材料和试剂

A.塑料和玻璃器皿
1.60 孔培养板 ( Nunc, Naperville, IL, USA, LUX 5260)
2.35 cm × 10 mm 培养皿（ Thermo Scientific，目录号： 150318）
3.盖玻片，18 × 18 毫米（默克，BR470045）
4.显微镜载玻片，25 mm × 75 mm（Merck，S8902）

B.一种动物
六八周大的雌性老鼠

C.Click - iT® Plus OPP Alexa Fluor®蛋白质合成测定（ Thermo Scientific，目录号：C10456 ），包括
1.组分 A：Click- iT ® OPP 试剂，20 mM DMSO
2.组分 B：Alexa Fluor ® 488吡啶甲基 DMSO溶液中的叠氮化物
3.组分 C：Click - iT ® OPP 反应缓冲液（10 ×含有 Tris 缓冲盐水的溶液）
4.组分 D：铜保护剂
5.组分 E：Click- iT® Reaction Buffer Additive
6.组分 F：Click- iT® Reaction Rise Buffer，含有 2 mM叠氮化钠。
7.组分 G： NuclearMask TM Blue Stain，2,000 ×浓缩水

D.化学品和试剂
1.Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号： D5773）
2.Triton X-100 （Sigma，目录号： T8787）
3.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号： B2064）
4.多聚甲醛（PFA）（Sigma，目录号： P6148）
5.DMSO（Sigma，目录号：D8418）
6.Click- iT ® Plus OPP Alexa Fluor ®蛋白质合成检测试剂盒（见配方）
7.固定缓冲液（10 mL）（见配方）
8.1 × PBS (50 mL)（见配方）
9.透化缓冲液（1 mL）（见配方）
10.洗涤液（10 mL）（见配方）
11.KSOM 培养基（见食谱）

设备

1.解剖显微镜（Olympus，SZx7）
2.尼康 ECLIPSE 80i 显微镜，Plan Apo 40 × /1.0 油镜（尼康，东京，日本）
3.pH计SevenDirect SD20 （梅特勒-托利多）
4.孵化器， Cytomat 2 C470-LiN（Themo Fisher Scientific）

软件

1.ImageJ ( http://imagej.net/Fiji )
2.SPSS for Windows（22.0 版， SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）

程序

动物和治疗

A.动物和胚胎采集
六八周龄雌性小鼠通过腹腔注射 5 IU 马绒毛膜促性腺激素 ( eCG ) （中国宁波第二激素厂）和 44-48小时后，5 IU 人绒毛膜促性腺激素 ( hCG )（珠海丽珠）进行超排卵，中国），然后与有生育能力的雄性一起放置过夜。第二天早上，已交配的雌性中存在交配插头，从而证实了怀孕。受精卵或双细胞胚胎分别在hCG后 20 小时和 40 小时从已交配的雌性中回收。将胚胎收集在 HEPES 缓冲的改良人输卵管液培养基 (HEPES-HTF) (O'Neill, 1997)中，培养基的所有成分均为组织培养级 (Sigma 美国密苏里州圣路易斯化学公司）并含有 3 mg 牛血清白蛋白/mL (Sigma)。

B.培养基制备和处理
1.校准用于胚胎处理的 OPP 浓度
为了在胚胎治疗期间尽量减少 OPP 的胚胎毒性，应测试几剂 OPP。例如，用 KSOM 培养基（Lawitts 和 Biggers，1993 年）稀释组分 A（20 mM）以产生一系列 OPP 浓度（例如，50、37.5 和 25 μM ）至 400 μL 的最终工作溶液（表 1）。

表 1.准备 Click- iT ® OPP（组分 A）的一系列工作解决方案
示例是准备三剂 OPP。对照为 KSOM 培养基中的 0 μM OPP。在所有工作溶液中将 DMSO 的浓度调整为 0.25% (v/v)。
注：总量可根据治疗次数按比例调整； OPP 的浓度可以针对不同的实验设计进行重新调整或优化。根据实验设计，可以使用多种培养基类型（例如， hTF培养基和 KSOM，添加或不添加氨基酸）。
2.OPP 处理（图 1 A1-4）
a.在培养皿上设置微滴。每滴含有 50 µL 的 OPP 工作溶液，上面覆盖有 2 mm 的重质石蜡油 (Sigma)。
可选：使用 60 孔Terasaki板（LUX 5260，Nunc，Naperville，IL，USA），每个板含有 10 μL OPP 工作溶液。
b.在 37 °C的5% CO 2培养箱中平衡2 小时。
c.将胚胎转移到 OPP 工作解决方案中。
可选：胚胎密度是可选的，例如，10 µL 工作溶液中有 1 – 10 个胚胎。在所有处理中保持相同的密度。
d.在 37 °C 下培养和处理胚胎2-6 小时，空气张力为5% CO 2 。
关键：(1) 建议 OPP 的潜伏期在 30 分钟到 1 小时之间，以最大限度地提高检测率并最大限度地降低毒性（Liu 等人，2012 年；Signer 等人，2014 年）。然而，植入前胚胎中的翻译可能与体细胞不同。在简单配制的培养基中，2 细胞胚胎在用 37.5 µM OPP 处理 6 小时后表现出峰值信号（Li et al., 2021）。因此，我们建议在确定最终实验设计之前使用不同浓度的 OPP （图 2A）和药物剂量（图 2C）测试不同的孵化期（图 2B），用于胚胎发育的每个阶段（如示例表格1）。 (2) 如果实验是在不同的氧气浓度下进行的，建议进行类似的校准，因为该协议是为在最终实验设计确定之前在空气张力下进行 OPP 处理而设计的。

分步方法详细信息
注意：为了便于系统地处理胚胎，我们使用 60 孔Terasaki板（图 1 B1 – 2）。每口井可包含 10 µL 溶液和 1 – 10 个胚胎。将含有最少溶液的胚胎转移到下一步的孔中，并在每个转移阶段使用干净的移液器。

A.进行胚胎固定和透化（图 1 B1 – 2）
1.在室温下工作。将用 OPP 处理的胚胎转移到洗涤液中并冲洗一次以去除培养基。
2.将胚胎转移到 10 μL 固定缓冲液/孔中。孵育 15 分钟在室温下。
3.用洗涤液清洗胚胎两次以去除固定剂。
4.将胚胎转移到 10 μL 的透化缓冲液中并孵育 20 分钟在室温下。

B.Click- iT ® OPP 检测（图 1 B1 – 2）
1.根据表2制备 Click - iT®反应混合物。

表 2. Click- iT ®反应混合物

注意：在制备后 15 分钟内使用 Click- iT®反应混合物。孔的数量可能因实验而异。在开始实验之前计算您将电镀的孔数很重要。
2.用 10 μL 的洗涤液清洗胚胎两次
3.将胚胎转移到 10 µL Click- iT ®反应混合物中。
4.在室温下孵育 30 分钟。避光。
5.每孔用 10 µL Click - iT ®反应上升缓冲液（组分 F）清洗一次。

C.DNA 染色（图 1 B1-2）
注意：以下协议基于每口井 10 µL HCS NuclearMask TM Blue Stain 工作溶液。
1.× PBS 中稀释 HCS NuclearMask TM Blue Stain（组分 G）溶液（1:2,000，v/v），以获得 1 × HCS NuclearMask TM Blue Stain 工作溶液。
2.将胚胎转移到 10 μL 的 1 × HCS NuclearMask TM蓝色染色工作溶液中。在室温下孵育 30 分钟，避光。
3.用洗涤液洗涤两次，然后进行成像和分析（下）。

D.成像
1.制作幻灯片（图 1 C1 – 5）
a.用乙醇清洁载玻片和盖玻片。
b.使用装有凡士林的 18-22 G 针头的胰岛素注射器。在幻灯片上制作两条平行的凡士林通道以支撑盖玻片。凡士林通道应为1-2 毫米厚。
c.添加一滴 7 μL 1 × PBS。（可选：使用标准的防褪色安装介质）。
d.转移 10 个胚胎/滴，然后用镊子轻轻盖上 18 × 18 mm 盖玻片；用无绒吸水纸巾去除盖玻片边缘多余的液体。
e.用指甲油密封（可选： PathTech ， https ://www.pathtech.com.au ）。注意不要移动盖玻片以避免挤压胚胎）。
2.在荧光显微镜下使用适用于 DAPI/Hoechst 的滤光片和适用于 Alexa Fluor ® 488 的 FITC 扫描载玻片（图 2 A - C）。
3.× /1.0 油物镜上使用汞灯紫外照明捕获整个截面图像。（任何类似的荧光显微镜系统都适用）

E.荧光测量和数据分析
1.测量荧光 OPP 染色的强度
可以通过合适的分析软件，例如ImageJ和ImagePro Plus(Media Cybernetics，Inc.)测量细胞核或整个胚胎中荧光通道中新生蛋白质合成的荧光强度。
a.NucleMask蓝染色双重染色的胚胎图像。
b.在“分析”菜单中，打开“设置测量”并勾选“面积”、“积分密度”、“平均灰度值”和“标准差”。
c.在NuclearMask蓝色染色图像中，勾勒出使用徒手选择感兴趣区域(ROI) 的单核。从分析 > 工具，打开 ROI 管理器。将此 ROI 添加到 ROI Manager 并重命名。
d.将 ROI 管理器中概述的核的 ROI 分配到同一胚胎的 OPP 染色图像。这是同一胚胎的双重染色图像的细胞核的精确定位。
e.从分析菜单中选择“测量”。结果显示为一个弹出框，其中包含胚胎细胞核的一堆值。用同样的方法测量另一个核的 OPP 染色的荧光。
f.使用徒手选择 ROI 直接测量概述的整个胚胎的荧光染色。
g.从弹出框中记录并复制每个核或整个胚胎的 ROI 的综合密度（代表 OPP 染色的荧光强度）。设置 Excel 电子表格，用于分析所有处理和控制的数据。
h.从同一实验中所有处理和控制的值中减去 0 μM OPP 控制处理中的值。结果值用于分析。
2.统计分析
使用 SPSS for Windows（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）（可选：其他统计软件）进行统计分析。通过单变量方差分析定量分析荧光强度（AU，染色光密度的任意单位）。该参数设置为因变量，而测试治疗和药物剂量为自变量。实验重复作为协变量被纳入模型。通过最小显着性差异检验分析个体自变量之间的差异。小于 5% 的概率 (P < 0.05) 被认为是显着的。
关键：由于一系列不可控的变量，荧光强度定量分析的结果可能因实验而异。因此，重要的是每次处理的胚胎同时并并行处理。所有处理均暴露于所有试剂的相同制剂和稀释液。同样，实验中的所有准备工作都在同一会话中进行了显微镜检查，并使用了相同的显微镜和相机设置。对于实验中的每个胚胎，所有图像分析都以相同的方式进行。在整个研究过程中，所有准备工作均由同一位经验丰富的操作员进行。

图 2. 胚胎细胞中 OPP 染色分析。
(A)代表野生型双细胞胚胎荧光变化的全截面图像，无论是在没有或使用一系列 OPP 浓度的情况下处理 24 小时。每个治疗组至少有十个胚胎。在 50 µM OPP 组中，所有胚胎都在 2 细胞阶段被逮捕。 (B)从女性生殖道收集双细胞胚胎，并用 37.5 μM OPP 处理 0、2、4 和 6 小时。这些图像代表了来自三个独立复制的总共 30 个胚胎。（C）用 4EGI-1 (EIF4E 抑制剂) (Li et al. , 2021)环己酰亚胺 (CHX) (Schneider-Poetsch et al. , 2010)处理双细胞胚胎6 小时。图像代表每次处理的十个胚胎的三个独立重复。 (四) (C)中用4EGI-1或CHX)处理的胚胎中的OPP染色强度与对照(无抑制剂)相比。数据是平均值±SEM（单变量方差分析）。 * 与所有其他治疗有统计学差异 (P < 0.001)。比例尺：10 μm 。

食谱

1.Click- iT ® Plus OPP Alexa Fluor ®蛋白质合成检测试剂盒
a.打开前，让试剂瓶完全解冻并升温至室温。
b.Click- iT ® OPP 试剂（组分 A）和NuclearMask TM Blue Stain（组分 G）短暂离心，以最大限度地提高试剂回收率。
c.准备Click- iT ® Reaction Buffer Additive（组分 E）的 10倍储备溶液。将 2 mL 去离子水加入小瓶（含 400 mg）并混合直至完全溶解。使用后，分装 50 µL/每个，将剩余的储备溶液储存在 ≤ –20°C。
注意：按说明储存时，该储备溶液可稳定保存长达 1 年。
d.准备 1 × Click- iT ® OPP 反应缓冲液。
将组分 C 瓶 (4 mL) 中的所有溶液转移到 36 mL 的去离子水中。用一些稀释的 Click- iT ® OPP 反应缓冲液冲洗组分 C 瓶，以确保转移所有 10 ×浓缩液。
注意：在制备后 15 分钟内使用 Click- iT ®反应混合物。要制备更少量的 1 × Click- iT ® OPP 反应缓冲液，请用 9 倍体积的去离子水从 Component C 瓶中稀释 1 倍体积。使用后，将剩余的 1 ×溶液储存在 2°C–8°C。按指示储存时，1 × Click- iT ® OPP Reaction Buffer 可稳定保存 6 个月。
e.准备NuclearMask TM Blue Stain（组分G）的工作溶液。
在使用前准备好。在 PBS 中按 1:2,000稀释 HCS NuclearMask TM Blue Stain（组分 G）溶液，以获得 1 × HCS NuclearMask TM Blue Stain 工作溶液。
2.固定缓冲液 [3.6% (w/v) 多聚甲醛在 PBS] (10 mL)
a.称取0.37 克多聚甲醛。
b.在玻璃容器中加入MilliQ H 2 O 10 mL。
c.添加 1.0 M NaOH 14 µL。
d.在 50 – 60 °C加热板上加热并搅拌直至完全溶解。大约需要20分钟。
e.添加 PBS 0.096 g 并搅拌直至完全溶解。
f.盖上容器并离开，直到它达到室温。
g.在室温下用 1 N HCl 将 pH 值调节到 7.4。
3.1 × PBS（50 毫升）
a.称量 0.4798 克 PBS 粉末。
b.加入 50 mL MilliQ H 2 O 并充分混合。
4.透化缓冲液 (1 mL)
a.使用前准备。
b.5 µL 海卫 X-100
c.添加到 995 μL的 1 × PBS 中并充分混合。
5.洗涤液（10 毫升）
a.称重 0.3 克 BSA
b.添加到 10 mL 的 1 × PBS 中。确保在使用前完全溶解。
注意：在制备和处理多聚甲醛时，始终使用通风柜并遵循安全措施。使用过程中应使用个人防护装备。
6.KSOM 培养基 (100 毫升) 的组成
555 毫克氯化钠
18.5 毫克氯化钾
4.75 毫克 KH 2 PO 4
4.95 mg MgSO 4 •7H 2 O
25 mg CaCl 2 •2H 2 O
210 毫克碳酸氢钠3
3.6毫克葡萄糖
2.2 毫升丙酮酸钠
0.174 mL DL-乳酸
4 毫克 EDTA
14.6 毫克 GL-谷氨酰胺和 100 毫克牛血清白蛋白
注：所有试剂均购自 Sigma。
加入MilliQ纯化水至 100 mL，充分混合，用 22 mm 过滤除菌 Millex -GV 过滤器，0.22 µm (MERCK)。

致谢

我们感谢南京优尔生物科技发展有限公司（中国江苏省南京市江北新区）慷慨捐赠所有胚胎培养基：KSOM、HEPES-HTF 和 HTF。
FUNDING:这项工作得到了中国国家自然科学基金授予 XJ (81471458) 和中国浙江省自然科学基金( LQ21H040010 )授予 YL的资助

利益争夺

作者声明没有竞争利益
作者贡献： X. Jin 。和 CO 监督了这项研究。十进。 CO 和 XH 设计并撰写了手稿。 YL、XJLC、JT、MH 和 JL 进行了实验。

伦理

动物实验经相关研究机构和大学的伦理准则批准并根据其进行。杂交（C57BL/6 X CBA/He）小鼠在温州医科大学饲养和繁殖。

参考

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5.Lawitts, JA 和 Biggers, JD (1993)。植入前胚胎的培养。方法 Enzymol 225：153-164。
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