材料和试剂

1. 1 mL无针塑料注射器（TERUMO，目录号：SS-01T）
2. 20 mL无针塑料注射器（TERUMO，目录号：SS-20ESz）
3. 50 mL离心管（FALCON，目录号：352070）
4. GD/X 注射器过滤器（PES 0.45 μm ）（GE Healthcare，目录号： 6876-2504）
5. 500 毫升耐热玻璃烧杯
6. 300 毫升耐热玻璃烧杯
7. 真空干燥器
8. 15 mL离心管（FALCON，目录号：352097）
9. 土生烟草_
10. pEAQ -HT 质粒 (Sainsbury et al. , 2009)
11. 携带 pCH32 的根癌农杆菌C58C1 (Hamilton et al. , 1996; Hellens 等。 , 2000)
12. LB Broth（Lennox）（Sigma-Aldrich，目录号：L7275-500TAB）
13. 卡那霉素（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：113-00343）
14. 利福平（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：185-01003）
15. 4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮）（Sigma-Aldrich，目录号： D134406-25G）
16. Bis-Tris（ Dojindo ，目录号：6976-37-0）
17. 吐温20（聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯）（ Nacalai Tesque ，目录号：35624-15 ）
18. cOmplete TM ULTRA 片剂，不含 EDTA，蛋白酶抑制剂混合物（Merck，目录号：5892953001）
19. 氯化钠（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号： 195-01663)
20. 氯化镁（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号： 136-03995)
21. 固定化Ni 2+ -亲和柱， HisTrap excel（ Cytiva ，目录号：17371205 ）

22. Superloop ，1/16" 接头（ ÄKTAdesign ），50 mL（ Cytiva ，目录号：18111382）
23. 咪唑（FUJIFILM Wako Chemicals，目录号：095-00015）
24. Vivaspin Turbo 15（10 kDa 截留分子量）（Sartorius，目录号：VST15T01）
25. 考马斯亮蓝蛋白染色剂，例如InstantBlue ( Expedeon ，目录号： ISB01L )
26. 农杆菌浸润缓冲液（见配方）
27. 真空浸润缓冲液（见配方）
28. 平衡缓冲液（见配方）
29. 洗涤缓冲液（见配方）
30. 洗脱缓冲液（参见配方）

设备

1. 真空泵（例如ULVAC DTC-41 或同等型号）
2. 电穿孔系统（例如Bio-Rad Gene Pulser XCell TM或同等产品）
3. 带有用于 50 mL离心管的摆动转子的离心机（例如，带有摆动转子 T4SS31 的 Hitachi CF16RXII，或同等产品）
4. 用于 15 mL 离心管的带有固定角转子的离心机（例如，带有固定角转子 R15A 的 Hitachi CR20GIII，或同等产品）
5. 快速蛋白质液相色谱仪（我们使用相当于 GE Healthcare AKTA pure 25 M1（ Cytiva ，目录号 29018227），安装了可选附件）。
注意：任何来自Cytiva ( https://www.cytivalifesciences.com/ ) 或 Bio-Rad ( https://www.bio-rad.com/ ) 等公司的快速蛋白质液相色谱仪都可以。
6. 分光光度计（例如Thermo Fisher Scientific NanodDrop 一个C或同等学历）
7. 标准 SDS-PAGE 设备（例如 Bio-Rad 的 Mini-PROTEAN ® Tetra Cell）。有关 SDS-PAGE 协议，请参阅 Green 和 Sambrook (2014)。

程序

A. His-tagged CARD1 胞外域在本氏烟草质外体空间的表达

1. 编码 CARD1 的核苷酸序列从拟南芥基因组 DNA（氨基酸 1-546）克隆到pEAQ -HT 载体中，在 C 末端带有 His 标签（CARD1ecto-His）的框架中（图 1）。

图 1. pEAQ -HT 矢量图。
顶部，简化的pEAQ -HT 矢量图。底部，限制酶图的特写。

2. 序列确认后，使用电穿孔系统用 pEAQ-CARD1ecto-His转化农杆菌C58C1 的电感受态细胞（农杆菌的机器默认设置为电容器 = 25 μF ，脉冲控制器 = 200 Ω，电压 = 2.4 kV）。将转化细胞铺板到 LB 琼脂板上，辅以 100 μg /mL 利福平和50 μg / mL 卡那霉素。
3. PCR确认农杆菌菌落的正确转化，并制作甘油储备以供长期储存。
4. 挑选一个新鲜的菌落或取一小部分农杆菌甘油原液到5 mL 的 LB 液体培养基中，辅以 100 μg /mL 利福平和 50 μg /mL 卡那霉素，并在 28°C 下以 120 rpm 摇动孵育过夜。
5. 补充有 100 μg /mL 利福平和 50 μg /mL卡那霉素的新鲜 LB液体培养基稀释 2 mL 过夜培养物，并在 120 rpm 和 28°C 下振荡孵育 4 小时。
6. 农杆菌以 3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。
7. 添加 10 mL 的 Agroinfiltration缓冲液，并重新悬浮颗粒。
8. 重复步骤 6-7。
9. 测量悬浮液的 OD 600并将其调整为 0.3。
10. 农杆菌悬浮液从背面渗透到 5 周大的N.benthamiana的整个叶子中。与未过滤区域相比，浸润区域的颜色应该变深（ Yin等人，2017）。

B. 氏烟草叶中提取质外体液

1. 后4-7 天后，收获渗透的本氏烟草叶子并将它们堆放在一起，使叶子的背面朝上。
2. 小心地将叶子堆放入含有 150 mL 真空渗透缓冲液的 500 mL Pyrex 烧杯中。之后，将 300 毫升 Pyrex 烧杯放在堆的顶部，使留下的样品浸没在缓冲液中（图 2）。

图 2. 真空渗透设置。

3. 将组装好的烧杯（带有留样）放入真空干燥器中，并使用泵（或其他适当的设备）施加 60 hPa的压力 10 分钟。气泡应该从叶子中释放出来。
4. 慢慢释放干燥器内的压力。我们通常允许至少 10 分钟让压力恢复正常。

5. 小心地从烧杯中取出单个叶子，并使用纸巾轻轻去除多余的缓冲液。把这些放在一边。
6. 同时，组装非质体流体收集单元。这包括以下材料：
• 20-mL 一次性无针塑料注射器，柱塞已移除（即，仅需要针筒部分）
• 50-mL 离心管，无裙边
要组装非质体流体收集装置，只需将 20 mL 大小的注射器的筒部分放入 50 mL 离心管中（图 3A）。

图 3.质外体流体收集单元的设置。

7. 每个质外体流体收集单元，从步骤 5 中取出 6-8片叶子，并将它们分成两堆（每堆 3-4 片叶子）。接下来，小心地将叶子从一堆（从底部到叶子的顶点）卷起来，并将其放入非质体流体收集单元的桶部分。背轴或近轴侧可以朝向任何方向。重复第二堆（图 3B）。

8. 将质外流体收集单元（带叶子）放入摆动转子中，并在 1，500 × g和 4 °C 下离心10 分钟。

9. 质外体液应出现在 50 mL 离心管的底部。将流体转移到单独的管中，并在 1,500 × g和 4 °C 下再次离心3 分钟，以确保已提取所有流体。最后，将所有质外体液汇集到一个管中。
10. 在 10,000 × g和4 °C 下将步骤 9 中收集的非质体流体离心10 分钟。收集上清液，在 10,000 × g和 4 °C 下再次离心10 分钟。
11. 用GD/X 注射器过滤器过滤上清液。所得滤液现已准备好进行下一步纯化。

C. 通过 Ni 2+亲和层析纯化 CARD1ecto-His

1. 将HisTrap excel 柱（容量为 5 mL）连接到 FPLC 系统（例如 AKTA pure ），并用 25 mL 超纯水（5 柱体积，CV）以 5 mL/min（1 CV/min）清洗该柱）。

2. 用 25 mL (5 CV) 的平衡缓冲液以 5 mL/min (1 CV/min)平衡色谱柱。
3. 以 2. 5 mL/min (0.5 CV/min)的速度将非质体流体样品加载到带有superloop的柱上。

4. (5 CV) 的洗涤缓冲液以 5 mL/min (1 CV/min)的速度洗涤色谱柱。
5. 用 25 mL (5 CV) 的洗脱缓冲液以5 mL/min (1 CV/min)洗脱 His 标签蛋白。
6. 将峰组分汇集在一个采样管中，通过 SDS-PAGE 检查 CARD1ecto-His 的纯度，然后进行考马斯亮蓝染色（ InstantBlue ； Expedeon ）（图 4）。

图 4.纯化 CARD1ecto-His 的 SDS-PAGE 分析。
泳道 1：来自完整的本氏烟草叶子的质外体液。泳道 2：来自CARD1ecto -His 表达N.benthamiana叶的质外体液。泳道 3：通过Ni 2+亲和层析纯化的 CARD1ecto-His 。凝胶用考马斯亮蓝 ( InstantBlue ) 染色。

7. 使用分光光度计（例如NanoDrop ）在 280 nm 处通过吸光度测量蛋白质浓度一C )。
8. （可选）在具有 10 kDa 截止膜 ( Vivaspin turbo 15) 的超滤装置中应用汇集的级分，以进行缓冲液交换和/或浓缩。

食谱

1. 农用浸润缓冲液
10 mM MES/NaOH (pH 5.6)
10 毫米氯化镁2
150微米乙酰丁香酮

2. 真空浸润缓冲液
20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6.0)
0.01% 吐温20
1 × cOmplete TM蛋白酶抑制剂混合物

3. 平衡缓冲液
20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6.0)
300 毫米氯化钠

4. 洗涤缓冲液
20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6.0)
300 毫米氯化钠
5 mM 咪唑
5. 洗脱缓冲液
20 mM Bis-Tris/HCl (pH 6.0)
300 毫米氯化钠
300 毫米咪唑

致谢

该协议改编自我们已发表的工作（ Laohavisit 等。 , 2020)。这项工作得到了 JSPS Grant-in-Aid 17H06172和 20H05909的支持到堪萨斯

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Green, MR 和 Sambrook, J. (2014)。分子克隆：实验室手册（第 4版）。纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社。
Hamilton, CM, Frary , A., Lewis, C. 和Tanksley , SD (1996)。将完整的高分子量 DNA 稳定转移到植物染色体中。 Proc Natl Acad Sci USA 93(18): 9975-9979。
Hellens , R.、 Mullineaux , P. 和 Klee, H. (2000)。技术重点：农杆菌二元 Ti 载体指南。趋势植物科学5（10）：446-451。
Laohavisit , A.、 Wakatake , T.、 Ishihama , N.、Mulvey, H.、Takizawa, K.、Suzuki, T. 和Shirasu , K. (2020)。通过富含亮氨酸的重复受体样激酶在植物中对醌的感知。自然587（7832）：92-97。
Meyer, AJ, Riemer, J. 和Rouhier , N. (2019)。氧化蛋白质折叠：植物研究的最新和当前途径。新植物醇221(3)：1230-1246。
Sainsbury, F. 和Lomonossoff , GP (2008)。在不使用病毒复制的情况下，在植物中实现极高水平和快速的瞬时蛋白质生产。植物生理学148（3）：1212-1218。
Sainsbury, F., Thuenemann , EC 和Lomonossoff , GP (2009)。 pEAQ：多功能表达载体，用于在植物中轻松快速地瞬时表达异源蛋白。植物生物技术J 7（7）：682-693。
苏萨，公元（2015 年）。 His 标签蛋白在植物系统中的表达和部分纯化。生物协议5(17)。 e1572。
Yin, K.、Han, T. 和 Liu, Y. (2017)。使用双子病毒通过农业渗透将 CRISPR/Cas9 成分递送至烟草。生物协议7(7)：e2209。