材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Corning， Axygen ，目录号：T-300、T-200-Y 和 T-1000-B）
2. 血清移液器（Corning，Falcon，目录号：357543、357551 和 357525）
3. 培养皿，100 × 15 mm（ Fisherbrand ，目录号：FB0875712）
4. 组织培养处理的聚苯乙烯（Corning，Falcon，目录号：353043 [12 孔板]、353046 [6 孔板]、353108 [T-25 烧瓶]、353136 [T-75 烧瓶]和 353112 [T- 175烧瓶])
5. 锥形管，15 mL和 50 mL（Corning，Falcon，目录号：352096 和 352070）
6. 圆底试管，5 mL（Corning，Falcon，目录号：352058）
7. Steritop Quick Release（0.22 µm 真空过滤器； MilliporeSigma ，目录号：S2GPT05RE）
8. Millex -GP 注射器过滤器单元（0.22 µm 注射器过滤器； MilliporeSigma ，目录号：SLGP033RS）
9. 注射器，30 mL，BD Luer -Lok 尖端（Becton，Dickinson and Company，目录号：309650）
10. 细胞过滤器，40 µm 和 100 µm（ Fisherbrand ，目录号：22-363-547 和 22-363-549）

试剂
1. Milli-Q 水（MQH 2 O；来自 Milli-Q 直接水净化系统，参见设备）
2. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水，不含氯化钙和氯化镁（PBS –/– ； MilliporeSigma ，目录号： D8537）
3. 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA； MilliporeSigma ，目录号： E513）
4. 氢氧化钠（NaOH； MilliporeSigma ，目录号： S5881）
5. 牛血清白蛋白溶液，35％（35％BSA储备； MilliporeSigma ，目录号： A7979）
6. 氯化铵（ NH 4 Cl； MilliporeSigma ，目录号： A9434）
7. 碳酸氢钾（ KHCO 3 ； MilliporeSigma ，目录号： 60339）
8. 碳酸氢钠 ( NaHCO 3 ; MilliporeSigma ，目录号： S5761）
9. Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRB 粉末； MilliporeSigma ，目录号： K4002）
10. D-（+）-葡萄糖（ MilliporeSigma ，目录号： G7021）
11. 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES； MilliporeSigma ，目录号： H4034）
12. 来自溶组织梭菌的胶原酶，II型（胶原酶，II型； MilliporeSigma ，目录号：C6885）
13. 胰蛋白酶-EDTA 溶液（ MilliporeSigma ，目录号：T4049）
14. TrypLE Express（Gibco，目录号：12604013）
15. 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit （Lonza，目录号：CC-3162）
16. 生物素化抗 CD31 抗体（美天旎 Biotec ，目录号：130-119-893)
17. CELLection Biotin Binder Kit（抗生物素Dynabeads ；Invitrogen，目录号：11533D）
18. Dynabeads CD45（抗-CD45 Dynabeads ；Invitrogen，目录号：11153D）
19. 0.5 M EDTA 库存（见配方）
20. 磁铁辅助细胞分选 (MACS) 缓冲液（参见食谱）
21. 红细胞裂解缓冲液（见配方）
22. KRB 股票（见食谱）
23. 胶原酶溶液（见食谱）

设备

1. 移液器（例如，Eppendorf，目录号： 3123000900）
2. 移液枪（例如， Hirschmann Laborgeräte ，目录号： 9907200）
3. Scoopula（例如， Fisherbrand ，目录号：14-357Q）
4. 组织钳，1 × 2 齿，5.75 英寸（例如，Integra LifeSciences ，目录号： ST6-44）
5. 手术剪刀，直的，锋利的，5.75 英寸（例如，Integra LifeSciences ，目录号： 5-SC-16）
6. 分析天平（例如，Mettler Toledo，目录号： 1115010657）
7. pH 计（例如., VWR, SB20 sympHony ；已停产）
8. 加热磁力搅拌板（例如，IKA Works，目录号： 0005020001）
9. 模拟涡流混合器（例如，VWR，目录号： 10153-808）
10. Milli-Q 直接水净化系统（例如， MilliporeSigma ，目录号：ZR0Q008WW）
11. 生物安全柜（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号： 1375）
12. 真空泵（例如， MilliporeSigma ，目录号：WP6111560）
13. CO 2培养箱（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号： 3310）
14. 离心机（例如，Eppendorf，目录号： 022628113）
15. 透射光显微镜（例如，Leica Microsystems，目录号： 090-135.001）
16. 水浴（例如，VWR，目录号： 10128-128）
17. 孵育的振动板（例如，VWR，目录号： 97009-894）
18. 磁力搅拌棒（例如， Fisherbrand ，目录号： 14-512-127）
19. 烧杯，1 L（例如， Fisherbrand ，目录号： FB1001000）
20. DynaMag-5 磁铁（Invitrogen，目录号： 12303D）

程序

这里描述的 HAMVECs 的免疫磁性采集是一个两阶段的过程，包括它们与脂肪的分离和随后的培养物的富集(图 1 )。它包括四个主要步骤： (A) 从脂肪组织中收集基质血管部分； (B) 从基质血管部分中分离 HAMVEC； (C)培养HAMVEC； (D) 丰富 HAMVECs 的培养物。本文描述的免疫磁性微粒的使用是程序有效性的关键（见注释）。该程序的开发是为了能够从整个皮下腹部白色脂肪组织中获取HAMVEC ，但可以很容易地应用于脂肪抽吸。

图 1. 人体脂肪组织内皮细胞的免疫磁性采集。
示意图描述了分离和富集 HAMVEC 的主要步骤，以及免疫磁性微粒具体使用的基本原理。改编自 Antonyshyn等人。（2021 年）。

A. 从脂肪组织中收获基质血管部分（持续时间：2-3 小时）

1. 组织a、b之前使用水浴将其加热至 37 °C 。此时也可将胰蛋白酶-EDTA溶液和内皮细胞生长培养基-2放入水浴中预热至37 °C 。 MACS 缓冲液（见配方）应储存在 4 °C的冰箱中； PBS –/–和红细胞裂解缓冲液（参见配方）可在室温（~21 °C ）下储存。
a. 建议将胶原酶溶液以 2 的倍数制备以帮助平衡离心机，并且将 HAMVEC 从源自至少四种胶原酶溶液（对应于约 60 cm 3脂肪）的基质血管部分中分离出来，以减少对他们长期的文化介导的扩张（表1 ）。
b. 可用于处理的脂肪组织的体积可以根据其质量（使用天平测量）来估计，其中脂肪的近似密度为 0.9 g/cm 3 （Abe等人，2021 年）。该估计可用于帮助确定应制备的胶原酶溶液的数量（表 1 ）。

表 1. 从人体脂肪组织中分离内皮细胞的指南。
从给定量的脂肪组织中获得的 HAMVECs 的初始产量，在它们的富集和随后的培养介导的扩张之前，以及需要准备的相应数量的胶原酶溶液。从 60–120 cm 3的脂肪中分离 HAMVEC是最具成本效益的。

脂肪组织
(厘米3 ) 胶原酶溶液
（不。）电镀 HAMVEC
（初级培养容器）传代 HAMVEC
（第二个培养容器）
30 2 2 × 12 孔板孔 2 × 6 孔板孔
60 4 1 × 6 孔板孔 1 × T-25 烧瓶
120 8 1 × T-25 烧瓶 1 × T-75 烧瓶
360 24 1 × T-75 烧瓶 1 × T-175 烧瓶

2. 使用手术剪刀和组织钳从任何皮肤上切除脂肪组织（图 2 ）。用 PBS –/–冲洗组织，然后在培养皿中用操作剪刀切碎。使用勺子，将 15 cm 3的切碎组织添加到预热的胶原酶溶液a中。在 37 °C下使用孵育的摇床板在持续、温和的搅拌下孵育溶液 60 分钟。
a. 添加的脂肪组织的体积是根据其对胶原酶溶液的位移来确定的。具体来说，将切碎的组织添加到 25 mL 的胶原酶溶液中，以在每个 50 mL 锥形管中达到 40 mL 的总体积 - 在使用刻度评估体积之前，倒置锥形管以将切碎的组织与胶原酶溶液混合标记在锥形管上。

图 2. 从人体脂肪组织中收集基质血管部分。
示意图和代表性照片描绘了从整个皮下腹部白色脂肪组织中采集基质血管部分所涉及的工作流程。

3. 在 1,200 × g和 21 °C 下将消化的组织离心5 分钟。使用 25 mL 血清移液器丢弃浮力脂肪细胞和油；可以根据需要吸取上清液——注意不要破坏构成基质血管部分的松散颗粒细胞和组织（图 2 ）。将沉淀重悬于 20 mL PBS –/ –中冲洗沉淀，在 1,200 × g和 21 °C 下离心5 分钟，然后弃去上清液。
4. 将颗粒重新悬浮在 20 mL 的预热胰蛋白酶-EDTA 溶液中，并在 37 °C下在恒定、温和的搅拌下孵育 15 分钟。
5. 加入 20 mL 预热的内皮细胞生长培养基 2 ，在 1,200 × g和 21 °C 下离心5 分钟，弃去上清液。通过将颗粒重新悬浮在 20 mL 的 PBS –/–中来冲洗颗粒，在 1,200 × g和 21 °C 下离心5 分钟，然后丢弃上清液。
6. °C下在持续、温和的搅拌下孵育 10 分钟。
7. 在 1,200 × g和 21 °C 下将溶液离心5 分钟，弃去上清液，然后将颗粒重新悬浮在 20 mL 的 PBS –/–中。按此顺序通过 100 μm 和 40 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。滤液包含基质血管部分，立即准备用于磁辅助细胞分选。

B. 分离 CD45 – CD31 + HAMVEC（图3） a 、b （持续时间：1.5–3 小时）

a. 由于脂肪组织中白细胞的高流行率及其表达特征性内皮标志物（包括 CD31）的能力，在阳性选择 CD45 - CD31 + HAMVEC 之前，基质血管部分已耗尽 CD45 +白细胞。
b. CD45 – CD31 – ASC 是该程序的副产品，可以保留用于下游研究（见注释）。

图 3.通过磁辅助细胞分选从基质血管部分中分离内皮细胞。
示意图描述了用于从酶消化脂肪组织的基质血管部分中分离 HAMVEC 的磁辅助细胞分选策略。

1. 将从两种胶原酶溶液中提取的滤液汇集到一个 50 mL 锥形管中。在 300 × g和 4 °C 下离心细胞悬液 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL 预冷 MACS 缓冲液中。
2. 涡旋抗 CD45 Dynabeads ≥30 s，然后将 50 μL 等分到 5 mL 圆底试管中。通过将抗 CD45 Dynabeads悬浮在 1 mL 的预冷 MACS 缓冲液中并使用 DynaMag-5 磁铁保留Dynabeads ，同时丢弃上清液a来冲洗抗 CD45 Dynabeads 。
a. Dynabeads将被快速拉向 DynaMag-5 磁体 - 再等待约 30 秒，然后丢弃上清液。
3. Dynabeads的 5 mL 圆底试管中，通过移液轻轻混合，并在 4 °C下孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻地轻弹试管底部，搅拌一次悬浮液。
4. 将 900 μL 的预冷 MACS 缓冲液添加到细胞悬浮液中，并通过移液轻轻混合，然后使用磁铁将 CD45 +白细胞与 CD45 -细胞分开。保留含有 CD45 细胞的上清液，将其转移到新的 5 mL 圆底试管中。将Dynabead结合的CD45 +部分重新悬浮在 1 mL 预冷 MACS 缓冲液中，重复磁辅助细胞分选，并汇集 CD45 – 分数a .
a. CD45 +白细胞可以丢弃或保留以供进一步研究。
5. × g离心 CD45 –细胞和 4 °C 5 分钟，丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在 100 μL 的预冷 MACS 缓冲液中。将生物素化的抗 CD31 抗体添加到细胞悬浮液中，以达到 5 μg/mL（取决于批次）的最终浓度，并在 4 °C下孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻地轻弹试管底部，搅拌一次悬浮液。
6. 在悬浮液中加入 3 mL 预冷 MACS 缓冲液，并通过移液器轻轻混合，然后以 300 × g离心和 4 °C 5分钟。丢弃上清液并将细胞重新悬浮在 100 μL 的预冷冻 MACS 缓冲液中。
7. 涡旋抗生物素Dynabeads ≥30 秒，然后将 25 μL 等分到 5 mL 圆底试管中。通过将 Dynabeads 悬浮在 1 mL 的预冷 MACS 缓冲液中并使用磁铁保留Dynabeads ，同时丢弃上清液来冲洗Dynabeads 。
8. Dynabeads的 5 mL 圆底试管中，通过移液轻轻混合，并在 4 °C下孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻地轻弹试管底部，搅拌一次悬浮液。
9. 在细胞悬浮液中加入 900 μL 的预冷 MACS 缓冲液，并通过移液轻轻混合，然后使用磁铁将 CD45 - CD31 + HAMVEC 从 CD45 - CD31 - ASC 中分离出来。吸出含有 CD45 – CD31 –的上清液分数a并保留与Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC。
a. CD45 – CD31 –部分可以丢弃或保留以建立 ASC 的原代培养物。
10. 将Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 重新悬浮在 1 mL 的预冷 MACS 缓冲液中，重复磁辅助细胞分选，并丢弃上清液。再次重复此步骤。在 200 µL 预热的内皮细胞生长培养基 2 中重新悬浮Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 。
11. CELLection Biotin Binder Kit 中重构 DNase I ，方法是将 300 µL 释放缓冲液组分 II 添加到每个小瓶释放缓冲液组分 I a中。将 4 µL DNase I 添加到与Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 中，并在 37 °C下孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻轻弹试管底部搅拌悬浮液。
a. 将重组的 DNase I 储存在 -20 °C的 10 μL 等分试样中，以备将来使用。
12. 在加入 800 μL 预热的内皮细胞生长培养基-2之前，通过移液轻轻混合细胞悬浮液，并使用磁铁将Dynabeads与 CD45 - CD31 + HAMVEC 分开。保留上清液以建立 HAMVECs 的原代培养物。

C. 建立、监测和扩大 CD45 – CD31 +的原代培养物 HAMVECs a （持续时间：~7 天）

a. – CD31 – ASCs的原代培养物也可用于下游研究（见注释）。
1. 将 CD45 – CD31 + HAMVEC以约 25,000 个细胞/cm 2的密度在预热的内皮细胞生长培养基 2中铺板到组织培养处理过的聚苯乙烯上，并在 37 °C 、5% CO 2的相对温度下保持培养湿度为 85% a,b 。
a. 表 1描述了推荐的原代培养容器，HAMVEC 可以根据其来源的脂肪组织数量进行电镀。
b. CD45 – CD31 – ASC 也可以以 25,000 个细胞/ cm 2的密度接种到经过培养处理的聚苯乙烯上，并在相同条件下在您选择的培养基中培养。

图 4. 监测人类脂肪组织衍生的微血管内皮细胞的原代培养物是否有基质细胞过度生长的迹象。
代表性显微照片描绘（ A ）HAMVEC 的特征性内皮鹅卵石样形态和 ASC 的纺锤形、成纤维细胞样形态，以及（ B-D ）ASC 对原代培养物的不同程度污染。比例尺代表 200 µm。改编自 Antonyshyn等人。（2021 年）。

2. 每隔一天更换一次内皮细胞生长培养基-2，监测原代培养物的融合和基质细胞污染的迹象（图4 ） a 。一旦培养物达到约 90% 的融合，细胞就可以传代到更大的培养容器中——除非它们被 ASCs 过度生长是相当大的b 。
a. HAMVEC 在约 4 天后呈现出特征性的内皮鹅卵石样形态，而来自磁体辅助细胞分选过程的残留 ASC 呈现出纺锤形、成纤维细胞样形态（图 4A ）。
b. 在此阶段，HAMVEC 菌落之间存在少量污染性 ASC 是典型的，不应引起关注（图 4B，C ）。然而，如果 ASC 正在过度增殖并超过 HAMVEC（图 4D ），则直接进行它们的富集（步骤 D）而不是传代（步骤 C3 - C4）。
3. 吸出培养基，用 PBS –/–冲洗细胞，然后在TrypLE Express 中 37 °C孵育 10 分钟以收获细胞。在细胞悬液中加入等体积的预热内皮细胞生长培养基 2 ，将其转移到锥形管中，并在 300 × g和 21 °C 下离心5 分钟。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在预热的内皮细胞生长培养基 2 中，然后以 1:2–1:3 的比例将它们重新铺板到经过培养处理的聚苯乙烯上b 。
a. 点击培养容器的侧面以帮助释放 HAMVEC。使用血清移液管在培养表面反复分配培养基也有助于恢复细胞。
b. 表 1提供了推荐的培养容器，HAMVEC 可以根据其原代培养容器重新电镀到这些培养容器上。
4. 将 HAMVECs 保持在培养中，直到它们达到约 90% 的汇合度，之后可以丰富它们的培养物以消除任何残留的 ASC。

D. 通过磁辅助细胞分选丰富 CD45 – CD31 + HAMVECs 的原代培养物（持续时间：1.5–2 小时）

1. 吸出培养基，用 PBS –/–冲洗细胞，然后在TrypLE Express 中 37 °C孵育 10 分钟以收获细胞。在细胞悬液中加入等体积预热的内皮细胞生长培养基 2 ，将其转移到锥形管中，在 300 × g和 21 °C 下离心5 分钟，弃去上清液。在 PBS –/–中重悬细胞，在 300 × g和 4 °C 下离心5分钟，弃去上清液。
2. 将细胞重新悬浮在 100 μL 的预冷冻 MACS 缓冲液中，并将细胞悬浮液转移到 5 mL 圆底试管中。将生物素化的抗 CD31 抗体添加到细胞悬浮液中，以达到 5 μg/mL（取决于批次）的最终浓度，并在 4 °C下孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻地轻弹试管底部，搅拌一次悬浮液。
3. 在悬浮液中加入 3 mL 预冷 MACS 缓冲液，并通过移液器轻轻混合，然后以 300 × g离心和4 °C 5分钟。丢弃上清液并将细胞重新悬浮在 100 μL 的预冷冻 MACS 缓冲液中。
4. 涡旋抗生物素Dynabeads ≥30 秒，然后将 25 μL 等分到 5 mL 圆底试管中。通过将 Dynabeads 悬浮在 1 mL 预冷 MACS 缓冲液中并在丢弃上清液时使用磁铁保留Dynabeads来冲洗Dynabeads 。
5. Dynabeads的 5 mL 圆底试管中，通过移液轻轻混合，并在 4 °C下孵育 20 分钟。每 5 分钟轻轻地轻弹试管底部，搅拌一次悬浮液。
6. 在细胞悬浮液中加入 900 μL 的预冷 MACS 缓冲液，并通过移液轻轻混合，然后使用磁铁将 CD45 - CD31 + HAMVEC 从 CD45 - CD31 - ASC 中分离出来。丢弃含有污染 ASC 的上清液。
7. 将Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 重新悬浮在 1 mL 的预冷 MACS 缓冲液中，重复磁辅助细胞分选，并丢弃上清液。再次重复此步骤。在 200 µL 预热的内皮细胞生长培养基 2 中重新悬浮Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 。
8. 将 4 µL 重组的 DNase I 添加到Dynabead结合的CD45 – CD31 + HAMVEC 中，并在 37 °C下孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻轻弹试管底部搅拌悬浮液。
9. 在加入 800 μL 预热的内皮细胞生长培养基-2之前，通过移液轻轻混合细胞悬浮液，并使用磁铁将Dynabeads与 CD45 - CD31 + HAMVEC 分开。保留上清液以建立 HAMVECs 的培养物。
10. 以 1:1 的比例将 CD45 – CD31 + HAMVEC 重新铺板到 t issue 培养处理的聚苯乙烯上（即，将 HAMVEC 接种到与它们来源相同的表面积的 t issue 培养处理的聚苯乙烯上）以建立纯化的培养物的HAMVEC。 HAMVEC 现在可以扩展或用于下游调查a 。
a. 虽然一轮富集通常足以获得纯度≥98% 的 CD45 – CD31 + HAMVEC，但应监测其培养物是否有基质细胞污染和过度生长的迹象。在后者的情况下，可以进行另一轮浓缩（步骤 D）。

数据分析

如前所述（Antonyshyn等人，2021），HAMVEC 的纯度应在其下游使用之前通过流式细胞术进行表征。 A 纯度≥98% CD45 – CD31 + 足以建立暂时稳定的 HAMVECs 培养物，可以扩大 >10 倍种群并在汇合处维持至少 28 天而不会被 ASCs 过度生长（图 5 ）。 HAMVECs 表现出内皮的形态、分子和功能特征，但与来自不同血管床的内皮细胞相比，仍保留独特的蛋白质组学特征（图 6 ）；也就是说，使用这种两阶段磁辅助细胞分选程序分离的 HAMVEC 至少部分保留了它们的内皮表型以及器官特异性特化。

图 5. 纯度≥98% 的人脂肪组织衍生的微血管内皮细胞培养物至少 28 天没有基质细胞过度生长。
( A ) CD45 - CD31 + HAMVECs 在人皮下腹部白色脂肪组织的基质血管部分中的患病率以及使用两阶段磁辅助细胞分选程序建立的培养物纯度。 ( B ) 纯度≥98% 的 HAMVECs 培养物与纯度为 90% 的培养物的时间稳定性。改编自 Antonyshyn等人。（2021 年）。

图 6. 人类脂肪组织衍生的微血管内皮细胞表现出内皮的形态、分子和功能特征，但与来自不同血管床的内皮细胞相比，仍保留独特的蛋白质组学特征。
( A ) HAMVECs 表现出特征性内皮鹅卵石样形态，并表达 CD31、血管内皮 (VE)-钙粘蛋白和血管性血友病因子 ( vWF )。 HAMVECs 还具有特征性的内皮功能，包括 ( B ) 乙酰化低密度脂蛋白 ( AcLDL ) 摄取和 ( C ) 凝胶基底提取物中的血管生成发芽。 ( D ) HAMVECs 的蛋白质表达谱将它们与来自不同血管床的内皮细胞区分开来，如真皮、脐静脉和冠状动脉。改编自 Antonyshyn等人。（2021 年）。

笔记

1. 执行此程序时应采用标准无菌操作。
2. 免疫磁性微粒的大小和结合部分对于这种磁辅助细胞分选程序的功效是不可或缺的，因此必须小心获取和使用本文所述的相关试剂（参见试剂和程序）。在细胞分选过程的标记部分，模态直径≤3.9 µm 的免疫磁性微粒很容易被 ASC 吸收，而那些直径 ≥4.4 µm 的免疫磁性微粒可以被培养中的 ASC 内化（Antonyshyn等人，2021）。因此，该协议采用的免疫磁性微粒的模态直径为 4.8 μm，可减轻 ASC 在细胞分选过程的标记部分对其非特异性吸收，并通过可切割的 DNA 接头与抗体结合，从而使从原代培养物中排除超顺磁性微粒，它们可以更容易地被任何残留的 ASC 内化。这对于通过磁辅助细胞分选有效分离和富集 HAMVEC 是必不可少的。
3. 如果 CD45 – CD31 – ASC 被保留用于下游研究，则应根据国际脂肪治疗与科学联合会和国际细胞治疗学会( Bourin)制定的指南验证其免疫表型、克隆能力和多能性。等。 , 2013), 如前所述 (Antonyshyn et al. , 2019)。

食谱

1. 0.5 M EDTA 库存
将 EDTA 添加到 250 mL 的MQ H 2 O 中，使用 NaOH 将 pH 调节至 8.0，并在加热 (60 ° C ) 下搅拌溶解，然后加入MQ H 2 O 以达到 500 mL 的最终体积。通过 0.22 µm 真空过滤器消毒并在室温下储存。
试剂最终浓度数量
MQ H 2 O 不适用 ~406.94 毫升
乙二胺四乙酸 0.5M 93.06 克
全部的不适用 500 毫升

2. 磁铁辅助细胞分选 (MACS) 缓冲液
在添加无菌 0.5 M EDTA 库存和无菌 35% BSA 库存之前，从无菌 500 mL 瓶中取出 9.14 mL 的 PBS –/– 。储存在 4 °C 。
试剂最终浓度数量
PBS –/– 不适用 491.86 毫升
0.5 M EDTA 库存 2毫米 2 毫升
35% BSA 库存 0.5% 7.14 毫升
全部的不适用 500 毫升

3. 红细胞裂解缓冲液
将 KHCO 3 、NH 4 Cl 和 0.5 M EDTA 库存溶解在 490 mL 的 MQH 2 O 中，然后用 MQH 2 O补足以达到 500 mL 的最终体积。通过 0.22 µm 真空过滤器消毒并在室温下储存。
试剂最终浓度数量
MQH 2 O 不适用 ~495.28 毫升
0.5 M EDTA 库存 0.1 毫米 100 µL
碳酸氢钾3 10毫米 0.5克
NH 4氯 0.154 米 4.12 克
全部的不适用 500 毫升

4. KRB 股票
NaHCO 3和一份 KRB 粉末溶解在 1 L MQH 2 O 中。通过 0.22 µm 真空过滤器消毒并在室温下储存。
试剂最终浓度数量
MQH 2 O 不适用 1升
KRB粉 1 × 1 份
碳酸氢钠3 15毫米 1.26 克
全部的不适用 1升

5. 胶原酶溶液
将胶原酶、HEPES 和葡萄糖添加到 50 mL 锥形管中，并在 -20 °C 下储存直到需要。准备好使用时，溶解在 KRB 库存中，添加 35% BSA 库存，并通过 0.22 µm 注射器过滤器进行消毒。在加入切碎的组织之前，使用水浴加热至 37 °C 。
*注：胶原酶的最终浓度反映了将约 15 cm 3的碎脂肪组织添加到溶液中后，最终体积为 40 mL。
试剂最终浓度数量
KRB 股票不适用 23.57 毫升
35% BSA 库存 20 毫克/毫升 1.43 毫升
D -( +)-葡萄糖 3毫米 13.52 毫克
HEPES 25毫米 148.9 毫克
胶原酶，II 型 2 毫克/毫升* 40毫克
全部的不适用 25 毫升

致谢

这项工作由加拿大卫生研究所资助（赠款号 230762 和 426275）。 Antonyshyn等人先前描述了该协议的开发和验证。（2021），采集基质血管部分的程序改编自 Flynn等人。（2006 年）。

利益争夺

作者没有利益冲突要披露。

伦理

经大学健康网络（加拿大安大略省多伦多市；机构研究伦理委员会批准号 13-6437-CE）接受乳房重建手术的患者知情同意，获得皮下腹部白色脂肪组织。

参考

Abe, T., Thiebaud , RS 和Loenneke , JP (2021)。婴儿脂肪组织密度和脂肪含量的神秘值：MRI 测量的身体成分研究。儿科水库90：963-965 。
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