材料和试剂

1. 0.22 微米_ 过滤器（Millipore，目录号： SLGPR33RB ）
2. 75 cm 2烧瓶（Corning，目录号：430641）
3. 15 mL管（Falcon，目录号：352095）
4. 12毫米直径的圆形盖玻片（ Marienfeld ，目录号：MAR0111520）
5. 载玻片（Premiere，目录号：9308W ）
6. 24孔板（Costar，目录号：3524）
7. 15厘米培养皿（Corning，目录号：430599）
8. 滤纸（ GE，目录号：10311611 ）
9. 封口膜（Bemis，目录号：PM-996）
10. Milli-Q 水
11. 纤连蛋白（1 mg / mL）（ Sigma-Aldrich，目录号：FC010），储存在4 °C
12. LS003126 ），4°C 储存
13. DMEM（ ThermoFisher Scientific ， Gibco TM ，目录号： 12430054），储存于 4°C
14. Primocin (50 mg/mL) ( InvivoGen , ant-pm-2)，储存于-20°C
15. 胎牛血清（ Ausbian ，VS500T），- 20°C储存
16. 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（ Sigma-Aldrich ，目录号：P1399 ），将粉末储存在-20°C 。
μm过滤器对储备溶液（Milli-Q 水中的 100 mg/mL 聚-L-赖氨酸）进行灭菌，并将其分装在 -20°C 下储存。
17. Trition X-100 （ Sangon Biotech ，目录号：A110694 ）
18. Tween 20（ Sangon Biotech，目录号：A100777）
19. 多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148），将粉末储存在4 °C
20. 牛血清白蛋白（BSA）（ Sigm a-Aldrich，目录号：A3912 ），将粉末储存在4°C
21. 小鼠抗乙酰化微管蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T6793），4°C保存
22. 兔抗 Cep290（自制）（Zhao et al. ，2021），- 20°C保存
23. 豚鼠抗Odf2（自制）（Zhao et al. , 2019），-20°C 保存
24. ThermoFisher Scientific，目录号：A-21202 ）缀合的驴抗小鼠IgG ，-80°C长期储存，4°C短期储存
25. 与Cy3缀合的驴抗兔Ig G（ Jackson ImmunoResearch ，目录号： 711-165-152 ），-80°C长期储存，4°C短期储存
26. ImmunoResearch ，目录号：706-605-148）缀合的驴抗豚鼠IgG ，-80°C长期储存，4°C短期储存
27. ProLong Diamond Antifade Mountant （ ThermoFisher Scientific，目录号：P36970），4°C储存
28. 浸油（Le cia microsystem，目录号：12847995 ）
29. PBS （见食谱），储存在 4°C
30. D issection 缓冲液（参见配方）， 4°C储存
31. 酶消化缓冲液（见食谱），新鲜制备
32. mEPC培养基（见配方），4°C 储存
33. 饥饿培养基（见食谱），储存在 4°C
34. 脱纤缓冲液（见配方），储存在 4°C
35. 4% PFA （见食谱）
36. TBST (10 × ) （见食谱）
37. 封闭缓冲液（参见配方），分装于 -20°C 储存

设备

1. Milli-Q（Millipore，型号：Advantage A10）
2. 锋利的镊子（ Dumont，目录号： 0208-5/45-PO）
3. 镊子（Dumont，目录号：0203-5/15-PO）
4. 卧式振动筛（智初，型号： ZQZY -AS9 ）
5. 高速离心机（ ThermoFisher Scientific，型号： Sorvall LYNX 6000，目录号：75006590）
6. S翼桶转子（ ThermoFisher Scientific，型号： BIOFlex TM HC ，目录号： 75003000 ）
7. 共聚焦显微镜（徕卡，型号：TCS SP8 WLL 系统，配备 63×/1.4 油浸物镜）

程序

A. 睫状轴净化前的准备工作
1. 75 cm 2中培养和维持小鼠室管膜细胞 ( mEPCs ) 烧瓶（郝等人，2021 ）。
a. 添加 6 mL纤连蛋白（ PBS 中10 μg / mL ）至75 cm 2 培养瓶，在培养前一天在 37°C 孵育 24 小时以包被培养瓶。
b. 在冰冷的解剖缓冲液中解剖五只 C57BL/6 小鼠幼崽的端脑，并用锋利的镊子去除海马、小脑、脉络丛、嗅球和脑膜。
c. 将解剖的端脑转移到 15 mL 管中，用 10 mL 新鲜制备的酶消化缓冲液在 37°C 下消化 30 分钟。
d. 用 5 mL 移液器吹打 10 次，小心分离细胞，然后在 400 ×克在室温5分钟。
e. mEPC培养基重悬细胞，并将它们播种到75 厘米2纤连蛋白涂层烧瓶中。
f. 播种后一天摇晃并去除神经元。
g. 当细胞汇合时，用 PBS 冲洗细胞，并加入10 mL 饥饿培养基以诱导分化。
h. 在饥饿培养基中培养十天后收获细胞。
注意：在血清饥饿的第 10 天收获时，多纤毛细胞的比例应约为 50%（图 1）。

图 1. 原代培养的小鼠室管膜细胞。
乙酰化微管蛋白 ( Ac-tub) 修饰纤毛轴丝。 Zo-1 和 DAPI 分别标记紧密连接和细胞核。比例尺，25 μ m 。

2. 在睫状轴纯化前一天用聚-L-赖氨酸涂上盖玻片。
a. 将 12 个灭菌盖玻片放入 24 孔板中，每孔一个盖玻片。
b. 冲洗盖玻片3 次，用500 每孔微升PBS 。
c. 加入 500 μL聚-L-赖氨酸(100 ng / μL ) 加入每孔， 37°C 孵育 24 h 。

B. 睫状轴净化
1. 清洗mEPC 两次用 6 mL 冰冷的 PBS，两次用 6 mL 冰冷的脱纤缓冲液快速。
2. 在烧瓶中，加入 9 m L 的含有 0.01% Triton X-100 的冰冷deciliation 缓冲液。
3. 将烧瓶固定在带有粘性绿色橡胶底座的水平振动筛上（图 2）。

图 2. 水平振动筛上粘附烧瓶的代表性图像。

4. 立即在 3 00 rpm 和 37°C 下摇动15 分钟，以从过渡区底部分离纤毛（视频 1）。

视频1.使用剪切力净化睫状轴。

5. 纤毛干的上清液转移到15 mL试管中。
6. 在摆动斗式转子中水平离心机（ BIOFlex TM HC)在600 × g和 4 °C 10 分钟以去除细胞碎片。
7. 用 500 μL的 PBS冲洗聚 L-赖氨酸涂层盖玻片三次。
8. 将上清液分装到 12 口井中，用等量的聚 L-赖氨酸涂层盖玻片（每口井 720 μL上清液）。
9. 将 24 孔板放入摆动桶转子中 ( BIOFlex TM HC) .
10. 离心机 4,200 × g水平和 4°C 10 分钟。
11. 洗盖玻片_ 每孔500 μL PBS 一次。
12. 现在，纯化的睫状轴已准备好进行免疫染色、嘌呤霉素标记和邻近结扎测定。
注意：建议使用免疫荧光染色来检查纤毛的质量和完整性。针对 Arl13b（一种睫状膜蛋白）和乙酰化微管蛋白的抗体分别用于睫状膜和轴丝的质量和完整性。针对 Cep290（一种过渡区蛋白）和 Odf2（一种基体蛋白）的抗体用于检查纯化的睫状轴是否含有过渡区和缺乏基体。

C. 纯化的睫状轴的免疫染色
1. 室温下用每口井500 μL的 4% PFA固定睫状轴15 分钟。
2. 500 μL短暂洗涤每孔 PBS。
3. 使用 500 μL的 0.5% Triton X-100 渗透 15 分钟。
4. 500 μL短暂洗涤每孔 PBS。
5. 用 500 μL孵育封闭缓冲液（TBST 中 4% BSA）在室温下每孔1 小时。
6. 制作一个湿度室（图 3）。
a. 用锡箔包裹15 厘米培养皿的外表面，以保护样品免受光照。将锡纸的亮面朝湿度室外面放置。
b. 将浸水的滤纸放入培养皿中。
c. 将一块封口膜放在滤纸上。

图 3. 湿度室的代表性图像。
注意锡箔纸、滤纸、封口膜和盖玻片。滤纸和封口膜分别由紫色和蓝色虚线勾勒。

7. 使用镊子将盖玻片转移到封口膜上。将有睫状轴的一侧朝上。
8. 用 90 孵育每个盖玻片微升在 4°C 的封闭缓冲液中稀释一抗过夜。
9. 用 200 μL封闭缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。
10. μL的二级抗体在室温下在封闭缓冲液中稀释1 小时，孵育每个盖玻片。
11. 用 200 μL封闭缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。
12. μL短暂洗涤每个盖玻片的 Milli-Q 水。
13. 滴 10 μL 封固剂（ ProLong 钻石防褪色封固剂）每张幻灯片。
14. 用滤纸从盖玻片中去除多余的 Milli-Q 水。
15. 立即将盖玻片安装到载玻片上（ Cao等人，2014 年）。
16. 将样品在室温下避光干燥至少 2 小时，然后将其储存在4°C。

D. 共聚焦显微镜对纯化睫状轴的成像
1. 共聚焦显微镜图像是在具有 63×/1.4 油浸物镜的 Leica TCS SP8 WLL 系统上拍摄的。使用折射率为 1.518 的浸油来最大限度地减少球面像差。扫描速度为 400 Hz ，线平均为 3，沿z 轴以 0.5-μm 的间隔捕获光学切片。典型图像如图 4 所示。对于额外的荧光图像，请参阅原始研究文章的补充图 2C ( Hao et al. , 2021 ) 。
2. 测量参数见表 1，荧光成像的适当睫状轴密度如图 4 所示。

表 1. 滤波器和测量参数

图 4。孤立的睫状轴的典型图像。
从一个纯化的睫状轴将75 cm 2 mPEC烧瓶均匀地旋转到 12 片 12-mm 盖玻片上。 Ac-tub 装饰纤毛轴丝。 Cep290 标志着过渡区。比例尺，25 μ m 。

食谱

1. PBS， pH 7.4
试剂最终浓度数量
氯化钠 137 毫米 8 克
氯化钾
KH 2 PO 4
Na 2 HPO 4 2.7 毫米
2毫米
10毫米 0.2克
0.24 克
1.44 克
磨iQ 水
全部的不适用
不适用 1,000 毫升
1,000 毫升

2. mEPC培养基
试剂最终浓度数量
普利莫辛 50微克/毫升 500微升
记忆体
F BS 不适用
1 0% 450 毫升
5 0 毫升
全部的不适用 500 毫升

3. 饥饿培养基
试剂最终浓度数量
普利莫星 50微克/毫升 50 0微升
记忆体不适用 500 毫升
全部的不适用 500 毫升

4. 分解缓冲液， pH 7.4
试剂最终浓度数量
氯化钠 161 毫米 9.4 克
氯化钾
硫酸镁4
氯化钙2
HEPES
葡萄糖 5毫米
1毫米
4.7 毫米
5毫米
5.5 毫米 0.37 克
0.12 克
0.41 克
1 .2 克
0 .99 克
Milli-Q 水
全部的不适用
不适用 1,000 毫升
1,000 毫升

5. 酶消化缓冲液
试剂最终浓度数量
E DTA （50 毫米库存） 0.5 毫米 100微升
CaCl 2 (100mM 库存)
NaOH (1M原料)
木瓜蛋白酶 1毫米
1.5 毫米
10 单位/毫升 100微升
15微升
1 00 U
剖分缓冲区
全部的不适用
不适用 10 毫升
10 毫升

6. 脱纤维素缓冲液， pH 5.5
试剂最终浓度数量
蔗糖 250 毫米 85.575 克
氯化钙2
管道
Milli-Q 水 20毫米
20毫米
不适用 2.22 克
6.047 克
1000 毫升
全部的不适用 1000 毫升
用饱和 HCl 调节 pH。过滤-用 0.22 μ m过滤器除菌，并在 4°C 下储存。

7. 4% PFA
试剂最终浓度数量
多聚甲醛 4% 4克
PBS 不适用 100 毫升
全部的不适用 100 毫升
将溶液加热至 60 °C ，以加速 PFA 的溶解。
新鲜制备，使用前用0.22 μm过滤器过滤消毒。

8. TBST ( 10 × ) , pH 7.5
试剂最终浓度数量
氯化钠
三碱基
吐温 20 1.5M
0.5M
0.5% 88 克
60 克
5 毫升
Milli-Q 水不适用 1,000 毫升
全部的不适用 1,000 毫升
将溶液加热至 60 °C ，以加速溶质的溶解。

9. 阻塞缓冲区
试剂最终浓度数量
牛血清白蛋白 4% 4克
TBST ( 10 × )
Milli-Q 水 1 ×
不适用 10 毫升
90 毫升
全部的不适用 100 毫升
过滤-用 0.22 μ m过滤器除菌，-20°C保存。

致谢

感谢国家自然科学基金（XZ 31991192，XY 31970652）、国家重点研发计划（XZ、XY 2017YFA0503500）和中国科学院（XDB19020102）的资助。感谢安德森博士（德克萨斯大学西南医学院）为这种睫状轴净化方法提供的原始缓冲液配方。感谢陈亚文博士（上海生物化学与细胞生物学研究所）的工作，他将安德森的方法应用于原代培养的mEPC 。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

涉及小鼠组织的实验按照中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所分子细胞科学卓越中心机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。批准编号为SIBCB -S302-2110-037，有效期为2021年8月2日至2023年8月1日。

参考

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