材料和试剂
A.材料
按照标准方法从大肠杆菌中纯化重组 FT 蛋白( Susila et al. , 2021 )。磷脂和半乳糖脂获自 Sigma-Aldrich 或 Avanti Polar Lipids（表 1）。

表 1. 本研究中使用的脂质
脂质缩写小贩目录编号
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸DPPAAvanti 极性脂质830855P
1,2-二棕榈酰-sn -glycero-3-phospho-1'-myo-inositol)DPPIAvanti 极性脂质850141P
1,2-二棕榈酰-sn -glycero-3-phospho-1'-rac-glycerol)DPPGAvanti 极性脂质840455P
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸DPPSAvanti 极性脂质840037P
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱DPPCAvanti 极性脂质850355
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DPPEAvanti 极性脂质850705
来自蛋黄卵磷脂的L-α-磷脂酰-DL-甘油铵盐PGSigma-AldrichP0514
来自蛋黄的 L-α-磷脂酰乙醇胺体育Sigma-AldrichP7943
1-oleoyl-2-[12-biotinyl(aminododecanoyl)]- sn -glycero -3- phospho-(1'- rac -glycerol )（钠盐）生物素-PGAvanti 极性脂质860581C
1-oleoyl-2-[12-biotinyl(aminododecanoyl)]- sn -glycero -3- phosphocholinet生物素-PCAvanti 极性脂质860563C

B.脂质-蛋白质覆盖测定
1.Volac巴斯德吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z310727）
2.聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，目录号：IPVH304F0）
3.X射线胶片（AGFA，目录号：CP-BU New）

4.氯仿（Merck，目录号：1.02445.1000）
5.不含脂肪酸的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
6.抗 His单克隆抗体（ Sigma-Aldrich，目录号： H1029；1：2,000稀释）
7.抗 Strep-tag II 单克隆抗体（Abcam，目录号： ab76949；1：2,000 稀释度）
8.山羊抗小鼠 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号： A28177; 1:10,000 稀释）
9.Western Blotting Detection Reagent Kit Ab Signal ( AbClon ，目录号： ABC-3001)
10.Tris（ Duchefa ，目录号：T1501）
11.NaCl（ Duchefa ，目录号：S0520）
12.甘油（ Duchefa ，目录号：G1345）
13.2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
14.纯化的标记蛋白（透析缓冲液中的 His-FT 或 FT- StII ；见配方）
15.Tris 缓冲盐水 (TBS)（见配方s ）

C.脂质体结合试验
1.Volac巴斯德吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z310727）
2.蛋白质LoBind管（Eppendorf，目录号：0030108116）
3.PVDF膜（Millipore，目录号：IPVH304F0）
4.X射线胶片（AGFA，目录号：CP-BU New）
5.氯仿（Merck，目录号：1.02445.1000）
6.脱脂牛奶（Sigma-Aldrich，目录号：70166）
7.牛血清白蛋白（MP Biomedicals，目录号：0216006980）
8.抗 His单克隆抗体（ Sigma-Aldrich，目录号： H1029；1：2,000稀释）
9.山羊抗小鼠 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号： A28177; 1:10,000 稀释）
10.Western印迹检测试剂盒Ab Signal（ AbClon ，目录号： ABC-3001)
11.SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L5750）
12.溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
13.纯化的标记蛋白（透析缓冲液中的 His-FT 或 FT- StII ；见配方）
14.Tris 缓冲盐水 (TBS)（参见食谱）
15.SDS 样品缓冲液（参见配方）

D.生物素-磷脂下拉试验
1.Volac巴斯德吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z310727）
2.蛋白质LoBind管（Eppendorf，目录号：0030108116）
3.PVDF膜（Millipore，目录号：IPVH304F0）
4.X射线胶片（AGFA，目录号：CP-BU New）
5.氯仿（Merck，目录号：1.02445.1000）
6.乙醇（Merck，目录号：1.00983.1011）
7.Dynabeads MyOne Streptavidin T1（Invitrogen，目录号： 65601）
8.脱脂牛奶（Sigma-Aldrich，目录号：70166）
9.牛血清白蛋白（MP Biomedicals，目录号：0216006980）
10.抗 His单克隆抗体（ Sigma-Aldrich，目录号： H1029；1：2,000稀释）
11.山羊抗小鼠 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号： A28177; 1:10,000 稀释）
12.Western印迹检测试剂盒Ab Signal（ AbClon ，目录号： ABC-3001)
13.SDS 样品缓冲液（参见配方）
14.纯化的标记蛋白（透析缓冲液中的 His-FT；参见食谱）
15.Tris 缓冲盐水 (TBS)（参见食谱）

E.荧光偏振测定
1.Volac巴斯德吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z310727）
2.蛋白质LoBind管（Eppendorf，目录号：0030108116）
3.96孔黑色平底聚苯乙烯板（Corning，目录号：3915）
4.Pierce TM NHS-罗丹明抗体标记试剂盒（ThermoFisher Scientific，目录号：53031）
5.氯仿（Merck，目录号：1.02445.1000）
6.KCl （Sigma Aldrich，目录号：P3911）
7.Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
8.KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P0662
9.纯化的标记蛋白（PBS 透析缓冲液中的 His-FT；参见食谱）
10.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
11.PBS 洗脱缓冲液（参见配方）

设备

A.脂质-蛋白质覆盖测定
1.琥珀色玻璃小瓶（Shimadzu Scientific Korea，目录号：91005-0920）
2.涡流混合器（Scientific Industries，Genie 2，型号： G-560）
3.微量移液器（Eppendorf Research，目录号：3123000918）
4.蛋白质印迹托盘
5.轨道摇床（最佳实验室设备，型号：RF300）
6.X 光胶片暗盒
7.X 射线胶片处理器（Healthcare Solutions Inc.，型号：JP-33）

B.脂质体结合试验
1.琥珀色玻璃小瓶（Shimadzu Scientific Korea，目录号：91005-0920）
2.涡流混合器（Scientific Industries，Genie 2，型号：G-560）
3.微量移液器（Eppendorf Research，目录号：3123000918）
4.Bioruptor超声装置（Bio-Medical Science，型号：KRB 01）
5.冷冻离心机（Eppendorf Research，型号：5430R）
6.培养箱（Vision Scientific，型号：VS-8480MX2-DT）
7.加热块（最佳实验室设备，型号：CF1）
8.蛋白质印迹托盘
9.轨道摇床（最佳实验室设备，型号：RF300）
10.X 光胶片暗盒
11.X 射线胶片处理器（Healthcare Solutions Inc.，型号：JP-33）

C.生物素-磷脂下拉试验
1.琥珀色玻璃小瓶（Shimadzu Scientific Korea，目录号：91005-0920）
2.涡流混合器（Scientific Industries，Genie 2，型号：G-560）
3.微量移液器（Eppendorf Research，目录号：3123000918）
4.管旋转器（ Seoulin Bioscience，型号：SLRM-3）
5.磁选架
6.降速离心机（ Allsheng ，型号：mini-6K）
7.加热块（最佳实验室设备，型号：CF1）
8.蛋白质印迹托盘
9.轨道摇床（最佳实验室设备，型号：RF300）
10.X 光胶片暗盒
11.X 射线胶片处理器（Healthcare Solutions Inc.，型号：JP-33）

D.荧光偏振测定
1.琥珀色玻璃小瓶（Shimadzu Scientific Korea，目录号：91005-0920）
2.涡流混合器（Scientific Industries，Genie 2，型号：G-560）
3.微量移液器（Eppendorf Research，目录号：3123000918）
4.Bioruptor超声装置（Bio-Medical Science，型号：KRB 01）
5.冷冻离心机（Eppendorf Research，型号：5430R）
6.培养箱（Vision Scientific，型号：VS-8480MX2-DT）
7.SpectraMax多模式读板机（Molecular Devices）

软件

1.ImageJ Fiji，一个开源软件（ Schindelin等人，2012 年）
2.GraphPad Prism 5（Graph Pad Software Inc.）

程序

A.脂质-蛋白质覆盖测定
在这种定性分析中，脂质被固定在膜上并与标记的蛋白质一起孵育。然后通过针对表位标签的抗体检测任何结合的蛋白质（图 1 和图 5A）。我们建议使用标签蛋白（例如，GST、GFP 或 MBP）或没有脂质结合能力的蛋白作为实验的阴性对照。

图 1. 脂质-蛋白质叠加分析。
脂质被固定在 PVDF 膜上并与感兴趣的蛋白质一起孵育。用蛋白质印迹检测脂质结合的蛋白质。

1.将脂质溶解在纯氯仿中以制备储备溶液 (1 mg/mL)。使用Volac Pasteur 移液器混合和转移脂质溶液。
2.将脂质储备溶液储存在 -20°C 的琥珀色玻璃瓶中。
3.切割 PVDF 膜（2 × 8 厘米）并标记脂质的斑点（至少相距 1 厘米）。
4.μg 的每种脂质（5 μL 库存溶液）缓慢点到准备好的 PVDF 膜（直径至少 1–2 毫米）上，并在室温下将膜干燥至少 30 分钟至 1 小时。
5.将膜置于蛋白质印迹托盘 (6 × 10 cm) 中，用 10 mL 封闭溶液（含有3% [w/v] 无脂肪酸牛血清白蛋白的TBS ）在室温下温和孵育1 小时搅拌（10 转/分）。
6.弃去封闭溶液，将膜与 5 mL 封闭溶液中的 60 µg 重组 His-FT 或 FT- StII蛋白一起在 4°C 温和搅拌（10 rpm）孵育 16 小时。
7.弃去蛋白质溶液，用 10 mL TBS 洗涤膜 5 分钟；总共重复洗涤四次。
8.将膜与含有一抗（抗 His 单克隆抗体或抗 Strep-tag II 单克隆抗体）的 10 mL 封闭溶液在室温下轻轻搅拌（10 rpm）孵育 1 小时。
9.弃去抗体溶液，用 10 mL TBS 洗膜 5 分钟；重复洗涤四次。
10.用含有山羊抗小鼠 IgG 二级抗体的 10 mL 封闭溶液在室温下孵育膜 1 小时，并轻轻搅拌（10 rpm）。
11.用 10 mL TBS 溶液清洗膜 5分钟；重复洗涤四次。
12.用 2 mL 的辣根过氧化物酶 (HRP) 底物溶液孵育膜 5 分钟。
13.去除膜上多余的液体，将用塑料包裹的膜放入 X 射线胶片暗盒中，并使用带有 X 射线胶片处理器的 X 射线胶片检测信号。

B.脂质体结合试验
在这种定性分析中，标记的蛋白质与由两种脂质的不同比例组成的脂质体一起孵育；结合蛋白被脂质体拉下并通过蛋白质印迹检测（图 2 和图 5B）。我们建议读者使用标签蛋白（例如，GST、GFP 或 MBP）或没有脂质结合能力的蛋白作为实验的阴性对照。

图 2. 脂质体结合试验。
将感兴趣的蛋白质与由不同比例的两种脂质组成的脂质体一起孵育。通过蛋白质印迹沉淀和检测脂质体结合的蛋白质。

1.将脂质溶解在纯氯仿中以制备储备溶液 (1 mg/mL)。使用Volac Pasteur 移液器混合和转移脂质溶液。
2.将脂质储备溶液储存在 -20°C 的琥珀色玻璃瓶中。
3.为了制造脂质体，将磷脂溶液以所需比例转移到蛋白质LoBind管中，每次反应 50 µg脂质。例如，PG/PC 脂质体：50/0 µg、40/10 µg、30/20 µg、20/30 µg、10/40 µg 和 0/50 µg。
4.打开管子蒸发氯仿，在每个管子中获得脂质膜。
5.µL TBS对脂质膜进行再水化，并在37°C 下孵育 1 小时。
6.涡旋以分散脂质 10 分钟。
7.在冰水浴中对脂质混合物（高设置：320W）进行声波处理 10 分钟（30秒开启和 30 秒关闭）。
8.更换水浴中的冰水并重复步骤B7。
9.g和 4°C 下将脂质体离心 10 分钟。
10.丢弃上清液，用 100 μL的冷 TBS清洗脂质体两次。
11.将脂质体重新悬浮在 50 μL 的冷 TBS 中（最终浓度为 1 mg/mL）。
12.将 1 µg 纯化蛋白 (His-FT) 添加到脂质体溶液中，并在 30°C 下轻轻搅拌孵育 30 分钟。使用一管不含脂质体（仅 TBS）作为阴性对照。
13.g和 4°C 下将混合物离心 10 分钟。
14.取出上清液并储存在另一个试管中以进行蛋白质印迹控制。
15.μL的冷 TBS 溶液清洗脂质体两次。涡旋混合物，直到所有颗粒完全重新悬浮。
16.将 10 µL的 6× SDS 样品缓冲液添加到步骤B1 3 的沉淀和上清液中，并在 95°C 的加热块中孵育样品5 分钟。将样品储存在-20°C 直至进一步使用。
17.为 SDS-PAGE 准备 12% 标准聚丙烯酰胺凝胶（迷你凝胶：10 × 8 厘米；11 口井）。
18.将样品装入井中，用 110 V 运行凝胶 2 小时，然后将蛋白质转移到 PVDF 膜上。
19.将膜放入西方印迹托盘中，用 10 mL 的阻塞溶液（含有3% [w/v] 脱脂牛奶的 TBS）在室温下搅拌 1 小时（50 rpm）孵育。
20.2 O短暂清洗膜。
21.，将膜与一抗（抗 His 单克隆抗体）在 10 mL 含有 1% (w/v) 牛血清白蛋白的 TBS 中孵育过夜。
22.用 10 mL TBS 溶液清洗膜 5分钟四次。
23.在室温下用山羊抗鼠 IgG 二级抗体在含有 1% (w/v) 牛血清白蛋白的 10 mL TBS 中孵育膜 1 小时。
24.用 10 mL TBS 溶液清洗膜 5分钟四次。
25.用 2 mL 的 HRP 底物溶液孵育膜 5 分钟。
26.去除膜上多余的液体，将用塑料包裹的膜放入 X 射线胶片暗盒中，并使用带有 X 射线胶片处理器的 X 射线胶片检测信号。

C.生物素-磷脂下拉试验
在这种定性分析中，生物素化的脂质与蛋白质一起孵育；用链霉亲和素珠子将脂质拉下，并通过蛋白质印迹检测结合蛋白（图 3 和图 5C）。

图 3. 生物素-磷脂下拉试验。
生物素标记的磷脂与感兴趣的蛋白质一起孵育。蛋白质-脂质复合物被链霉亲和素珠拉下。通过蛋白质印迹检测脂质结合的蛋白质。

1.将生物素标记的脂质溶解在纯氯仿中以制备库存溶液 (1 mg/mL)。使用Volac Pasteur 移液器混合和转移脂质溶液。
2.将脂质储备溶液储存在 -20°C 的琥珀色玻璃瓶中。
3.将 15 µL (15 µg)的每种生物素标记的磷脂转移到蛋白质LoBind中管，蒸发氯仿，得到脂质膜。
4.μL 的 50% 乙醇补充脂质膜。
5.在室温下孵育脂质溶液 15 分钟，每 5 分钟短暂涡旋一次。
6.加入 40 μL 的含有1 μg 纯化蛋白的 TBS。
7.1 μg 纯化蛋白（不含脂质溶液）的50 μL TBS作为阴性对照。
8.孵育30 分钟，同时轻轻搅拌。
9.在步骤 C7 的孵育过程中，通过转移 20 μL Dynabeads来制备珠子 MyOne链霉亲和素 T1 到蛋白质LoBind管。
10.架收集珠子，用含有 0.5%（w/v）牛血清白蛋白的 500 μL 的 TBS 洗涤珠子两次。
11.含有 0.5% (w/v) 牛血清白蛋白的 TBS 的 450 μL 中重新悬浮珠子。
12.将步骤 C7 中的脂质-蛋白质混合物短暂离心，将 5 µL 上清液放入新试管中作为输入对照（10% 输入），然后将其余混合物转移到含有珠子的试管中。将输入样品储存在 -20°C。
13.将珠-脂质-蛋白质混合物在试管旋转器 (10 rpm) 中在4°C 下孵育过夜。
14.用磁性分离架收集珠子，用含有 0.5%（w/v）牛血清白蛋白的 500 μL 的 TBS 清洗珠子两次。
15.从最后一个洗涤步骤收集珠子，并将 SDS 样品缓冲液添加到珠子和来自步骤 C11 的输入样品中。在加热块中将样品在 95°C 下孵育5 分钟。将样品储存在-20°C。
16.为 SDS-PAGE 准备标准的 12% 聚丙烯酰胺凝胶。
17.将样品装入井中，用 110 V 运行凝胶 2 小时，然后将蛋白质转移到 PVDF 膜上。
18.将膜放入西方印迹托盘中，在室温下用 10 mL 的阻塞溶液（含有3% [w/v] 脱脂牛奶的 TBS）孵育1 小时，并轻轻搅拌（50 rpm）。
19.2 O短暂清洗膜。
20.将膜与一抗（抗 His 单克隆抗体）在 10 mL 含有 1% (w/v) 牛血清白蛋白的 TBS 中于4°C 孵育过夜。
21.弃去抗体溶液，用 10 mL TBS 洗膜 5 分钟；重复洗涤四次。
22.在室温下用山羊抗鼠 IgG 二级抗体在含有 1% (w/v) 牛血清白蛋白的 10 mL TBS 中孵育膜 1 小时。
23.用 10 mL TBS 溶液清洗膜 5分钟；重复洗涤四次。
24.用 2 mL 的 HRP 底物溶液孵育膜 5 分钟。
25.去除膜上多余的液体，将用塑料包裹的膜放入 X 射线胶片暗盒中，并使用带有 X 射线胶片处理器的 X 射线胶片检测信号。

D.荧光偏振测定
在这种定量分析中，蛋白质-脂质相互作用会改变荧光团发出的光的极性，该荧光团附着在感兴趣的蛋白质上并被偏振光激发；将所得的各向异性值绘制为脂质体浓度的函数图给出了蛋白质-脂质结合亲和力（图 4 和图 5D）。

图 4. 荧光偏振测定。
荧光染料标记的蛋白质与脂质体一起孵育。通过荧光偏振或各向异性的值计算相互作用的程度。

1.将脂质溶解在纯氯仿中以制备储备溶液 (1 mg/mL)。使用Volac Pasteur 移液器混合和转移脂质溶液。
2.将脂质储备溶液储存在 -20°C 的琥珀色玻璃瓶中。
3.μL的 PBS 透析缓冲液中制备 1 mg 纯化蛋白（His-FT）。避免在缓冲液中使用任何胺分子，例如 Tris 或甘氨酸。
4.要标记蛋白质，请将 500 μL 的蛋白质溶液添加到包含试剂盒中的 NHS-罗丹明试剂的小瓶中，并与移液器混合，直到所有染料溶解。
5.在黑暗中在室温下孵育小瓶 1 小时。
6.要去除未结合的染料，请通过涡旋和移液从试剂盒中重新悬浮树脂来制备两个自旋柱，然后将 400 μL 的树脂转移到每个自旋柱上。
7.在室温下以1,000 × g将柱子离心 30 秒以去除缓冲液。
8.将色谱柱放入新的收集管中，将步骤D5中的 250 µL 蛋白质-染料混合物添加到离心柱中。
9.通过涡旋和移液混合样品。
10.在室温下以 1,000 × g将色谱柱离心 30 秒。
11.收集并合并来自两个收集管的流出液。
12.用 PBS 透析缓冲液将标记的蛋白质混合物稀释至4 μM的浓度（相当于 His-FT 的浓度为0.1 µg/µL）作为库存。
13.将标记的蛋白质分装并储存在 -20°C 的蛋白质LoBind管中，避光保存，直至进一步使用。
14.为了制造脂质体，将磷脂溶液转移到微量离心管中以产生所需的浓度系列，如下所述。在为系列稀释分析制作储备溶液之前计算所需的磷脂量。详细信息，包括磷脂的分子量，可从 Avanti Polar Lipids 网站 ( https://avantilipids.com/ ) 获得。
在这种情况下，我们使用 DPPG (MW: 744.492 g/mol) 和 DPPC (MW: 733.562 g/mol)。我们在 200 µL 反应体积中使用浓度为 0、10、20、30、50、75、100和 150 µM 的脂质连续稀释，并进行了三个技术重复（来自 2 mM 储备溶液）。因此，我们将 298 μL 的 DPPG 和 293 μL 的 DPPC 储备溶液 ( 1 mg/mL )转移到微量离心管中，以制备 200 μL 的 2 mM 储备脂质体。
15.蒸发氯仿以获得脂质膜。
16.µL 的 PBS再水化脂质膜，并在37°C 下孵育 1 小时。
17.涡旋脂质分散 10 分钟。
18.在冰水浴中对样品（高设置）进行两次 10 分钟（30秒开和 30 秒关）。
19.g和 4°C 下将脂质体离心 10 分钟。
20.μL的冷 PBS清洗脂质体两次。
21.将脂质体重新悬浮在 200 μL 的冷 PBS 中（最终浓度为 2 mM）。
22.准备 96 孔板并将 1.5 μL的蛋白质、脂质体和 PBS 转移到每个孔中。将总体积设置为 200 μL（表 1）。如上所述，将脂质体稀释至 0、10、20、30、50、75、100 和 150 µM 的浓度。

表 1. 测定中各组分的组成
零件脂质体
(0 µM)脂质体
(10 µM)脂质体
(20 µM)-----脂质体
(150 µM)
蛋白质 ( µL)
脂质体 (µL)
PBS (µL)1.5 µL
0 µL
198.5 µL1.5 µL
1 µL
197.5 µL1.5 µL
2 µL
196.5 µL-----1.5 µL
15 µL
183.5 µL

23.将板在室温下孵育 30 分钟，轻轻搅拌。
24.准备SpectraMax多模式读板机。在软件界面中，将温度设置为30°C，选择endpoint measurement with top read，选择Costar black 96-well with no lid作为检测板，选择auto mix for 3 s。最后，将激发波长设置为 544 nm，发射波长设置为 575 nm，截止设置为 570 nm。
25.使用该软件计算各向异性 ( r ) 值。这些值可以保存到文本 (.txt) 文件或手动记录。
26.将获得的数据（一式三份）绘制到 GraphPad Prism 5 软件中的散点图中，x 轴上的脂质体浓度和 y 轴上的各向异性 ( r ) 值。
27.使用非线性回归模型（一个站点，总绑定）分析数据以获得解离常数以确定结合亲和力。

数据分析

代表性数据

图 5.体外FT 蛋白-磷脂相互作用测定的代表性结果。
A.脂质-蛋白质覆盖测定。 B.脂质体结合测定。 C.生物素-磷脂下拉测定。 D.荧光偏振测定。 DPPI：二棕榈酰磷脂酰肌醇，DPPA：二棕榈酰磷脂酸，DPPS：二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，DPPG：二棕榈酰磷脂酰甘油，DPPE：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱，PG：磷脂酰甘油，PE：磷脂酰乙醇胺。
食谱

以下配方中使用的水是双蒸水 (ddH 2 O)。
1.透析缓冲液（pH 8.0）
50 毫米三
150 毫米氯化钠
5% 甘油
过滤灭菌并在使用前立即添加 5 mM 2-巯基乙醇。
2.Tris 缓冲盐水 (TBS) (pH 7.2)
50 毫米三
150 毫米氯化钠
过滤除菌。
3.4× SDS 样品缓冲液
200 mM Tris-Cl pH 6.8
8% 安全数据表
0.4% 溴酚蓝
40% 甘油
4.磷酸盐缓冲液 (PBS) (pH 7.4)
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
8 毫米钠2 HPO 4
2 毫米 KH 2 PO 4
过滤除菌。
5.PBS 透析缓冲液 (pH 7.4)
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
8 毫米钠2 HPO 4
2 毫米 KH 2 PO 4
5% 甘油
高压灭菌器并在使用前立即添加 5 mM 2-巯基乙醇。

致谢

这项工作得到了韩国政府 (NRF-2017R1A2B3009624 至 JHA) 和三星科技基金会 (SSTF-BA1602-12 至 JHA) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 的支持。作者感谢 HK Song 的荧光偏振光谱实验。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1.Bernier, I.、 Tresca , JP 和Jolles , P. (1986)。用从牛脑细胞质中纯化的 23 kDa 蛋白质进行的配体结合研究。生物化学生物物理学报871（1）：19-23。
2.Jin , S.、Nasim, Z.、Susila, H. 和Ahn , JH (2021)。植物中FLOWERING LOCUS T/TERMINAL FLOWER 1家族基因的进化和功能多样化。精细胞开发生物学109：20-30。
3.Kim, SC, Nusinow , DA, Sorkin, ML, Pruneda -Paz, J. 和 Wang, X. (2019)。脂质介质磷脂酸和生物钟调节剂之间的相互作用和调节。植物细胞31（2）：399-416。
4.Nakamura, Y.、Andres, F.、Kanehara, K.、Liu, YC、 Dormann , P. 和 Coupland, G. (2014)。拟南芥FT 与昼夜振荡的磷脂结合，可加速开花。国家通讯5：3553 。
5.Schindelin , J., Arganda -Carreras, I., Frise, E., Kaynig , V., Longair , M., Pietzsch , T., Preibisch , S., Rueden , C., Saalfeld, S., Schmid, B .，等人。（2012）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。自然方法9（7）：676-682。
6.Susila, H., Juric , S., Liu, L., Gawarecka , K., Chung, KS, Jin , S., Kim, SJ, Nasim, Z., Youn , G., Suh, MC, Yu, H . 和Ahn ，JH（2021 年）。细胞膜中的 Florigen 隔离调节温度响应性开花。科学373（6559）：1137-1142。
7.Yao, H.、Wang, G.、Guo, L. 和 Wang, X. (2013)。磷脂酸与 MYB 转录因子相互作用并调节其在拟南芥中的核定位和功能。植物细胞25（12）：5030-5042。