材料和试剂

1. RPMI 1640，不含酚红（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：32404014）
2. 胰蛋白酶， TrypLE TM Express 酶（1 × ），无酚红（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：12604013）（储存 4°C）
3. 胎牛血清（FBS）（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：10270106，6%，储存 4°C）
4. GlutaMax （Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：35050061，2 mM，储存 4°C）
5. HEPES缓冲溶液储备1 M（Sigma-Aldrich，目录号：H3375，溶于H 2 O，储存4°C）
6. 无钙成像介质（例如，汉克斯平衡盐溶液（HBSS），不含钙、镁和酚红（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：14175095，储存 4°C，使用预热至 37°C)
7. 在当前协议中测试的细胞
a. MCF7人乳腺癌细胞
b. HeLa人宫颈癌细胞
c. SH-SY5Y 是源自 SK-N-SH 神经母细胞瘤细胞系的三次亚克隆人细胞系
8. FM1-43（Invitrogen，目录号：T3163，1.6 µM，分装 -20°C）
9. FM4-64（Invitrogen，目录号：T13320，2.5 µM，分装 -20°C）
10. 碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：P4864，0.5 µg/mL，储备 1 mg/mL，溶于 H 2 O，储存 4°C）
11. Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，目录号： 861405，2.5 µg/mL，4°C 储存）
12. 细胞成像介质 (CIM)（参见食谱）

设备

1. 细胞培养箱设置在37°C，5% CO 2
2. 35 毫米，1.0 号盖玻片，14 毫米玻璃底，无涂层的 MatTek培养皿（ MatTek Corporation，p35G-1.0-14-C）
3. 共聚焦显微镜配备旋转圆盘、烧蚀激光器和 63 ×水物镜。在本协议中，我们使用以下显微镜和设备：
a. 倒置显微镜 Eclipse Ti -E (Nikon)，带 63 ×水物镜
b. UltraVIEW VoX 旋转盘（珀金埃尔默）
c. 355 nm 紫外烧蚀激光器 (Rapp OptoElectronic )
d. 用于活细胞成像的加热室 (37 °C)

软件

1. Volocity 软件 (PerkinElmers)
2. SysCon 软件 ( Rapp OptoElectronic )
3. Prism (GraphPad Software, Inc) 或 Microsoft Excel (Microsoft)

程序

A. 使用活细胞成像的激光损伤后质膜修复的实时动力学

1. 1 × 10 5 个细胞播种在 35 毫米MatTek成像培养皿中，玻璃底，并让细胞在37 °C的细胞培养箱中粘附过夜。
设置 2 - 3 道菜。根据细胞系，应调整播种细胞的数量，以在实验当天获得大约 50% 的汇合。
2. 可选步骤：用抑制剂预处理细胞，或应用 siRNA 敲低感兴趣的基因。
3. 第二天（实验当天）准备成像介质：在 37°C 下预热细胞成像介质（CIM，参见食谱）。
4. 在预热的 CIM 中制备 FM 染料溶液。
最佳染料浓度因染料和细胞系而异，应进行优化。对于 MCF7 和 HeLa 细胞，1.6 µM 的 FM1-43 效果很好。在本例中，我们在 MCF7 细胞中使用 FM1-43 染料。
注意：根据您的实验设置，也可以使用其他不可渗透的染料，例如 FM4-63、不可渗透的 Hoechst 33258 或 PI。
5. 用预热的 CIM 清洗细胞，并在盘子中加入1-2 mL 的含有 FM 染料的 CIM。
6. 将盘子放在保持在 37°C 的舞台上的显微镜支架中，并设置焦点以可视化与质膜相关的 FM 染料（图 1A；和视频 1 和 2）。我们在配备顶部培养箱的倒置显微镜 Eclipse Ti -E (Nikon) 中使用 63 ×水物镜，以保持稳定的温度。
注意：以下步骤提供了实验的一般概述。细节将根据所使用的显微镜而变化，因此用户应在进行实验之前接受其特定设置的培训。
7. 在任何完整单细胞的质膜内选择一个 1 – 2 µm 的感兴趣区域，将激光定向到该区域，并使用 355 nm 紫外消融激光照射 <4 ns，使用最佳激光功率。应调整仪器的激光功率，以获得可重复且非致命的伤害。
注：
a. 烧蚀激光总是在开始实验之前进行校准。消融激光的设置取决于仪器和细胞系，必须进行优化。在我们的实验室中，我们在系统中对 MCF7 和 HeLa 细胞使用以下设置：2.6% 功率、200 Hz 重复率、脉冲能量 >60 µJ 和脉冲长度 <4 ns。
b. 我们的系统允许制作激光条纹、矩形和斑点损伤。我们始终使用点激光损伤（激光损伤部位由图 1A 中的箭头指示，或视频中的星号），激光设置如上所示。然而，在其他系统中，例如3i激光消融系统，可以随意调整损伤区域。
c. 使用激光时，您应该始终确保激光安全，尤其是在使用脉冲激光时，因为这些激光在每个短脉冲中都可以达到非常高的功率，这使得它们非常危险。一些安全预防措施包括有一个带有激光联锁的孵化室和激光安全护目镜，当存在潜在接触眼睛的风险时应使用这些护目镜。
8. 通过在明场和荧光中每 5 秒成像一次，在受伤前开始，并在受伤后继续 5 分钟，监测修复动力学。
对于阴性对照（即无修复），使用含有 FM 染料的Ca 2+ -free CIM 重复步骤 A4-A8。对每个条件至少 10 个细胞重复步骤 A7 - A8，在三个独立实验中获得。
注意：如果检测与任何预处理相结合，研究人员应包括没有激光损伤的对照细胞样本，以排除单独预处理导致的质膜损伤。
9. 使用倒置显微镜 Eclipse Ti -E (Nikon) 与UltraVIEW配对获取图像 VoX Spinning Disk (PerkinElmer)，使用 63 ×水目标。

数据分析

代表性数据
协议 A 描述了如何通过监测 FM 染料在细胞中的进入来测量激光损伤后质膜修复和活细胞后续修复的动力学。

1. 要量化质膜渗透性（膜完整性的读数），请使用适当的成像软件（例如Volocity ）测量跨时间点的单个细胞水平的细胞内 FM 染料荧光强度。细胞内 FM 染料荧光强度是通过选择细胞内损伤部位的特定感兴趣区域（FM 染料开始进入细胞的区域：图 1A 中白色虚线勾勒的区域）来测量的。通过将每个时间点 (F) 的荧光强度标准化为受伤前的荧光强度 (F 0 ), 计算成像过程中荧光强度 (F/F 0 ) 的变化。每个条件至少应测量 10 个细胞。

图1。响应激光损伤的细胞膜修复实时成像示例。
( A ) 在含有 FM1-43 的培养基中，以及在存在（上图）或不存在（下图）Ca 2+的情况下，MCF7 细胞被紫外激光烧蚀损伤。受损 MCF7 细胞的代表性图像显示细胞内 FM1-43 随着时间的推移（受伤前后）的积累。白色箭头表示损伤部位，而黄色箭头表示 FM1-43 积累。白色虚线勾勒的区域说明了用于 FM1-43 荧光强度量化的区域。参见视频 1 和 2。（ B ）MCF7 细胞中激光损伤后单细胞膜修复动力学的量化，在有或没有 Ca 2+的介质中，测量为 FM1-43 染料荧光强度的变化 (F/F 0 )随着时间的推移，在 FM1-43 染料进入细胞的区域（损伤部位）。黑色箭头表示受伤时间点。比例尺 = 4.6 µm。

2. 荧光强度（F/F 0 ：y 轴）随时间（x 轴）的平均或单个细胞变化（图 1B）。当表示为平均值时，必须考虑从三个独立实验中获得的每个条件至少 10 个细胞，并且必须绘制平均值的标准误差 (SEM)。对于统计分析，计算曲线下面积 (AUC) 分析，然后计算带有 Welch 校正的非配对 t 检验。例如更多细胞的量化，以及表示平均荧光强度的图，请参见Sønder中的图 1A 等。（2021 年）。
3. 在受伤前的不同时间点选择每个条件的代表性图像，以组装一组图像，显示不同条件下 FM 染料的流入（有或没有 Ca 2 + ）（图 1A）。对代表性图像进行注释以演示如何选择感兴趣的区域（图 1A）。

在 MCF7 细胞中的Ca 2+介质中吸收 FM1-43 染料

视频 2 。在 MCF7 细胞中无 Ca 2+的培养基中激光损伤后 FM1-43 染料的摄取

笔记

FM 染料与脂质膜结合，但不会扩散穿过完整的质膜。然而，FM 染料也通过内吞作用被细胞吸收，使得用于测量修复动力学的测定仅适用于短期测定。进行实验的时间尺度取决于所选细胞吸收 FM 染料而没有任何损坏的速度。在我们使用 MCF7 或 HeLa 细胞的实验室中，我们通常只在添加 FM 染料后使用培养皿进行 20-30 分钟的激光损伤实验；在此之后，很难测量受伤后 FM 染料的额外流入量。
对于长期检测，应使用不渗透的 Hoechst 33258 或 PI。该测定还可以与不同的预处理相结合，例如三氟拉嗪 (TFP)，或通过 siRNA 敲除感兴趣的基因。有关检测与不同预处理相结合的示例，请参见Sønder 等。 (2019),海特曼等。（2021）和森德等。（2021 年）。

食谱

1. 细胞成像介质 (CIM)
GlutaMax和 25 mM HEPES的无色 RPMI 1640 。

方案 B：使用玻璃珠涡旋混合机械损伤后的膜完整性

材料和试剂

1. 6 孔细胞培养板或 10 厘米细胞培养皿
2. 埃彭多夫管
3. 猎鹰管
4. 96 孔细胞培养板透明平底
5. 多道移液器
6. RPMI 1640（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号： 11875085）
7. 胎牛血清（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：10270106）（6%，储存 4°C）
8. 汉克斯平衡盐溶液（HBSS），不含钙，不含镁，不含酚红（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：14175095）（储存 4 °C ，使用预热至 37°C )
9. 胰蛋白酶， TrypLE TM Express 酶（1 × ），无酚红（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：12604013）（储存 4°C）
10. DPBS，无钙，无镁（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：14190144）（储存 4°C）
11. 在当前协议中测试的细胞
a. MCF7人乳腺癌细胞
b. HeLa人宫颈癌细胞
c. MDA-MB-231 细胞，源自乳腺癌
12. 425-600 µm 玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号： G8772）（存储 RT）
13. bisBenzimide H 33342 trihydrochloride（以下简称 Hoechst，目录号： 33342）[Sigma-Aldrich，目录号：B2261，6.25 µg/mL，储备液（25 mg/mL），溶于 H 2 O}。 -20°C 长期保存，4°C 短期保存，可稳定保存 1 个月。
14. 碘化丙啶 (PI) [Sigma Aldrich, P4864, 0.25 µg/mL, stock (1 mg/mL), 溶于 H 2 O]。储存于4°C。

设备

1. 平衡
2. 细胞培养箱设置在37°C，5 % CO 2
3. V形水库
4. 涡流混合器
5. 定时器
6. 基于板的明场和荧光成像细胞仪，具有至少两个荧光通道（激发 377/50 和发射 477/22，以及激发 531/40 和发射 629/53），例如Celigo ®成像细胞仪（Brooks Life Science Systems ）。

软件

1. Celigo 软件（布鲁克斯生命科学系统）
2. Prism (GraphPad Software, Inc) 或 Microsoft Excel (Microsoft)

程序

B. 使用玻璃珠涡旋混合机械损伤后的膜完整性

除非另有说明，否则所有细胞培养孵育均应在加湿的 37°C、5% CO 2培养箱中进行。有关协议的流程图，请参见图 2A。
1. 准备 1.5 毫升 Eppendorf 管和250 毫克玻璃珠（425 - 600 µm）。
注意：每种条件下每个细胞系至少准备三个 Eppendorf 管。
2. 根据实验，在 6 孔培养板或 10 厘米培养皿中播种适量的细胞。
注意：细胞在实验当天的汇合度不应超过 80%。
3. 可选步骤：用抑制剂预处理细胞，或对感兴趣的基因进行 siRNA 敲低。
4. 在实验当天，用胰蛋白酶消化感兴趣的贴壁细胞。
a. 从细胞培养皿中取出所有培养基。
b. 用少量不含 Ca 2+和 Mg 2+的 DPBS 清洗贴壁细胞单层一次，以去除任何可能抑制胰蛋白酶作用的残留 FBS。
注意：在不含 Ca 2+ - 和 Mg 2+ -的缓冲盐溶液中洗涤细胞，因为盐溶液中的 Ca 2+和 Mg 2+会导致细胞粘在一起。
c. 向细胞培养物中加入足够的胰蛋白酶，以覆盖贴壁细胞层。
d. 在细胞培养箱中孵育细胞 2-5 分钟。
e. 点击台面上的板底部以去除细胞。
注意：用倒置显微镜检查细胞培养物，以确保细胞被四舍五入并从表面分离。如果细胞没有充分分离，请将细胞培养物放回培养箱中再放置一两分钟。
f. 添加适当的培养基，并重新悬浮细胞。
5. 对细胞进行计数并将它们分成两支 falcon 管，一支用于含有 Ca 2+培养基中的细胞，一支用于无 Ca 2+培养基中的细胞
注意：如果细胞已经用抑制剂或通过 siRNA 敲低感兴趣的基因进行预处理，则应对每种情况进行计数。
6. 将细胞在室温下以 300 × g离心 4 分钟，然后将细胞重新悬浮在培养基中，无论是否含有 Ca 2+ 。将 HEPES 添加到两个 falcon 管中，最终浓度为 25 mM。
7. 7 × 10 4 个细胞与 250 mg 玻璃珠 (425 – 600 µm) 一起装入1.5 mL Eppendorf 管中。
笔记：
a. 应针对不同的细胞系优化细胞数量。需要将适当数量的细胞以 350 – 400 µL 的体积装入玻璃珠。对于 MCF7 和 HeLa 细胞，我们使用 7 × 10 4细胞悬浮液和 250 mg 玻璃珠（425 – 600 µm），将 350 µL 重悬细胞以 200,000 个细胞/mL 的密度加载到玻璃珠上。
b. 作为无修复的阴性对照，包括在玻璃珠上加载 Ca 2+无介质的细胞样品。
8. 在细胞培养箱中孵育管 10 分钟。
注意：在涡旋混合损伤前，将细胞孵育以保持最佳细胞条件，包括温度 (37°C)。
9. 在 96 孔板的各个孔中添加 50 μL 的介质，无论是否带有 Ca 2+ 。
10. 通过以最大速度涡旋混合 0、30 或 60 秒来伤害细胞。
涡旋时间可能需要优化，因为某些类型的细胞比其他类型的细胞更脆弱，并且不同细胞系之间的修复效率也有所不同。最佳的涡旋时间应该在没有任何其他预处理的情况下在含有 Ca 2+的培养基中产生 10-30% 的透化细胞，因为大多数细胞需要能够在这种情况下修复它们的膜损伤。这种平衡是由于需要透化一定数量的细胞以确保细胞已被破坏，但另一方面，当细胞处于其他条件时，透化细胞仍应有增加的空间。膜修复受损的细胞被包括在测定中。
11. 受伤后立即在 96 孔板中每孔板 10,000 个细胞。为每个条件重复三次。用手摇动板以将细胞分布在孔中。
注意：每个 96 孔应包含 50 μL 的培养基和重悬细胞（10,000 个细胞），以及在步骤 B9 中添加的 50 μL 培养基。
12. 在细胞培养箱中孵育 96 孔板 5 分钟，以便细胞修复。
13. 2+的介质中制备 PI 和 Hoechst 33342 染料混合物。
注意：最终浓度应为 0.25 µg/mL PI 和 6.25 µg/mL Hoechst 33342。
14. 小心地将 50 μL 的相应 PI/Hoechst 染料混合物添加到 96 孔板的相应孔中，并在细胞培养箱中孵育5 分钟。
15. 细胞总数（Hoechst 33342 阳性细胞：激发 350 nm，发射 461 nm）和透化细胞数（PI 阳性）确定膜完整性，使用成像细胞细胞仪（例如Celigo ® ）测量膜完整性细胞：每孔激发 535 nm，发射 617 nm）。
Celigo ®是一种多通道成像细胞细胞仪，可用于使用光学显微镜进行全孔活细胞分析。在本实验中，在扫描和分析之前，用可渗透的 Hoechst 33342 染料和不可渗透的 PI 染料标记细胞。细胞仪扫描选定区域，例如选定通道中的 96 孔。然后，该软件可用于识别所选通道中的标记细胞，从而计算总细胞数（Hoechst 阳性细胞）和透化细胞数（PI 阳性细胞）。
注意：在设置实验之前，用户应该在他们的设备上接受特定的培训。

数据分析

代表性数据
协议 B 描述了如何通过涡旋与玻璃珠混合来监测机械性损伤后的膜完整性。

1. PI （透化细胞）和 Hoechst 33342（总细胞）阳性细胞的三次测量的平均值。
2. 通过将 PI 阳性细胞总数与每种条件下的 Hoechst 33342 阳性细胞总数相关联，计算每种条件下透化细胞的百分比。对于统计分析，应至少进行三个独立实验，并绘制标准偏差。有关已应用统计分析的示例，并且该测定与不同的预处理相结合，请参见Heitmann 等。（2021）和森德等。（2021 年）。

图 2。膜完整性测定的示例，在玻璃珠涡旋机械诱导损伤后。
( A ) 协议流程图。 ( B ) 典型的 96 孔格式的膜完整性测定样品设置在含有和不含 Ca 2+的培养基中。 ( C ) MCF7 细胞悬液中的质膜完整性，在有或没有 Ca 2+的培养基中，用玻璃珠暴露于涡流 0、0.5 或 1 分钟。根据含有不可渗透 PI 的细胞数和细胞总数（通过可渗透的 Hoechst 33342 染料检测）计算透化细胞的百分比。数据代表三次测量的平均值，误差条表示 SD 值。最佳涡旋时间是在没有任何其他预处理的情况下，在含有 Ca 2+的培养基中的细胞可产生10-30 % 透化细胞的时间，因为大多数细胞需要能够在这种情况下修复其膜损伤。在这里，1 分钟的涡旋混合是 MCF7 细胞的最佳涡旋时间，因为这会导致在与玻璃珠涡旋混合后，含有 Ca 2+的培养基中大约 12% 的通透细胞。
笔记

该测定还可以与不同的预处理组合，例如，不同生物过程的抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)，其抑制巨胞饮作用，或例如，基因的敲低siRNA 感兴趣。有关检测与不同预处理相结合的示例，请参见Heitmann 等。（2021）和森德等。（2021 年）。

方案 C：使用洋地黄皂苷引起的去污剂损伤后的膜完整性
应该注意的是，洋地黄皂苷透化细胞膜的能力不仅取决于洋地黄皂苷浓度，还取决于每个细胞中洋地黄皂苷分子的总量。因此，洋地黄皂苷应始终以每个细胞相同的体积使用。

材料和试剂

1. 埃彭多夫管
2. 96 孔细胞培养板透明平底
3. 多道移液器
4. RPMI 1640（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，11875085）
5. 胎牛血清（Life Technologies 的 Gibco ® ，通过 Thermo Fisher Scientific 购买，目录号：10270106）（6%，储存 4 °C ）
6. 在当前协议中测试的细胞
a. MCF7人乳腺癌细胞
b. HeLa人宫颈癌细胞
c. NCI-H1299 源自非小细胞肺癌
d. 源自乳腺癌的MDA-MB-231细胞
7. Digitonin (Sigma-Aldrich)，Digitonin Stocks（5 和 50 mg/mL），溶于 H 2 O。储存于 -20°C。洋地黄皂苷通常会沉淀，必须通过加热和偶尔涡旋重新溶解。临用前，将洋地黄皂苷原液加热至 95°C 5 分钟，以溶解沉淀物。
8. Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，目录号： B2261，6.25 µg/mL，储备液（25 mg/mL），溶解在 H 2 O 中。在 -20°C 下长期储存，在 4°C 下短期储存（稳定 1月）。
9. 碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：P4864，0.25 µg/mL，储备液（1 mg/mL），溶于 H 2 O。储存在 4°C。

设备

1. 细胞培养箱设置在37°C，5% CO 2
2. V形水库
3. 涡流混合器
4. 热块
5. 定时器
6. 基于平板的明场和荧光成像细胞仪，至少有两个荧光通道（激发 377/50 和发射 477/22，以及激发 531/40 和发射 629/53），例如Celigo ® Imaging Cytometer (Brooks Life科学系统）

软件

1. Celigo 软件（布鲁克斯生命科学系统）
2. Prism (GraphPad Software, Inc) 或 Microsoft Excel (Microsoft)

程序

C. 使用洋地黄皂苷引起的去污剂损伤后的膜完整性

第 1 部分：确定用于产生大多数细胞能够修复的质膜损伤的最佳洋地黄皂苷浓度（参见图 3A 的协议流程图）。
以下程序对于确定用于产生质膜损伤的最佳洋地黄皂苷浓度是必要的，这种损伤可以在含有 Ca 2+的培养基中被大多数细胞 (~80%) 修复，无需任何预处理。该程序应定期执行，因为试剂（例如，毛地黄皂苷原液）和细胞条件可能会随时间而变化。执行此程序可确保受损细胞数量的一致性以及所得结果的可重复性。该程序应分别对每个细胞系进行。

1. 在 96 孔板中的 100 µL 培养基中每孔接种6 × 10 3 个细胞，并让细胞在 37°C 的细胞培养箱中粘附过夜。制作两块板：一块板用于确定最佳洋地黄皂苷浓度，另一块板用于测量膜完整性。
调整每个细胞系的每孔细胞数，因为细胞在实验当天需要 50% 融合。
2. 立即使用前，将 digitonin 库存 (5 µg/µL) 加热至 95 °C 5 分钟以溶解任何沉淀物。
注意：洋地黄皂苷通常会沉淀，需要通过加热重新溶解，偶尔涡旋混合。
3. 在预热的培养基 ( 37 ° C ) 中制备以下十种洋地黄皂苷稀释液：0、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30 和 100 µg/mL 洋地黄皂苷，
注意：100 µg/mL 的洋地黄皂苷溶液用于细胞的总透化/完全透化。
4. 每口井添加 100 μL 的 digitonin 稀释液，一式三份。将洋地黄皂苷溶液添加到井的一侧，以避免贴壁细胞脱离。
5. 37 °C的细胞培养箱中孵育30 分钟。同时，用 PI 和Hoechst 33342染料稀释液制备培养基；最终浓度应为：0.25 µg/mL PI 和 6.25 µg/mL Hoechst 33342。
6. 小心地将 50 μL 的 PI/Hoechst 染料混合物添加到 96 孔板中的每个孔中，并在细胞培养箱中孵育 5 分钟。
7. Celigo ®测量膜完整性流式细胞仪，通过测量每孔的总细胞数 [Hoechst 33342 (激发 350 nm，发射 461 nm) 阳性细胞] 和透化细胞数 [PI (激发 535 nm，发射 617 nm) 阳性细胞]。
8. 确定最佳的洋地黄皂苷浓度。
a. 计算不同条件下 PI 阳性细胞的百分比。使大约 80% 的细胞能够修复 [即，大约 20% 的透化细胞（PI 阳性）] 的洋地黄皂苷浓度是最佳的。
在此示例中，MCF7 细胞用地高宁处理 30 分钟，最佳地高宁浓度为 7.5–10 µg/mL（参见图 3C）。

第 2 部分：使用洋地黄皂苷测量去污剂诱导损伤后的膜完整性
2+的培养基中用洋地黄皂苷处理的细胞的膜完整性。该测定还可以与不同的预处理相结合，例如三氟拉嗪 (TFP)，或通过 siRNA 敲低感兴趣的基因。有关检测与不同预处理相结合的示例，请参见Sønder 等。（2019）和海特曼等。（2021 年）。有关协议的流程图，请参见图 4A。
9. 可选步骤：用抑制剂预处理细胞。
10. 2+的介质和无 Ca 2+的介质中制备洋地黄皂苷溶液（使用在步骤 C8 中获得的最佳浓度）。我在使用前立即将洋地黄皂苷原液 (5 µg/µL) 加热至 95 °C 5 分钟，以溶解任何沉淀物。
备注：
a. 洋地黄皂苷通常会沉淀，需要通过加热和偶尔涡旋混合来重新溶解。
b. 作为阴性对照（即无修复），包括细胞在无 Ca 2+培养基中的样品。
11. 2+的 HBSS 中洗涤细胞两次。在最后一次洗涤中，仅将不含 Ca 2+ 的 HBSS 添加到将在不含 Ca 2+的培养基中用洋地黄皂苷处理的孔中。其余的孔应包含正常的培养基。
12. 如步骤 C4 中所述，每口井添加 100 μL 的每个 digitonin 稀释液，一式三份。将洋地黄皂苷溶液添加到井的一侧，以避免贴壁细胞脱离。
13. 37 °C的细胞培养箱中孵育30 分钟。同时，在含有和不含 Ca 2+的介质中制备PI 和 Hoechst 33342 染料稀释液。最终浓度应为 0.25 µg/mL PI 和 6.25 µg/mL Hoechst 33342。
14. 小心地将 50 μL 的相应 PI/Hoechst 染料混合物添加到 96 孔板的相应孔中，并在细胞培养箱中孵育 5 分钟。
15. 通过使用总细胞数（ Hoechst 33342阳性细胞：激发 350 nm，发射461 nm ）和透化细胞数（PI 阳性细胞：每孔激发 535 nm，发射 617 nm）。
Celigo ®是一种多通道成像细胞细胞仪，可用于使用光学显微镜进行全孔活细胞分析。在本实验中，在扫描和分析之前，用可渗透的 Hoechst 33342 染料和不可渗透的 PI 染料标记细胞。细胞仪扫描选定区域，例如选定通道中的 96 孔。然后，该软件可用于识别所选通道中的标记细胞，从而计算总细胞数（Hoechst 阳性细胞）和透化细胞数（PI 阳性细胞）。
注意：在设置实验之前，用户应该在他们的设备上接受特定的培训。

数据分析

代表性数据
协议 C 描述了如何在洗涤剂洋地黄皂苷引起化学损伤后监测细胞膜的完整性。首先，确定产生可由细胞修复的质膜损伤的最佳洋地黄皂苷浓度。

1. 计算每个条件下 PI（透化细胞）和 Hoechst（总细胞）阳性细胞的三次测量的平均值。
2. 通过将 PI 阳性细胞总数与 Hoechst 阳性细胞总数相关联，计算每种条件下透化细胞的百分比。对于统计分析，应至少进行三个独立实验，并绘制标准偏差。有关已应用统计分析以及将测定与预处理相结合的示例，请参见Heitmann 等。（2021 年）。
3. 2+的情况下，在毛地黄皂苷处理之前和之后，Hoechst 33342 和 PI 染料在单个细胞水平上的结合（图 4D）。

图 3。优化实验示例，用于确定使用 MCF7 细胞进行膜完整性测定的最佳洋地黄皂苷浓度。
( A ) 协议流程图。 ( B ) 典型的 96 孔格式的膜完整性测定样品设置，用于确定最佳的洋地黄皂苷浓度。将每孔6 × 10 3 个MCF7 细胞接种在 96 孔板中。 ( C ) 用指定浓度的洋地黄皂苷处理的 MCF7 细胞中的质膜完整性，或在含有 Ca 2+的培养基中未处理 30 分钟。对于每种条件，使用细胞不可渗透的PI和可渗透的Hoechst 33342染料(即，通过计算PI阳性细胞相对于Hoechst 33342阳性细胞总数)来测定透化细胞的百分比。数字代表三次测量的平均值，误差条表示 SD 值。所有细胞均已在30 µg/mL 洋地黄皂苷下透化。确定了可被大多数细胞修复的质膜损伤（约 80%）的洋地黄皂苷浓度。在这里，7.5 – 10 µg/mL 是 MCF7 细胞的最佳浓度。

图 4。洋地黄皂苷诱导损伤后膜完整性测定的示例。
( A ) 协议流程图。 ( B ) 典型 96 孔格式的膜完整性测定样品设置在不含和含 Ca 2+的培养基中。 ( C ) 用 7.5 或 10 µg/mL 洋地黄皂苷处理的 MCF7 细胞中的质膜完整性，或在有或没有 Ca 2+的培养基中未处理 30 分钟。使用细胞不可渗透的 PI 和可渗透的 Hoechst 33342 染料测定透化细胞的百分比，并通过将 PI 的测量值与每种条件下的 Hoechst 阳性细胞的测量值相关联来计算。数字代表三次测量的平均值，误差条表示 SD 值。 (D) 具有代表性的图像，显示在存在和不存在 Ca 2+的情况下，Hoechst 33342 和 PI 染料在单细胞水平上的掺入，在地高辛处理前后（7.5 µg/mL 地高辛处理 30 分钟）。比例尺 = 500 µm。

笔记

在使用影响细胞胆固醇含量的治疗或具有类似去污剂特性的药物（如阳离子两亲性药物 (CAD)）时，必须小心使用上述方法（Petersen等人，2013 年），因为此类治疗可能会干扰洋地黄皂苷的破坏能力。协议 C 描述了如何测量使用洋地黄皂苷引起的洗涤剂损伤后的膜完整性。然而，该协议也可以调整以研究毒素引起的损伤后的膜完整性，方法是用 SLO 或另一种成孔毒素治疗代替地黄皂苷治疗。

致谢

这里介绍的协议在我们最近的论文中得到应用（ Sønder 等人，2021；海特曼等人，2021；和森德等人，2019）。我们感谢丹麦癌症协会研究中心膜完整性小组的现任和前任同事优化和微调这里介绍的方法。此外，我们感谢膜修复领域的同事和合作者分享他们的方法和知识，特别是儿童国家研究所的 Jyoti K. Jaiswal。这项工作得到了丹麦独立研究委员会 (6108-00378A、9040-00252B)、诺和诺德基金会 (NNF18OC0034936) 和丹麦癌症协会科学委员会 (R90-A5847-14-S2、R269-A15812) 的支持。

利益争夺

作者没有什么可透露的。

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