材料和试剂

1. 过滤移液器吸头（不含 RNase/DNase）（ Labcon ，目录号：1057-965-018-9 [P1000]、1059-965-008-9 [P200]、1055-965-018-9 [P40]；和QSP，目录号：TF102-10-Q [P2]）
2. 一次性针头 No.30（30 号）（ Dentronics ，No.30）
3. 0.2 mL 扁平 PCR 管 8 盖条（INA OPTIKA，目录号： 3247-00）
4. 1.5 mL 微量管，平底，无 DNase/RNase（Watson，目录号： 131-415C）
5. 塑料瓶（爱好俱乐部，吹瓶容器 750 ）
6. 薰衣草丁腈无粉检查手套（ Kimberly-Clark，目录号： 52818 ）
7. 聚苯乙烯泡沫塑料容器
8. 铝箔
9. 锥虫三龄幼虫二分法（ Loiinne ，三龄幼虫）
10. UltraPure TM DNase/RNase-Free Distilled Water（UPW）（Invitrogen，目录号：10977023）
11. 加载染料（New England Biolabs，目录号： B7024S）
12. 100 bp DNA Ladder（New England Biolabs，目录号： N3231L）
13. TaKaRa Ex Taq （ TaKaRa ，目录号： RR001B）
14. AmpliScribe TM T7-Flash TM转录试剂盒（ Epicenter Technologies，目录号： ASF3257）
15. Rnase AWAY（Thermo Fisher Scientific，目录号： 7002）
16. Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（5 μg ）（ BioLabs ，目录号： T1030）
17. 用于结核菌素滑尖白的 Terumo 注射器 1 mL（Terumo，目录号： SS-01P）
18. 乙醇（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号： 057-00456）
19. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（PCI）（NIPPON GENE，目录号： 311-90151）
20. 氯仿/异戊醇（24：1）（CIA）（Sigma-Aldrich，目录号： C0549）
21. 3 M乙酸钠（pH 5.2）（NIPPON GENE，目录号： 316-90081）
22. 琼脂糖 S （NIPPON GENE，目录号： 318-01195）
23. 10 × TAE缓冲液（NIPPON GENE，目录号： 318-90301）
24. 溴化乙锭粉末（ SIGMA，目录号： E7637-1G ）
25. 腐殖质（Dorcus Owner's shop，大阪，日本）
26. PCR 反应混合物（见配方）
27. 1% 琼脂糖凝胶溶液（见配方）

设备

1. 热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号： T100）
2. 移液器（GILSON，目录号：F123602 [P1000]、F123601 [P200]、F123600 [P20] 和 F144801 [P2]）
3. 分光光度计（ DeNovix ，型号： DS-11）
4. 电泳槽（ TaKaRa ，型号： AD115）
5. 微波炉（松下，型号： NE-MS261）
6. 凝胶成像装置（ATTO，型号： WSE-6100）
7. 离心机（TOMY，型号： MX-307）
8. 热块（主科学，型号： MD-MINI）
9. 涡流混合器（LMS，型号： VTX-3000L）

程序

A. 搜索 dsRNA 的目标区域

1. 锥虫的 RNA-seq 数据库中搜索目标 mRNA 二分法（ Ohde 等。 , 2018;津娜等人， 2018）。
2. 搜索 dsRNA 的目标区域。

3. 在 dsDNA 的 5' 端添加适配器序列 5'-AACGAATTCGCCCTT-3'，在 dsDNA 的 3' 端添加序列 5'-AAGGGCGAATTCGCG-3'。

4. 例如，IDT eBlocks ）合成上述序列。

B. 合成 dsDNA

1. 通过使用以下引物进行 PCR，在 dsDNA 的两端添加 T7 启动子序列： 5'- taatacgactcactataggg AACGAATTCGCCCTT-3' [熔化温度 (Tm) = 74 °C ]和5'- taatacgactcactataggg CGCGAATTCGCCCTT-3' (Tm = 78℃）。