材料和试剂

1.Eppendorf 管（Dot Scientific，目录号：RA1700-GMT）
2.玻璃珠（MO-SCI，目录号：GL0191B4/38-53）
3.Axygen 96孔PCR微孔板（Fisher Scientific，目录号：14-222-326）
4.组织培养处理的培养皿（dot science，目录号：667621）
5.感受态大肠杆菌细胞（Invitrogen，目录号：18265017）
6.最小MuDR线（普渡大学 Damon Lisch实验室）
7.乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP2482100）
8.氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
9.十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：28312）
10.乙酸钾（Fisher Scientific，目录号：A16321.36）
11.异丙醇（Fisher Scientific，目录号：040983.M1）
12.100％乙醇（Fisher Scientific，目录号：T038181000）
13.DNA上样染料10 × （NEB，目录号：10816015）
14.2 × PCR Master Mix（Syd Labs，目录号：MB067-EQ2G-L）
15.EpiMark热启动Taq DNA 聚合酶（NEB，目录号：M0490S）
16.亚硫酸氢盐转化试剂盒（ZYMO RESEARCH，目录号：D5005）
17.溶原肉汤（LB）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
18.T4连接酶（NEB，目录号：M0202S）
19.TA克隆载体（Fisher Scientific，目录号：K1231）
20.RNase A（Fisher Scientific，目录号：EN0531）
21.8条PCR管和盖子（dot science，目录号：503-8PCR-A）
22.Zymoclean凝胶 DNA 回收试剂盒（ Zymo目录号：D4007）
23.ZymoPURE质粒小量制备试剂盒（ Zymo目录号：D4210）

设备

1.移液器（Fisher Scientific，目录号：EPPR4331）
2.微量离心机（Fisher Scientific，目录号：5424）
3.培养箱（VWR，目录号：13259-36）
4.Qubit 荧光计（Fisher Scientific，目录号：Qubit 2.0）
5.凝胶电泳系统（ NeoSCI ，目录号：55-1094）
6.Kismeth ( http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl )
7.低速轨道振动器（Corning LSE，目录号：6780-FP）
8.PCR机（Bio-Rad，目录号：1861096）

程序

流程概览见图 1。

图1. DNA 提取方案程序概述

1.样本采集和 DNA 提取
1. 收集样本并将其储存在 -80 °C 下，或立即使用之前描述的方案进行 DNA 提取（Guo等人，2022 年）
2. 用 RNase 消化基因组 DNA。
通常，1 将μL RNase 添加到每个 DNA 样本中，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 评估 DNA 的质量。
这基因组 DNA 的质量应通过凝胶电泳和使用 Qubit 荧光计或紫外分光光度计进行评估。顶部的大、清晰、完整的条带表明存在高质量的基因组 DNA。除了高质量的 DNA 之外，成功的亚硫酸氢盐转化反应还需要使用商业试剂盒建议的一定量的 DNA。
2.引物设计
可以使用各种在线工具设计引物，例如 Bisulfite Primer Seeker ( https://www.zymoresearch.com/pages/bisulfite-primer-seeker )。
注意：建议在亚硫酸氢盐处理步骤之前设计引物。还应设计内部对照基因的引物。理想情况下，这应该是一个已经被确定为完全或大部分未甲基化的基因。
3.亚硫酸氢盐转化
读者应遵循用于亚硫酸氢盐转化的商业试剂盒的说明。
注意：转化后的 DNA 可以在 4 °C或 -20 °C下短时间保持稳定，但最好从您使用的试剂盒中查看手册。建议在转换完成后立即对感兴趣的区域进行 PCR 扩增，以确保获得最佳结果。
4.PCR扩增子的TA克隆
典型的克隆 PCR条件是（表 1）：

表 1. 克隆 PCR 条件概述
零件50 μl反应_
5 × EpiMark热启动
Taq 反应缓冲液10微升_
10 毫米 dNTP1微升_
10 μ M正向引物1微升_
10 μ M反向引物1微升_
EpiMark热启动
Taq聚合酶0.25微升_
转化的 DNA1μL /变量_
无核酸酶水至50微升

热循环条件：
95°C，30 秒
35-40 个循环：
95°C，15 – 30 秒
45–68°C，15–60 秒
68°C，每 kb 1 分钟
最终扩展：
68°C，5分钟

注意：由于基因组 DNA 由亚硫酸氢盐试剂处理和转化，常规 Taq DNA 聚合酶可能无法耐受含尿嘧啶的 DNA 和高 AT 靶标。因此，需要使用合适的 DNA 聚合酶来保证高保真度、低偏差和足够的产量。我们推荐来自新英格兰实验室 (NEB) 的EpiMark Hot Start Taq DNA 聚合酶，它可以生成在 3' 端包含dA突出端的 PCR 产物。这允许连接到带有 dT/ dU -突出端的载体。要使用 PCR 克隆感兴趣的区域，建议运行更大体积的 PCR，以确保可以回收足够的 DNA。通常，50 μL或更多会产生更好的结果。可以使用商业试剂盒直接纯化 PCR 产物。或者，可以从凝胶切片中回收 PCR 产物。如果使用这种方法，在进行电泳和恢复时，使用新鲜的 TAE 缓冲液和干净的刀片非常重要。

a.结扎。典型的连接条件是（表 2）：

表 2. 连接条件概述
零件20 μL反应_
T4 DNA 连接酶缓冲液 (10 × )2微升_
载体 DNA (3 kbp )50 纳克
插入 DNA (300 bp)15 纳克
T4 DNA连接酶1微升_
无核酸酶水至20 μL

注意：PCR 扩增和凝胶回收后，按照以下说明（表 2）将 PCR 产物与克隆载体一起孵育。我们之前的工作使用了 Thermo Fisher ( Guo et al. , 2021 )的克隆试剂盒。室温下连接可在 5 分钟内完成，但对于任何大于 3,000 bp 的 PCR 产物，建议将此时间延长至 30 分钟或更长。

b.转型
读者应遵循用于转化的商业感受态细胞的说明。
注意：一旦连接完成，样品就可以使用大肠杆菌感受态细胞进行载体转化。注意载体携带的抗生素抗性基因。通常，Top10 菌株的生长速度比 DH 5-α 菌株快，但在常规克隆实验中使用任何一种都没有显着差异。转化后，细胞可以直接扩散到含有适当抗生素的 LB 培养基上。请务必使用经过消毒的玻璃珠或吊具。将 LB 板在 37°C 下孵育 10-16 小时。
c.要确定携带阳性扩增子的菌落，请在液体 LB 培养基中从单个菌落中繁殖细胞，并运行菌落 PCR 以选择将进行测序的阳性菌落。通常，
1.在管架上准备 2.0 mL 管，并用 2 mL 含有抗生素的液体 LB 培养基填充它们。
2.使用消毒过的牙签或移液器尖端，从每个盘子中接种一个单独的菌落。
3.然后将试管置于设置为 200 rpm 和 37°C 的振荡器上 10-14 小时。
注意：由于某些连接和增殖不成功，根据 PCR 产物的大小，建议接种的菌落至少比您要发送的 Sanger 测序的实际数量多 2 倍。
4.一旦透明液体 LB 培养基变得浑浊，使用 1 mL 含有细胞的液体 LB 培养基作为 DNA 模板，直接运行菌落-PCR。
注意：由于载体的大小通常很小，而且这是从大肠杆菌质粒中直接进行的 PCR 扩增，因此通常在 20 个 PCR 循环后会产生强阳性扩增。

典型的菌落 PCR 条件是（表 3）：

表 3.菌落 PCR 条件概述
零件12.5 μL反应_
2 ×主混音6.25微升_
10 μ M 正向引物0.25微升_
10 μ M 反向引物0.25微升_
脱氧核糖核酸1微升_
无核酸酶水4.75微升_

热循环条件
95°C，3 分钟
20 个循环或更多：
95°C，30 秒
50℃ ，30秒
70°C，每 kb 1 分钟
最终扩展：
70°C，5 分钟

5.一旦鉴定出阳性菌落，就可以从剩余的液体培养物中提取质粒。可以使用传统方法或商业试剂盒进行提取。一旦质粒准备好，就可以将样品送去进行 Sanger 测序。建议先发送几个进行测试，然后再对多个样本进行测序。应获得来自每个基因型或处理的十个菌落的不同序列用于分析。
6.可以使用SnapGene查看器或任何可用软件修剪序列。参考序列和样本序列以 FASTA 格式放置在单独的文本文件中。确保所有序列相对于参考序列的方向正确，并排除引物序列。这两个文件被上传到Kismeth ( http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl )，它提供定量数据，以及用于结果可视化的图像。

结果

玉米最小MuDR系中MuDR元件的DNA 甲基化模式
使用该协议，我们已经证明了 TIRB 的 DNA 甲基化，即MuDR中与mudrB基因相邻的末端反向重复 (TIR)与转录无关 mudrB的活性，并且mudrA活性与 TIRA 的 DNA 低甲基化有关（Li等人，2010；Guo等人，2021）。在这里，我们描述了如何逐步检查 DNA 甲基化。首先，我们从活跃和沉默的MuDR系中收集 2 周龄幼苗的叶组织，然后从这些组织中提取基因组 DNA。凝胶检查表明 DNA 质量良好，如凝胶顶部完整的亮带所示（图 2B）。然后我们测量了 DNA 的浓度，以确定适合亚硫酸氢盐转化反应的 DNA 体积（表 4）。接下来，我们使用商业试剂盒进行亚硫酸氢盐转化，并使用两对不同的引物进行 PCR 以在两个单独的扩增中扩增来自 TIRA 和 TIRB 的短片段（图 2C）。先前的实验表明，TIRA 缺乏 DNA 甲基化，可作为活性MuDR /-系的内部对照，而 TIRB 存在 DNA 甲基化（Woodhouse等人，2006；Guo等人，2021）。
在我们使用商业试剂盒直接从凝胶切片中收获 PCR 产物后，我们按照上述程序进行了连接和大肠杆菌转化。我们获得了具有数百个菌落的板（图 2D）。为了确定阳性菌落并从那些用于 Sanger 测序的菌落中提取质粒，我们在液体培养基中繁殖细胞克隆，并进行菌落-PCR。我们发现大多数菌落都带有预期大小的插入片段，这表明克隆工作是成功的。然后我们将质粒送去进行 Sanger 测序。读取被修剪并粘贴到文本文件中并上传到Kismeth ( http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl )。

表 4.检查基因组 DNA 样本的浓度和纯度
样本浓度（量子位）A 260 /A 280A 260 /A 230
MUDR /-75 纳克/微升1.822.12

图 2。 MuDR /-中 TIRA 和 TIRB 的 TA 克隆。
A. 甲基化和未甲基化胞嘧啶的示意图。 B. MuDR的基因组 DNA /-。将总体积为 2 mL 的 DNA 与 10 × DNA 上样染料混合加载到 1% 琼脂糖凝胶中，连同加载到第 2 条泳道中的 5 mL 100 bp DNA梯。 M 表示 100 bp DNA 梯。 C. 来自MuDR /-的 TIRA 和 TIRB 的 PCR 扩增。 M 表示 100 bp DNA 梯。包括作为 DNA 模板的水的阴性对照。 D. 含有 50 μ g /mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上的菌落。

分别为 TIRA 和 TIRB 生成并可视化了具有三种颜色的点图，指示在三个序列上下文中发生的 DNA 甲基化（图 3A）。为了获得 DNA 甲基化比率的数据并显示每个菌落的单独值，上传来自每个质粒的每个序列，并记录数据。生成了一个直方图，每个菌落都有一个点代表（图 3B 和 3C），其结果是一致的，并支持使用点图获得的结果。

图 3 。 MuDR中TIRA和TIRB的DNA甲基化模式线。
A. TIRA 和 TIRB 的 DNA 甲基化模式点图。 B. TIRA 和 TIRB 的总 DNA 甲基化比率。 C. TIRA 和 TIRB 的每个序列上下文中胞嘧啶的 DNA 甲基化比率。从亚硫酸氢盐处理的样品的 PCR 产物中对 10 个单独的克隆进行了测序。不同序列上下文中的胞嘧啶由三种颜色表示（红色：CG，蓝色：CHG，绿色：CHH；其中 H = A、C 或 T）。填充循环代表甲基化胞嘧啶。

致谢

这项工作由NSF 授予 DL (IOS-1237931) 资助。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

1.福斯特，ASMO (2010)。通过亚硫酸氢盐测序分析植物中的 DNA 甲基化。方法 Mol Biol 631：1-11。
2.Gruntman, E.、Qi, Y.、Slotkin, RK、Roeder, T.、Martienssen, RA 和 Sachidanandam, R. (2008)。 Kismeth：通过亚硫酸氢盐测序分析植物甲基化状态。 BMC 生物信息学9：371。
3.Guo, W.、Wang, D. 和 Lisch, D. (2021)。 RNA 指导的 DNA 甲基化可防止玉米在热应激下转座子沉默的快速和可遗传逆转。 PLoS Genet 17（6）： e1009326。
4.Guo, W.、Binstock, B.、Cannon, A. 和 Lisch, D. (2022)。一种廉价、快速、稳健的 DNA 提取方法，可用于植物的基因分型和下一代测序应用中的高质量 DNA 。生物协议10.21769/p1516 。
5.Li, H.、Freeling, M. 和 Lisch, D. (2010)。玉米营养阶段变化过程中的表观遗传重编程。 Proc Natl Acad Sci USA 107（51）：22184-22189。
6.Schultz, MD, Schmitz, RJ 和 Ecker, JR (2012)。 “平衡”单碱基分辨率 DNA 甲基化组分析的竞争环境。趋势基因28（12）：583-585。
7.Woodhouse, MR, Freeling, M. 和 Lisch, D. (2006)。 mop1（paramutation1 的介体）突变体逐渐重新激活玉米中由 MuDR 转座子编码的两个基因之一。遗传学172（1）：579-592。
8.Zhang, H.、Lang, Z. 和 Zhu, JK (2018)。植物DNA甲基化的动力学和功能。 Nat Rev Mol 细胞生物学19(8): 489-506。