两种协议通用
1. 1.5 mL微量离心管（Eppendorf，目录号：0030125150）
2. 铝箔
3. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1 × （ ThermoFisher Scientific， Gibco TM ，目录号：14190144）
4. 甲醛（w/v）16%，不含甲醇（ThermoFisher Scientific，Pierce，目录号：28908）
5. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
6. 牛血清白蛋白（BSA ；Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
7. 固定缓冲液（见配方）
8. 透化缓冲液（见配方）
9. 阻塞缓冲液（见配方）

一抗：
10. 小鼠抗E-钙粘蛋白（Biosciences，目录号：610182）
11. Rabbit Anti-FOXA2（Abcam，目录号：ab108422）
12. 一抗溶液（见配方）

二抗：
13. 驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 555（ThermoFisher Scientific，目录号：A31572）
14. 驴抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 488（ThermoFisher Scientific，目录号：A21202）
15. 二抗溶液（见配方）

荧光探针：
16. 核染色： Hoechst33342（Sigma-Aldrich，目录号：14533）
17. 细胞骨架染色：鬼笔环肽 CruzFluor TM 647缀合物（Santa Cruz，目录号：sc 363797）
18. 核染色溶液（见食谱）
19. 细胞骨架染色溶液（见食谱）

专用于嵌入矩阵的 3D 模型
1. 8 孔室，#1.5盖玻片（例如Cellvis ，目录号：C8-1.5HN； Ibidi ，目录号：80807；或Nunc TM Lab - Tek TM II， Thermo Fisher Scientific，目录号：155360）
2. 48孔培养板（例如，VWR ® ，目录号：10062-898）
3. Matrigel ®减少生长因子（GFR）基底膜基质，不含酚红，不含LDEV ，10 mL （Corning，目录号：356231）或其他合适的热响应水凝胶

对于子宫内膜类器官：
4. Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 混合物（DMEM/F12）与 L-谷氨酰胺、HEPES 和酚红（ Gibco TM ，目录号：11320032）
5. TrypLE express（ Gibco TM ，目录号：12604013）
6. Rock Inhibitor，Y-27632（ Tocris ，目录号：1254）
7. 重组人R-Spondin-1（RSPO-1）（ PreproTech ，目录号：120-38）
8. 重组人头蛋白（NOG）（ PreproTech ，目录号：120-10C）
9. B27补充剂（50 × ），减去维生素A（Life Technologies，目录号：12587010）
10. N-2 补充（100 × ）（Life Technologies，目录号： 17502048)
11. 胰岛素转铁蛋白硒（Life Technologies，目录号：41400045）
12. 青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140122）
13. 烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：73240-100G）
14. A83-01（Sigma-Aldrich，目录号：SML0788-5MG）
15. N-乙酰基-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7250-50G）EGF（R&D Systems，目录号：236-EG-01M）
16. 碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF ）（R&D Systems，目录号：233-FB-025）
17. 成纤维细胞生长因子10（FGF-10）（ PreproTech ，目录号：100-26）
18. P38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂，SB 202190（Sigma-Aldrich，目录号：S7067-5MG）
19. β雌二醇（Sigma-Aldrich，目录号：E8750-100MG）
20. 类器官培养基（用于子宫内膜类器官）（参见食谱）
21. 类器官解离溶液（见配方）

专用于无矩阵 3D 模型
1. Grace Bio-Labs CoverWell TM灌注室，室直径。 × 厚度：9 mm × 1.7 mm（Grace Bio-Labs，由 Sigma-Aldrich，Merck 分销，目录号：GBL622205）
2. 培养板（例如，6孔Sarstedt ®细胞培养板，目录号：83.3920.500）
3. 玻璃盖玻片# 1.5，24 × 50 mm（例如， ThorLabs ，目录号：CG15KH）
4. 透明胶带
5. 用于3D细胞培养的BIOFLOATTM FLEX涂层溶液（ faCelitate ，目录号：F202005）
6. 胰蛋白酶/EDTA 溶液（ ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：1 5400054）
7. 3D Petri Dish ®微型模具（ MicroTissues , Inc.，目录号：12-256）
8. 超纯琼脂糖粉末（ ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号： 16500100）
9. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
10. 琼脂糖溶液（见配方）

对于 A549 球体
1. T25 培养瓶（例如，Sigma-Aldrich，Corning® ，目录号： CLS430639 ）
2. Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）（ Gibco TM ，目录号：31053028）
3. （ Gibco TM ，目录号：11533387）
4. Glutamax （ Gibco TM ，目录号：35050061）
5. 培养基（用于 A549 细胞）（参见食谱）

设备

1. 加湿 CO 2培养箱 ( ThermoFisher Scientific)
2. 冰箱和冰柜（4°C 和 -20°C）
3. 台式离心机（ThermoFisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-006-901）
4. 微量移液器
5. Leica TCS SP8 潜水显微镜（Leica microsystems）或其他带多光子激发的共聚焦显微镜装置
6. 无菌流动柜

软件

1. 徕卡应用套件（LAS X、徕卡微系统）
2. LAS X 3D 查看器或其他图像分析工具，例如 Fiji/ImageJ (Schindelin et al. , 2012)

程序

矩阵嵌入 3D 模型的样品准备

A. 准备嵌入矩阵的 3D 模型（例如，类器官）
要点
1. 在该协议中，以在 Matrigel 中培养和嵌入的子宫内膜类器官（来自患者活检）为例。然而，以下协议可应用于嵌入在20 至 30 °C之间凝胶化的热响应水凝胶中的任何细胞模型。如果使用其他类器官，类器官培养基的配方会有所不同。如Vankelecom先前所述，进行子宫内膜类器官培养等。（Boretto等人，2019 年）。
2. 成像样品的制备从已经成熟的类器官或单细胞开始（在类器官通过期间）。
3. 使用前将 Matrigel 置于冰上至少 2 小时。
4. 在整个协议期间，尊重指示的温度很重要。
5. 此程序应在无菌流动柜下进行。
6. × g下进行 5 分钟。
7. 当有机体立即在玻璃底基板上生长，适合荧光成像时，可以跳过最后一部分（有机体转移到玻璃底培养皿）。

分步协议
类器官解离成单细胞
1. 从带有基质嵌入有机体的井中取出有机体介质。
2. 添加 400 μL的冰冷 DMEM/F12 并多次上下移液，以从 Matrigel 中释放有机体。
3. 将溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并将其放在冰上。
4. 用 400 μL的冰冷 DMEM/F12 清洗水井一次，以收集剩余的有机体。
5. 将溶液转移到另一个 1.5 mL微量离心管中，并将其放在冰上。
6. 在 4°C 下离心并弃去上清液。
7. 将 500 µL 预热 (37°C) 的有机体解离溶液（参见配方 2）添加到每个含有有机体颗粒的 1.5 mL 微量离心管中。
8. 通过上下移液多次混合。
9. 在 37°C 水浴中孵育 5 分钟。
10. 添加 500 μL 的冰冷 DMEM/F12 以灭活TrypLE Express。
11. 在 4°C 下离心并弃去上清液。
12. 在 700 μL 的冰冷 DMEM/F12 中重新悬浮颗粒。
13. 将 P200 吸头（无过滤器）放在 P1000 吸头（带过滤器）上，上下移液25-30次，以机械地将类器官分离成单个细胞。
14. 在 4°C 下离心并丢弃上清液，直到约 30 μL (30%) 的解离有机体/DMEM/F12 留在 1.5 mL 管中。 30 μL的体积可以通过将其与另一个 1.5 mL 管与 30 μL水进行比较来测量。
15. μL (70%) 的冰冷 Matrigel重新悬浮 30 μL (30%) 的颗粒。
注意：有机体颗粒和添加的基质胶的体积应始终调整为 30%/70% 的比例。

类器官播种
16. 在预热的 48 孔培养板或 8 孔玻璃底皿中分配 25 μL 液滴。
17. 在 37°C的加湿 CO 2培养箱中倒置培养板/培养皿20 30 分钟。

类器官生长
18. 在 37°C 水浴中预热类器官培养基。
19. 在每口井中加入 250 μL 的预热有机体培养基。
20. 在 37°C 的 5% CO 2培养箱中保持培养，直到类器官达到所需的大小或形态。
注意：培养基应每 2 至 3 天刷新一次。

类器官转移至玻璃底培养皿（仅当类器官在 48 孔培养板中生长时）
21. 从包含要成像的有机体的井（48 井培养板）中取出培养基。
22. 添加 400 μL的冰冷 DMEM/F12 并多次上下移液，以从 Matrigel 中释放有机体。
23. 离心并去除上清液，直到约 30 μL （30%）的有机体/DMEM/F12 留在 1.5 mL 管中。 30 μL的体积可以通过与另一个 1.5 mL 管与 30 μL水进行比较来测量。
24. μL (70%) 的冰冷 Matrigel重新悬浮 30 μL (30%) 的颗粒。
注意：有机体颗粒和添加的基质胶的体积应始终调整为30%/70% 的比例。
25. 在 8 孔玻璃底盘的孔中间分配 25 μL的液滴。
注意：可以使用其他玻璃底菜。
26. 的CO 2培养箱中将玻璃底培养皿倒置20-30 分钟。
27. 添加 250 μL预热的 DPBS (1×)。
注意：添加和移除溶液时务必将移液器尖端放在孔的一角，以避免接触 Matrigel 液滴（图 1），这一点很重要。

图 1. Matrigel 中类器官的处理。
(A) 将固体基质胶中的有机体液滴 (25 μL ) 添加到每个孔的中心。 (B) 将移液器尖端放在井的角落，小心地添加或检索解决方案。

B. 固定和透化
要点
1. 固定和透化缓冲液都应在 37°C 下预热。
2. 当有机体立即在玻璃底基板上生长时，小心地取出有机体培养基并用 250 μL预热的 DPBS（1×）洗涤3次。

分步协议
1. 丢弃 DPBS 溶液。
2. 加入 250 μL的预热固定缓冲液。
3. 2培养箱中在 37°C 下孵育 1 小时。
4. 用预热的 DPBS (1×) 清洗固定的类器官 3 次并丢弃溶液。
5. 将 250 μL预热的透化缓冲液添加到 Matrigel 嵌入的类器官中，并在 3°C 下孵育 30 分钟。
6. μL的预热 DPBS (1×)清洗 Matrigel 嵌入的有机物三次。

C. 免疫荧光染色
要点
1. 在整个协议期间，尊重溶液的指示温度非常重要。将溶液预热至 37°C。
2. 在这里，使用 FOXA2 和 E-钙粘蛋白抗体进行联合免疫荧光染色（参见配方 7）。然而，该协议很容易适应其他抗体。
3. 当使用小有机分子进行染色时，直接进入 D 部分。
4. 通过用铝箔覆盖样品，将样品保存在黑暗中。

分步协议
1. 丢弃 DPBS 溶液。
2. 将 250 μL的预热阻塞缓冲液添加到 Matrigel 嵌入式有机体中（参见配方 6）。
3. 用封闭缓冲液在 37°C 孵育 2 小时。
4. 移除阻塞缓冲液。
5. 添加 250 μL的一抗溶液（参见配方 7）。
6. 在室温下与一抗孵育过夜。
7. 去除一抗溶液。
8. 用预热的 DPBS (1×) 洗涤 3 次并丢弃溶液。
9. 添加 250 μL的二抗溶液（参见配方 8）。
10. 在室温 (22 – 25°C) 下避光孵育 2 小时。
11. 添加 250 µL 预热的 DPBS (1×) 并在 37°C 下孵育 10 分钟。
12. 删除解决方案。
13. 重复步骤 11) 和 12) 两次。
14. 添加 250 µL 预热的 DPBS 并将样品储存在 37°C 直到下一次染色或成像。

D. 有机小分子荧光染色
要点
1. 在这里，分别使用 Phalloidin CruzFluor647 和 Hoechst33342 对细胞骨架和细胞核进行染色。连续进行与两个荧光团的孵育，以获得最佳的荧光染色。
2. 通过用铝箔覆盖样品，将样品保存在黑暗中。

分步协议
1. 丢弃 DPBS 溶液。
2. 添加 250 μL的预热核染色溶液（参见配方 9）。
3. 将样品在 37°C 下孵育 4 小时。
4. 添加 250 µL 预热的 DPBS (1×) 并在 37°C 下孵育 10 分钟。
5. 丢弃解决方案。
6. 重复步骤 4) 和 5) 两次。
7. 添加 250 μL的预热细胞骨架染色溶液（参见配方 10）。
8. 在室温 (22 – 25°C) 下，在黑暗中将类器官与细胞骨架染色溶液一起孵育过夜。
9. 添加 250 µL 预热的 DPBS (1×) 并在 37°C 下孵育 10 分钟。
10. 丢弃解决方案。
11. 重复步骤 9) 和 10) 两次。
12. 添加 250 µL 预热的 DPBS 并将样品储存在 37°C 直到下一次染色或成像。

无矩阵 3D 模型的样品制备

A. 制备无基质 3D 模型（例如，球体）
要点
1. 本协议中使用的细胞在 T25 细胞培养瓶中生长，并在协议开始时汇合。我们使用 A549 细胞，但可以使用任何其他贴壁细胞系。
2. 在这里，我们使用胰蛋白酶/EDTA 溶液，但可以使用任何其他方法来重新悬浮细胞。
3. 虽然在本协议中，球体是通过液体覆盖法制备的（使用 3D Petri Dishes ®微模具，参见材料），但也可以使用其他球体制备方法。
4. 此处描述的用于制备球体的程序改编自微组织供应商 ( MicroTissues Inc., https://www.microtissues.com/protocols ）。
5. 此程序应在无菌流动柜下进行。

分步协议
琼脂糖微组织的铸造
1. MilliQ水冲洗 3D Petri Dishes ®微型模具。
2. 将微型模具置于紫外线下 20 分钟进行灭菌。
3. DPBS (1 × )冲洗微型模具，然后除去所有 DPBS (1 × )。
4. 在 900 W 下微波琼脂糖，每 10 秒旋转一次，直到溶液完全变成液体（参见配方 11）。
5. 在微模具中加入 500 μL的琼脂糖溶液（图 2A）。
6. 让琼脂糖凝固 20 分钟。
7. 琼脂糖凝固后，小心弯曲微模具以去除形成的琼脂糖微组织。不要弯曲太多以避免琼脂糖微组织破裂。无菌移液器吸头可用于帮助去除微组织（图 2B）。
8. 将微组织转移到培养皿中（例如， 6 孔培养板，图 2C）。

图 2.琼脂糖微组织的制备。
(A) 添加 500 μL 将液体琼脂糖倒入微型模具中。 (B) 凝固后，小心地从微模具中取出琼脂糖微组织（可以使用尖端）。 (C) 将微组织转移到细胞培养皿中。

琼脂糖微组织的平衡
9. 将琼脂糖微组织完全浸没在培养基中（参见配方 3）。
10. 在培养基中孵育微组织 15 分钟。
11. 取出培养基。
12. 再重复步骤 10) 到 11) 两次。

重悬细胞
13. 从 T25 细胞培养瓶中取出培养基。
14. mL DPBS (1 × )清洗贴壁细胞 3 次，弃去溶液。
15. 添加 50 µL 胰蛋白酶/EDTA 溶液和 450 µL DPBS (1 × )。
16. 在加湿的 CO 2培养箱中在 37 ° C 下孵育 5 分钟。
17. 添加 3.5 mL 培养基以灭活胰蛋白酶/EDTA，并多次上下移液以重新悬浮细胞。
18. 计数细胞。

琼脂糖微组织的播种
19. 去除微组织内部和周围的所有介质。
20. 190 μL具有适当细胞浓度的细胞悬液以逐滴方式滴入微组织内（这里，每个微组织播种 500,000 个细胞以获得直径约为 250 μm的球体）。
注意：使用的细胞数量将取决于细胞类型和所需的球体直径。
21. 让细胞沉入微组织的孔中 10 分钟。
22. 在微组织周围添加培养基。
23. 在 37°C 的 5% CO 2加湿培养箱中保持培养，直到球体达到所需的大小或形态。
注意：培养基应每 2 至 3 天更新一次；孵育时间取决于细胞类型。

球体收获（一旦球体达到所需的形态）
24. 去除微组织周围和内部的介质。
25. 大力吸取 1 mL DPBS (1 × ) 以从孔中释放球体。重复此多次（直到所有球体都从井中释放）。
26. 将含有球体的溶液转移到 1.5 mL 微离心管中。

B. 固定和透化
要点
1. × g下进行 5 秒。
2. 在孵育步骤中，微量离心管应水平放置在摇动板上。通过这种方式，球体将下沉的区域增加，从而使球体的密度降低（分布更广），从而避免不完全固定或透化。如果没有振动板，将 1.5 mL 微量离心管水平放置在工作台上（或冰箱中）。

分步协议
1. 离心收获的球体并丢弃上清液。
2. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以重新悬浮球体。
3. 离心并弃去上清液。
4. 重复步骤2) 和 3) 两次。
5. 添加 500 μL的固定缓冲液（参见配方 4），轻弹 1.5 mL 微量离心管轻轻混合。
6. 在室温下孵育 20 分钟。
7. 离心并丢弃上清液（固定缓冲液）。
8. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
9. 离心并弃去上清液。
10. 再重复步骤 8) 和 9) 两次。
11. 添加 500 μL的透化缓冲液（参见配方 5）并通过轻弹 1.5 mL 微量离心管轻轻混合。
12. 在室温下孵育 20 分钟。
13. 离心并去除上清液（透化缓冲液）。
14. 添加 1 mL DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
15. 离心并弃去上清液。
16. 再重复步骤 14) 和 15) 两次。

C. 免疫荧光染色
要点
1. 在孵育步骤中，微量离心管应水平放置在摇动板上。这样，球体将下沉的区域增加，从而使球体的密度降低（分布更广），因此可以实现更好的染色。如果没有可用的振动板，请将 1.5 mL 微量离心管水平放置在工作台上（或冰箱中）。
2. 当使用小有机分子进行染色时，直接进入 D 部分。
3. 通过用铝箔覆盖样品，将样品保存在黑暗中。
4. × g下进行 5 秒。

分步协议
1. 将 200 μL的阻塞缓冲液（参见配方 6）添加到球体颗粒中，并通过轻弹 1.5 mL 微量离心管轻轻混合。
2. 在室温下孵育 2 小时。
3. 离心并丢弃上清液（封闭缓冲液）。
4. 加入 200 μL的一抗溶液（参见配方 7）。
5. 在 4°C 下孵育过夜。
6. 离心并去除上清液（一抗溶液）。
7. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
8. 离心并弃去上清液。
9. 再重复步骤 7) 和 8) 两次。
10. 添加 200 μL 的二级抗体溶液（参见配方 8）。
11. 在室温下在黑暗中孵育 2 小时。
12. 离心并丢弃上清液（二抗溶液）。
13. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
14. 离心并弃去上清液。
15. 再重复步骤 13) 和 14) 两次。
16. 可选：如果不进行其他染色，加入 100 µL DPBS (1 × )，轻弹试管轻轻混匀。

D. 使用有机小分子的荧光染色
要点
1. 在孵育步骤中，微量离心管应水平放置在摇动板上。这样，球体将下沉的区域增加，从而使球体的密度降低（分布更广），因此可以实现更好的染色。如果没有可用的振动板，请将 1.5 mL 微量离心管水平放置在工作台上（或冰箱中）。
2. 在这里，分别使用 Phalloidin CruzFluor647 和 Hoechst33342 对细胞骨架和细胞核进行染色。连续进行两个荧光团的孵育以获得最佳的荧光染色。
3. 通过用铝箔覆盖样品，使样品保持在黑暗中。
4. 所有离心步骤均以 2,000 × g的速度重新执行 5 秒。

分步协议
1. 添加 200 μL的核染色溶液（参见配方 9）。
2. 在室温下孵育 4 小时，在黑暗中用铝箔覆盖。
3. 离心并丢弃上清液（核染色溶液）。
4. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
5. 离心并弃去上清液。
6. 再重复步骤 4) 和 5) 两次。
7. 添加 200 μL的细胞骨架染色溶液（参见配方 10）。
8. 在黑暗中在室温下孵育过夜。
9. 离心并丢弃上清液（细胞骨架染色溶液）。
10. 添加 1 mL 的 DPBS (1 × ) 并通过轻弹管轻轻混合以清洗球体。
11. 离心并弃去上清液。
12. 再重复步骤 10) 和 11) 两次。
13. 加入 100 µL DPBS (1 × )，轻弹试管轻轻混匀。

E. 安装染色球体
要点
1. 在这里，我们使用了 24 × 50 mm #1.5 玻璃盖玻片，但也可以使用其他格式。
2. 球体很容易粘在移液器吸头上。如果这是一个问题，在将球体转移到灌注室之前，将 200 μL的BIOFLOATTM FLEX涂层溶液吸入 P200 移液器中，将其留在移液器尖端 10 秒并丢弃。使用此移液器尖端将含有球体的溶液转移到灌注室中。
注意：或者，冰冷的 1% BSA 的 DPBS (1 × ) 溶液可用于涂覆尖端。

分步协议
1. 将CoverWell灌注室粘在玻璃盖玻片上。
2. 取 50 μL染色球体，将必要的体积移入灌注室直至充满；剩余的球体可以再次转移到 1.5 mL 微量离心管（图 3A）。
3. 用透明透明胶带盖住灌注室的两个开口，以避免在成像过程中样品蒸发（图 3B）。

图 3. 安装球体样品进行成像。
(A) 取 50 μL的染色球体，将必要的体积移入灌注室，直至充满。 (B) 用透明透明胶带盖住灌注室的两个开口，以防止样品蒸发。

第 III 部分：嵌入矩阵和无矩阵 3D 模型的成像

A. 数据采集和 3D 重建
要点
1. Leica TCS SP8 潜水显微镜用于对第 I 部分和第 II 部分中制备的样品进行可视化，配备了多光子 Insight X3 激光器（范围 680 – 1,300 nm）、FLUOTAR VISIR 25 ×水物镜（NA 0.95），一个 HC PL IRAPO 40 ×水目标 (NA 1.1) 和两个HyD混合探测器。
2. 为了捕获完整的球体/类器官，用于成像 3D 细胞模型的物镜需要具有较长的工作距离 (WD)，最好大于 0.6 毫米。使用的 FLUOTAR VISIR 25 ×物镜的 WD 为 2.4 mm，因此可用于较大的球体/类器官直径，而 HC PL IRAPO 40 ×物镜的 WD 为 0.65 mm，可用于较小的球体/类器官。
3. 在这里，双光子激发用于可视化球体/有机体。双光子激发需要两个比发射光波长更长的光子同时激发。这种较长的波长（通常是近红外）较少被细胞隔室散射，从而增强了光的穿透性。标准的单光子激发也可用于使样品可视化，但这意味着进入球体/有机体的光穿透减少，从而导致荧光信号减少。
4. 在实时模式（快速扫描）下，扫描速度设置为 600 Hz，图像格式设置为 512 × 512 像素。在数据采集期间，速度设置为 400 Hz，图像格式设置为 1,024 × 1,024 像素格式，以提高图像质量。
5. 获取 z 堆栈的步长通常设置为 1 μm 。
6. 在该协议中，使用 LASX 3D 查看器进行图像重建。但是，也可以使用其他图像分析程序，例如 ImageJ 或 Fiji。
7. 通常，当向上移动 z 位置时，光的穿透力（即荧光信号）会降低。通过使用 z 补偿工具（包含在 LASX 软件中）可以减少这种影响。使用此工具，激发光的功率和/或激发增益可以在 z 堆栈期间以线性方式增加（针对每个xy平面进行调整）。

分步协议
1. 启动显微镜后，将样品放在显微镜的样品固定台上。
2. 根据用于染色样品的荧光染料调整显微镜参数（表 1）。当在一个样品中使用多种染料时，会进行顺序扫描。在这里，我们在堆栈之间进行了顺序扫描；因此，获取第 1 个通道的完整堆栈，接下来，获取第 2 个通道的完整堆栈。

表 1.用于荧光染色的激发波长和检测器参数。

3. 使用透射光通过目镜将球体或有机体聚焦。
4. 使用样品台将球体/有机体置于视场中心。
5. 启动实时模式以检查球体/有机体中的荧光信号。

Z 堆栈采集
6. 将 z 位置一直移动到球体/有机体的底部。
7. 将此位置定义为堆栈的开头。
8. 将 z 位置移动到球体/有机体的顶部。
9. 将此位置定义为堆栈的结束位置。
10. 开始获取堆栈。

堆栈重建
11. 在 LASX 3D 查看器软件中打开堆栈。
12. 根据需要为每个通道调整颜色、亮度、对比度和伽玛。
13. 通过选中“黑色”而不是“灰色”框将背景设置为黑色。
14. 可选：通过按住并拖动鼠标左键，根据需要更改球体/有机体的方向。
15. 可选：使用剪切工具，可以将球体/有机体切割成平面。可以切割零件以更好地观察球体/有机体内部（图4-6 ）。
16. 通过选中“比例尺”和“画框”框，将比例尺和方向插图添加到 3D 重建。

图 4. 用抗 E-Cadherin 和 FOXA2 抗体染色的子宫内膜类器官堆叠的 3D 重建。
(A) FOXA2 (青色) 和 E-钙粘蛋白 (红色) 在子宫内膜类器官中的免疫荧光;显示堆栈中不同位置的不同帧。 (B) 完整 z 堆栈的 3D 重建。 (C) 3D 视图，下半部分被剪裁，露出有机体的内部。

图 5. 带有标记的细胞核和肌动蛋白丝的子宫内膜类器官堆栈的 3D 重建。
(A) 用 Hoechst（细胞核，绿色）和 Phalloidin647（细胞骨架，洋红色）染色，显示堆栈中不同位置的不同帧。 (B) 完整 z堆栈的 3D 重建。 (C) 3D 视图，下半部分被剪裁，露出有机体的内部。

图 6。用标记的肌动蛋白丝染色的球体堆栈的 3D 重建。
(A)堆栈不同位置的不同部分。 (B) 完整 z 堆栈的 3D 重建。 (C) 3D 视图，下半部分被剪裁，露出球体的内部。

故障排除

表 2. 故障排除
问题潜在原因解决方案
球体的损失 1. 在离心循环期间球体未完全沉淀
2. 球体粘在移液管尖端 1. 用 BIOFLOATTM FLEX 涂层溶液或冰冷的 1% BSA DPBS 预涂层尖端
基质胶倒塌 1. 溶液未预热至 37°C 1. 将所有溶液放在温水浴中至少 20 分钟
球体在协议期间解体/分崩离析 1. 收获时球体未完全形成
2. 离心过快
3. 洗涤步骤中的严重混合 1. 在收获球体之前，在光学显微镜下检查是否形成了密集的连贯球体。
2. 当球体容易解体时（较弱的细胞-细胞相互作用，而不是离心来沉淀球体，将它们留在微量离心管中，直到它们沉到底部。
3. 不要吸管进入球体溶液，而是通过轻弹管来混合球体。
球体/类器官中间没有荧光信号 1. 抗体/染料未渗入类器官/球体核心
2. 球体/类器官核心坏死。
3. 激发光不能穿透球体/有机体的中间。 1. 延长透化和/或抗体孵育时间。
2. 避免在收获前不更换培养基的情况下使球体生长时间过长。
3. 使用红色/远红色染料，因为这些染料的激发光可以更好地渗透到较大的样品中

食谱

1. 类器官培养基（用于子宫内膜类器官）
DMEM/F12（含 L-谷氨酰胺和 HEPES），辅以 10% (v/v) RSPO1、10% (v/v) NOG)、 2% (v/v) B27、1% (v/v) N2 , 1% (v/v) Glutamax , 1% (v/v) 胰岛素转铁蛋白硒, 1% (v/v)青霉素/链霉素 , 2 mM 烟酰胺, 0.5 µM A83-01, 1.25 mM N-乙酰 L-半胱氨酸, 50 ng/mL EGF 50 ng/mL, 2 ng/mL bFGF , 10 ng/mL FGF-10, 10 µM SB202190, 1 nM β 雌二醇和 10 µM Rock Inhibitor (Y-27632b)
2. 类器官解离液
TrypLE Express 与 10 μM岩石抑制剂 (Y-27632b)
3. 培养基（用于 A549 细胞）
含有 10% (v/v) 胎牛血清、5% (v/v) Glutamax和 0.1% (v/v) 庆大霉素的 DMEM
4. 固定缓冲液
DPBS 中的 4% 甲醛 (1 × )
5. 透化缓冲液
DPBS 中的 0.1% Triton X-100 (1 × )
6. 阻塞缓冲区
DPBS 中 3% BSA (1 × )
7. 一抗溶液
的小鼠抗 E-钙粘蛋白 (1:200, 1.25 μg /mL) 和兔抗 FOXA2 (1:150, 13.5 μg /mL)（DPBS 中的 3% BSA 1 × ）
8. 二抗溶液
的抗兔 IgG AF555 (1:500, 4 μg /mL) 和抗小鼠 IgG AF488 (1:500, 4 μg /mL)（DPBS 中的 3% BSA 1 × ）
9. 核染色液
Hoechst 33342 (1:1 , 000, 5 μ g/mL) 在 DPBS 中 1 ×
10. 细胞骨架染色液
封闭缓冲液中的鬼笔环肽 CruzFluor647（1:1,000 的 DMSO 原液）（DPBS 中的 3% BSA 1 × ）
11. 琼脂糖溶液
2% (w/v) 超纯琼脂糖粉末溶解在 Milli-Q 水中的 0.9% (w/v) NaCl 中。使用前高压灭菌。

致谢

这项工作得到了研究基金会——法兰德斯（FWO，项目 G0A5817N、G0D4519N、1529418N、G081916N 和 G094717N）、KU Leuven（C14/16/053、C14/18/061 和KA/20/026）的支持。 IVZ、NM和 BF 承认 FWO 对他们的博士学位的支持。和博士后奖学金，分别为（11F5419N、11A1120N 和 12X1419N）。球体制备方案改编自微组织供应商 (Microtissues, Inc.) 提供的方案。

利益争夺

没有相互竞争的利益。

伦理

在知情的书面同意后，从因良性妇科疾病接受腹腔镜检查的患者获得子宫内膜活检。该研究得到了伦理委员会研究 UZ/KU Leuven (S59006; S59177) 的批准。

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