材料和试剂

1.1.5 mL 微量离心管（ Biotix ，目录号： MTL-0150-BC)
2.2.0 mL微量离心管（ Biotix ，目录号：MT-0200-BC）
3.乙腈超等级（Merck，目录号：75-05-08）
4.苹果汁（任何品牌）
5.Bacto-琼脂（Sigma，目录号：A5306）
6.cOmplete TM ，Mini，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11836170001）
7.D-（+）-生物素，98+％（Alfa Aesar ，目录号：A14207）
8.二硫苏糖醇（DTT）（Roche，目录号：11583786001 ）
9.果蝇分拣刷（任何品牌）
10.Dynabeads TM MyOne TM Streptavidin C1（Thermo Fisher Scientific，目录号：65002）
11.胚胎收集笼（Genesee Scientific，目录号：59-100）
12.乙醇 96% vol（ VWR Chemicals，目录号：83804.360 ）
13.苍蝇食品（Nutri-Fly Bloomington 配方（BF），Genesee Scientific，目录号：66-113）
14.苍蝇食品小瓶（VWR，目录号：734-2264）
15.甲酸（VWR Chemicals，用于 LC-MS 的HiPerSolv CHROMANORM，目录号：84865.290）
16.山羊抗生物素HRP （Cell Signaling Technology，目录号：7075）
17.甲硫代磺酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：64306-10mL）
18.4-羟基苯甲酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：H5501-500G）
19.培养皿（VWR，目录号：390-1373）
20.磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂（Medicago，目录号：09-9400-100）
21.磷STOP TM 磷酸酶抑制剂片剂（Roche，目录号：4906837001）
22.Pierce TM高 pH 反相肽分离试剂盒（Pierce，目录号：84868）
23.Pierce TM BCA 蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
24.兔 11H10 抗 α-微管蛋白（Cell Signaling Technology，目录号：2125）
25.rLys -C（Promega，目录号：V1671）
26.蔗糖（Sigma，目录号：S0389）
27.组织研磨杵（ Kisker Biotech，目录号：033522）
28.TMTpro TM 16plex 标签试剂组（Thermo Fisher Scientific，目录号：A44521）
29.三乙基碳酸氢铵（Honeywell Fluka ，目录号：17902-100mL）
30.三氟乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：299537-50g）
31.三（2-羧乙基）膦（Thermo Scientific，目录号：77720）
32.Tris-Cl pH 7.4（Alfa Aesar，目录号： J60202.K2）
33.皮尔斯_ 胰蛋白酶（Pierce，目录号：90057）
34.酵母糊（在自来水中的面包酵母）（ Kisker Biotech，目录号： 789093）
35.苹果汁琼脂板（见食谱）
36.25% 乙醇 4-羟基苯甲酸甲酯（见食谱）
37.4 × Laemmli 缓冲液（见食谱）
38.RIPA 缓冲液（见配方）
39.洗涤缓冲液 1（参见配方）
40.洗涤缓冲液 2（参见配方）
41.洗涤缓冲液 3（参见配方）

设备

1.赞誉TM PepMap TM 100 C18 HPLC 柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：164199）
2.Easy- nLC TM 1200（Thermo Fisher Scientific，目录号：LC140）
3.加热块（格兰特，型号：QBD2）
4.培养箱（ Termaks ，目录号：TS 8056）
5.内部填充分析柱（ ESI Source Solutions ，目录号：PTC3-75-50-SP）
6.磁性支架（Thermo Fisher Scientific，型号：DynaMag-2）
7.微量离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Fresco 21）
8.微量离心机（VWR，型号：CT15RE）
9.Orbitrap Fusion TM 夜光TM 与 Easy-nLC1200液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：IQLAAEGAAPFADBMBHQ）连接的Tribrid TM质谱仪
10.Reprosil-Pur C18（Maisch 博士，目录号：R13.AQ.0001）
11.旋转器（Thermo Fisher Scientific， Labquake ，目录号：13-687-12Q）
12.超纯水系统（ Elga 实验室水，纯实验室）
13.真空离心机（ Genevac ， miVac ，目录号：DUC-23050-B00）

软件

1.吉祥物（Matrix Science，2.5.1 版）
2.Proteome Discoverer TM （Thermo Fisher Scientific，2.4 版，目录号：OPTON-30945）

程序

A.一种 CRISPR-Cas9 介导的 HDR 策略，用BioID酶对 POI 进行内源性标记
Housden中可以找到在果蝇中生成 CRISPR 组件和筛选策略的详细方案等。（2014）。
1.指导 RNA 设计和克隆
flyCRISPR Target Finder 工具 ( http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu/ ) (Gratz et al. , 2014)选择一个或两个合适的 CRISPR 目标位点。理想情况下，目标位点应位于POI 的内源编码 DNA 序列 (CDS) 和BioID编码插入片段之间的预期铰链区附近 (≤100 bp) 。应避免具有估计的脱靶（在flyCRISPR Target Finder 工具中注释）的指导序列。我们遵循用于克隆指导质粒的flyCRISPR协议（可在https://flycrispr.org/protocols/grna/获得）。
注意：如果不可能，其他染色体上的一个脱靶序列是可以容忍的，因为受影响的染色体可以在筛选过程的后期移除。尽管如此，CRISPR 脱靶位点可能会减少获得的阳性候选物的数量。
2.dsDNA供体设计和克隆
小的、常用的细菌质粒（例如puc57、 pBlueScript II 或pCRII Topo）可以有效地用作载体骨架。通过标准程序从基因组 DNA 来源克隆基因特异性同源臂（长度为 0.5-1kb；也可以选择更长和更短的序列，但可能会影响 HDR 效率）。 BioID酶的密码子优化 CDS应用于目标物种中的最佳密码子使用。用于表达下一代BioID酶miniTurbo （编号 116905）和TurboID （编号 116904）的质粒可从Addgene获得并用作扩增模板。可以在 POI 和BioID酶之间引入短而灵活的氨基酸接头序列，例如 1-4x[甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸] 或 1-4x[甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸-苏氨酸]，以尽量减少对 POI 的潜在影响空间位阻引起的功能（ http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker ，可在@igem.org，2022 年4 月22 日获得）。然而，应该考虑到接头序列可能会增加BioID标记半径。小蛋白标签，例如HA（氨基酸序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala）或OLLAS： Ser - Gly - Phe -Ala- Asn -Glu-Leu- Gly - Pro -Arg-Leu-Met- Gly - Lys ) 也可以添加以分析嵌合蛋白的表达和定位。可以使用几种策略来掩盖供体载体中 Cas9 识别的 CRISPR 靶位点：（1）改变 NGG PAM 序列中的鸟嘌呤，从而在 POI 的 CDS 中引入沉默突变； (2) 如果改变NGG序列不可行，可以改变目标序列中的几个核苷酸，在POI的CDS中引入沉默点突变； (3) 将 CRISPR 靶位点放置在预期的铰链区上，以便识别的序列将被BioID编码插入片段分开。如果目标序列之后的 NGG PAM位于非蛋白质编码区域，在该区域中碱基对改变可能影响基因表达，则建议使用最后一种方法。
笔记：
a.miniTurbo和TurboID下一代BioID酶的序列信息（ Branon等人，2018 年）可分别从保藏在Addgene #116905 和 #116904 的质粒获得。这些可以用作扩增的模板。
b.Scarless 基因编辑提供了一种供体载体系统，可简化候选筛选过程 ( https://flycrispr.org/scarless-gene-editing/ )。
c.AviTag TM (Schatz, 1993; Cognet et al., 2005)可用于将人工生物素化位点纳入 POI 或可能的近端候选物。在没有或很少有可访问的赖氨酸残基的情况下，这可以作为BioID阳性对照（将AviTag添加到 POI）或通过 MS 检测接近候选物。
3.将质粒注射到果蝇胚胎中
在其种系中表达 Cas9 的果蝇胚胎中注射引导 RNA 和 dsDNA 供体质粒可以通过遵循flyCRISPR注射协议 ( https://flycrispr.org/protocols/injection/ ) 或使用果蝇显微注射设施或商业注射服务来完成。
注意：几种在其种系中表达 Cas9 的转基因果蝇种群（例如，M{vas-Cas 9}ZH -2A）可用于注射。应考虑到注射液的遗传背景应 a) 与用于选择 CRISPR/Cas9 指导 RNA 靶位点的遗传背景相同，并且 b) 不扭曲以下实验分析（某些性状，例如，睡眠和寿命受遗传背景的影响很大）。此外，Cas9 转基因的来源应位于与靶向区域不同的染色体上。
4.筛选 CRISPR 介导的 HDR 事件
来自注射胚胎的亲本 (P) 雄性苍蝇从合适的平衡器库存中单独与雌性处女苍蝇杂交。 P 雌性苍蝇“集体”杂交到合适的平衡雄性。 2 – 3 天后，可以在新鲜培养瓶中识别和分离产卵雌性。可以每隔一天继续隔离可育雌性。此时排除未生育的女性会显着减少筛查过程中消耗的消耗品和工作量。从每个亲本杂交中分离出两到五只 F1 雄性，并分别与平衡雌性杂交。当 F1 杂交中可见幼虫后代时，可以牺牲 F1 雄性进行基因组 DNA 分离和使用单蝇 PCR 筛选进一步进行基因分型。
注意：我们遵循标准的单蝇 DNA 制备方案（例如，可从http://francois.schweisguth.free.fr/protocols/Single_fly_DNA_prep.pdf获得）并进行以下修改：蛋白酶 K 消化在 PCR 循环仪中完成在 50°C 下 30 分钟，然后在 85°C 下酶灭活 10 分钟。我们通常从粗 DNA 制剂中制备 25 μL PCR 混合物和 2.5 μL 作为模板溶液。在进行进一步实验之前，应通过 Sanger 测序分析阳性候选者。

B.果蝇POI 相互作用组的体内标记
1.将带有酵母糊涂片的苹果琼脂板放在胚胎收集笼中。
2.BioID -POI 的40-50 只年轻（<7 天）雌性和雄性苍蝇转移到胚胎笼中，并允许产卵 2-8 小时。如果产下足够的鸡蛋，请从笼子中取出盘子并在 25 °C 下老化。如果没有，请更换一个新的苹果琼脂盘，以进行另一个产卵期。
注意：作为背景对照，使用与您的基因工程苍蝇的遗传背景非常匹配的适当参考苍蝇种群（例如， w 1118 或广州-S）。
3.22–23 小时后，使用果蝇分拣刷从盘子中取出孵化的幼虫，每小时再次检查新孵化的第一龄 L1 幼虫。将 50 L1 幼虫从同一收集点转移到果蝇培养瓶中，该培养瓶中含有足量的布卢明顿配方 (BF) 苍蝇食品，辅以 100 μM 生物素。对于每个基因型/条件/复制，准备至少五个小瓶。
笔记：
a.生物素原液用水制备，并在烹饪后掺入飞蝇食品中，然后倒入小瓶中以制成 100 µM 的最终浓度。
b.在这一步同步发育时间很重要，从年龄匹配的第三龄幼虫的同质种群中获得近端体。
c.更高浓度的补充生物素导致不表达任何BioID融合蛋白的对照幼虫致死（Uçkun 等人，2021）。
4.为每个基因型/条件/复制收集 150 只生物素喂养的第三龄幼虫（产卵后 72-120 小时；孵化后 48-96 小时）。

C.果蝇幼虫大脑中提取蛋白质
1.在冰冷的 PBS 中解剖 150 个幼虫大脑（Hafer 和 Schedl，2006），然后转移到冰上含有300–400 µL PBS的微量离心管中。
笔记：
a.理想情况下，解剖由多人进行，以避免样本衰减和发育时间的不同步。如果仅由一个人进行解剖，则需要对一种基因型/条件/复制进行几轮解剖。
b.解剖的大脑可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C，直到收集到所需的样本量。
2.解剖完成后，取出 PBS 并直接在 700 μL 的 RIPA 缓冲液中溶解解剖的第三龄幼虫大脑，辅以 1 × cOmplete TM Mini 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，1 × 磷STOP TM 磷酸酶抑制剂和使用组织研磨杵的 1 mM DTT。
3.在 4°C 下以 21,500 × g离心样品 20 分钟，然后将上清液转移到新的微量离心管中。
4.执行 BCA 测定以确定每个样品的蛋白质浓度。
笔记：
a.每个样品/重复/条件的总蛋白质等于或大于 1 mg 是可取的。
b.BCA 检测根据Pierce TM BCA 蛋白检测试剂盒用户指南进行。
c.如果不同数量的大脑被裂解，并且蛋白质浓度因样品而异，则在下拉之前需要对蛋白质数量进行标准化。这可以通过用 RIPA 缓冲液稀释更浓缩的样品来完成。
5.将 50 µL 裂解液转移到单独的微量离心管中，用于蛋白质印迹分析和蛋白质生物素化验证； 50 µg 蛋白质足以对生物素化蛋白质进行蛋白质印迹分析。使用特异性抗体检测您的 POI 或可选的蛋白质标签以及抗生物素-HRP/链霉亲和素-HRP 以确认增加的蛋白质生物素化。使用针对管家蛋白（如抗 α-微管蛋白）的抗体作为上样对照。
Roux 等人提供了生物素化蛋白质的蛋白质印迹实验方案和一些示例。（2013）。

D.生物素化蛋白质的下拉
该下拉协议改编自 Roux等人。（2013）。
1.为每个样品/复制品准备 1.5 mL 微量离心管，并放在磁性支架上。注意：以下步骤在室温下进行。
2.在每个管中加入 500 μL 的 RIPA 缓冲液和 500 μL 的 50 mM Tris-Cl pH 7.4。
3.均质Dynabeads TM MyOne TM Streptavidin C1 储备溶液，轻轻敲击并在每管中加入 300 µL。将管子放在磁性支架上，等待 3 分钟。
注意：使用的链霉亲和素珠的数量取决于样品中蛋白质的数量； 300 µL 的珠子足以容纳 1 – 1.5 mg 的总蛋白。使用更多的珠子以获得更高的蛋白质含量。
4.轻轻去除上清液并添加 700 μL 的蛋白质裂解物，对应于步骤 C3中至少 1 mg 的总蛋白质。
5.用珠子重悬裂解物，并在 4°C 的旋转器上孵育过夜。
6.将管子放在磁性支架上，等待 3 分钟。
7.将上清液转移到标记为流通的新 1.5 mL 微量离心管中。
笔记：与来自步骤 C5 的样品相比，流通标记的上清液可以评估蛋白质印迹中的下拉效率。
8.用 1.5 mL 的洗涤缓冲液 1 重新悬浮珠子。
9.在室温下将管子放在旋转器上 8 分钟。
10.将管子放在磁性支架上，等待 3 分钟。
11.去除上清液并重复步骤 D8-D10。
12.用 1.5 mL 的洗涤缓冲液 2 重新悬浮珠子，然后重复步骤 D9-D10。
13.用 1.5 mL 的洗涤缓冲液 3 重新悬浮珠子，然后重复步骤 D9-D10。
14.要去除洗涤剂，请按照步骤 D8-D10 中所述的程序，用 1.5 mL 50 mM Tris-Cl pH 7.4 清洗珠子四次。
15.将 150 μL 的重新悬浮珠子移到新管中进行西方印迹分析，并保留剩余的 1.35 mL 重新悬浮珠子用于 MS 分析。
16.在室温下以 2，000 × g旋转 150 μL 和 1.35 mL 等分的重悬珠子5 分钟。
17.对于在步骤 D15–D16 中制备的蛋白质印迹样品，去除上清液并加入 100 µL 的 1 × LaemmLi缓冲液。在 95°C 下加热样品 5 分钟，然后以 18,700 × g离心机，4 °C 10 分钟。上清液可储存在 -20 °C以进行进一步的蛋白质印迹分析。
18.对于 MS 分析，从 1.35 mL 样品中去除上清液，并用 200 μL Tris-Cl pH 7.4 重新悬浮珠子。

E.洗脱，减少，烷基化，和胰蛋白酶消化的生物素化蛋白质
1.使用磁力架将珠子沉淀 1 分钟并去除上清液。
2.用 1 mL 的 50 mM 三乙基碳酸氢铵 (TEAB) 清洗珠子两次。
3.将 100 μL 的 50 mM TEAB 添加到珠子中。轻轻翻转试管五次，使所有珠子都在运动。
4.对于蛋白水解珠洗脱，将 10 µL 的 0.05 µg/µL rLys -C溶解在与酶一起提供的再悬浮缓冲液中直接添加到样品中。
5.在培养箱中 37°C 孵育 3 小时。每 30 分钟混合一次珠子，用一根手指轻轻轻弹样品管，使所有珠子都在运动。对以下每个步骤执行相同操作。不要通过涡旋混合珠子。
6.还原：添加 1 μL 的 500 mM Tris（2-羧乙基）膦 (TCEP)，最终浓度为 5 mM TCEP。翻转样品并在 37°C 的培养箱中孵育 30 分钟。
7.烷基化：添加 5 μL 的 200 mM 甲基硫代磺酸盐(MMTS)，最终浓度为 10 mM MMTS。翻转样品并在室温下孵育 30 分钟。
8.为了进一步消化样品，添加 6 μL 的 0.05 μg/μL 胰蛋白酶（悬浮在 50 mM TEAB 中）。翻转样品管以确保样品混合并在 37°C 培养箱中孵育过夜。
注意：没有必要使用 50 mM TEAB。可以用水。应避免使用含有抑制 TMT 标记的伯胺（如 Tris、碳酸氢铵）的缓冲液。
9.使用磁力架沉淀珠子并将上清液转移到新的样品管中。

F.TMTpro TM 16plex进行串联质量标签 (TMT) 标记
1.让 TMT 试剂平衡至室温。
2.将 TMT 试剂溶解在 130 μL 的乙腈中，短暂涡旋，并在室温下溶解 5 分钟。
3.短暂旋转 TMT 试剂并将 42 μL 试剂转移到相应的样品中，例如，将 42 μL TMT 试剂 126 转移到对照 1。
4.在涡旋上混合样品，短暂旋转，并在室温下孵育 1 小时。
5.在每个样品中加入 8 μL 的 5% 羟胺（从 TMT 标记套件中提供的 50% 羟胺稀释 1:10），并在室温下孵育 15 分钟。
6.汇集所有标记的样本。用 50 μL 的 50% 乙腈清洗每个小瓶，以回收剩余的样品并添加到池中。
7.在 40°C 的真空离心机中干燥样品。样品完全干燥可能需要几个小时。偶尔检查一下。

G.高的酸碱度反转阶段分馏
注意：在这一步中，消化和标记的肽被分成 10 个部分使用高 pH 反相肽分离试剂盒。与直接注入合并的 TMT 样品相比，分析馏分将通过 LC-MS 检测到更多的肽。每根色谱柱的推荐容量为 10–100 µg 肽。
1.将样品溶解在 600 μL 的 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 中，并在室温下静置直到步骤G7 。
2.制备含有 8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25% 和 50% 乙腈的洗涤和洗脱缓冲液（在高 pH 分馏试剂盒中提供） , 根据表 1。

表格1。用于制备洗涤和洗脱缓冲液的乙腈和三乙胺体积。
分数号乙腈 (%)乙腈 (µL)三乙胺 (0.1%) (µL)
洗涤缓冲液3%30970
18%80920
210%100900
312%120880
414%140860
516%160840
618%180820
720%200800
822%220780
925%250750
1050.0%500500

3.使用两根柱子并从分馏柱底部取下保护性白色尖端。将每列放入 2.0 mL 管中。
4.以 5,000 × g离心2 分钟以去除储存缓冲液并包装树脂材料。
5.取下红色螺帽，在色谱柱中加入 300 μL 的乙腈。以 5,000 × g旋转2 分钟；重复此步骤一次并丢弃流过。
6.将 300 μL 的 0.1% TFA 添加到列中。以 5,000 × g旋转2 分钟；重复此步骤一次并丢弃流过。
7.将 300 μL 样品转移到两列中的每一列。以 3,000 × g旋转2 分钟以执行以下步骤。在柱子上重新上样并再次旋转。
8.将色谱柱放入新的 1.5 mL 管中并加入 300 μL 水。对于所有洗涤和洗脱步骤，以 3,000 × g旋转2 分钟。
9.用 0.1% 三乙胺中的 300 μL 3% 乙腈清洗色谱柱，以去除未反应的 TMT 试剂。
10.将色谱柱放入新的 1.5 mL 管中，并用含有 8% 乙腈的 300 μL 洗脱缓冲液洗脱。
11.对每个洗脱缓冲液使用新试管重复步骤 11。
12.在真空离心机中干燥样品并将样品溶解在 3% 乙腈、0.1% 甲酸中，用于 LC-MS3 分析。

H.LC-MS3 分析
1.Fusion TM上分析每个馏分夜光TM Tribrid TM质谱仪与 Easy- nLC TM接口 1200液相色谱系统。 LC 系统应配备 Acclaim TM Pepmap TM 100 C18 捕集柱（100 微米 × 2 cm，粒径5 μm ）和内部填充分析柱id 75 μm ，粒径 3 μm ， Reprosil-Pur C18，Dr. Maisch ，长度 35 cm。
2.B的线性梯度分离肽，然后在 300 nL /min的流量下增加到 100%溶剂B 3 分钟和 100% B 10分钟。溶剂A为0.2%甲酸，溶剂B为80%乙腈、0.2%甲酸。
3.运行 Orbitrap Fusion TM 夜光TM 使用 SPS-MS3 的Tribrid TM质谱仪。母离子质谱以 120,000 分辨率采集，MS/MS 分析以数据相关的多槽模式进行，其中最强母离子的 CID 光谱记录在离子阱中，碰撞能量设置为 30，持续 3 秒（ “最高速度”设置）。前体在四极杆中以 0.7 m/z 隔离窗口进行隔离，选择 2 到 7 的电荷状态进行碎裂，动态排除设置为 45 s 和 10 ppm。报告离子定量的 MS3 光谱以 50,000分辨率记录，HCD 碎片在碰撞能量 55 处使用同步前体选择。

I.蛋白质组数据分析
Discoverer TM合并所有数据文件以进行识别和相对定量 2.4（赛默飞世尔科技）。使用Mascot 版本 2.5.1 (Matrix Science) 作为搜索引擎，针对来自Uniprot ( Swissprot +TrEMBL )的Drosophila melanogaster数据库执行数据匹配。前体质量容差设置为 5 ppm，碎片质量容差设置为 0.6 Da。胰蛋白酶肽被接受，但有一个缺失的切割，蛋氨酸氧化的可变修饰和固定的半胱氨酸烷基化，选择了 N-末端和赖氨酸的TMTpro 标记修饰。 Percolator 用于验证肽谱匹配（置信阈值中等 (<5%) 和高 (<1%)）。 TMT 报告离子在 MS3 HCD 光谱中被识别，具有 3 mmu质量容差。只有给定蛋白质的独特肽段才被考虑用于蛋白质的定量。

食谱

1.苹果汁琼脂板
将 18 g Bacto -agar 添加到 800 mL 冷自来水中并在微波炉中煮沸。加入 20 克蔗糖和 200 毫升苹果汁。彻底混合并冷却至~55°C。加入 5 mL 的 25% 乙醇 Methyl-4-hydroxybenzoate (Nipagin) 原液，充分混合，倒入培养皿中。
2.25% 乙醇 4-羟基苯甲酸甲酯
制备 25%重量/体积(w/v) 的 4-羟基苯甲酸甲酯原液
3.4 × Laemmli 缓冲器
200 mM Tris-Cl pH 6.8、8% SDS、40% 甘油、0.4% 溴酚蓝和 50 mM DTT
4.RIPA 缓冲液
50 mM Tris-Cl、pH 7.4、250 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA 和 0.5% Triton X-100
5.洗涤缓冲液 1
2% (w/v) 安全数据表
6.洗涤缓冲液 2
0.1% (w/v) 脱氧胆酸、1% Triton X-100、1 mM EDTA、500 mM NaCl、50 mM HEPES pH 7.5
7.洗涤缓冲液 3
0.5% (w/v) 脱氧胆酸、0.5% NP-40、1 mM EDTA、250 mM LiCl、10 mM Tris-Cl pH 7.4

致谢

这项工作得到了瑞典癌症协会 (RHP CAN18/729 和 CAN18/834)、瑞典儿童癌症基金会 (RHP PR2019-0078)、瑞典研究委员会 (RHP 2019-03914)、 Göran Gustafsson的资助基金会 (RHP2016), Åke Wiberg基金会 (GW M19-0561) 以及 Knut 和 Alice Wallenberg 基金会 (KAW 2018.0057)。图形摘要是使用BioRender (BioRender.com) 创建的。
该协议的下拉部分改编自Roux等人。（2013）。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

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2.Branon, TC, Bosch, JA, Sanchez, AD, Udeshi , ND, Svinkina , T., Carr , SA, Feldman, JL, Perrimon , N. 和 Ting, AY (2018)。使用 TurboID 在活细胞和生物体中进行有效的邻近标记。 Nat Biotechnol 36（9）：880-887。
3.Cognet , I., Guilhot , F., Gabriac , M., Chevalier, S., Chouikh , Y., Herman-Bert, A., Guay -Giroux, A., Corneau , S., Magistrelli , G., Elson 、GC等人。（2005 年）。使用 Bir A 生物素连接酶标记心肌营养因子样细胞因子：研究免疫和非免疫细胞受体表达的敏感工具。 J 免疫方法301（1-2）：53-65。
4.Droujinine ，IA，Meyer，AS，Wang，D.， Udeshi ，ND，Hu，Y.，Rocco，D.，McMahon，JA，Yang，R.，Guo，J.，Mu，L.，等。（2021 年）。通过体内组织特异性标记进行蛋白质运输的蛋白质组学。国家通讯12（1）：2382 。
5.Gratz, SJ, Ukken , FP, Rubinstein, CD, Thiede , G., Donohue, LK, Cummings, AM 和 O'Connor-Giles, KM (2014)。果蝇中高度特异性和高效的 CRISPR/Cas9 催化同源定向修复。遗传学196（4）：961-971。
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