材料和试剂

1. 96孔培养板扁平，白色（Costar，目录号：3917）
2. 96孔immulon 4 HBX板，扁平（Fisher Scientific，目录号：3855）
注意：如果immulon 4HBX 板替代标准 96 孔细胞培养板（康宁，目录号：3599），我们获得了可比较的数据集。
3. 8孔直形多通道抽吸歧管（Drummond，目录号：3-000-093）
4. 多道移液器 30 – 300 µL (Gilson)
5. 15 mL Falcon 管（Corning，目录号：352097）
6. 1.5 mL 无菌微量离心管（Eppendorf， EP022363344）
7. 无菌过滤器吸头（ Axygen ，目录号：350-rs、250-rs、30-rs）
8. 血清移液管（ Fisherbrand ，目录号：13-676-10J 和 13-676-10k）
9. 试剂容器（Corning，目录号：4872）
10. 无菌Aeraseal细胞培养板密封剂（EXCEL Scientific，目录号：B-100）
11. Easyseal透明板密封剂（Greiner Bio-One，目录号：676001）
12. 萤火虫荧光素酶测定试剂盒2.0（ Biotium ，目录号：30085-2）
13. G418硫酸盐（Geneticin）（Thermo Scientific，目录号：11811031）
14. 稻瘟菌素-HCL（Corning，目录号：30-100-RB）
15. 嘌呤霉素二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P8833）
16. 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（CCF Media Production，目录号： CCFGP003）
17. Dulbecco 改良的 Eagles 培养基（DMEM），含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠（Fisher Scientific，目录号：10-017-CV）
18. 胎牛血清（FBS）合格（Gibco，目录号：26140-079）
19. 青霉素/链霉素100 × （CCF Media Production，目录号：CCFGK004）
20. 两性霉素 B（Fungizone）100 × （Fisher Scientific，目录号：12002-032）
21. 重组人TGF-β1（R&D Systems，目录号：240-B-002/CF）
22. 不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（CCF Media Production，目录号：CCFAL003-216T02）
23. 牛血清白蛋白（BSA）基本上不含球蛋白，低内毒素（Sigma-Aldrich，目录号：A2934-100G）
24. TMLC 野生型 (WT)、TMLC L-TGF-β1、TMLC L-TGF-β1(R249A) TMLC GARP、TMLC L-TGF-β1/GARP 和 TMLC L-TGF-β1(R249A)/GARP 细胞系。 Campbell等人描述了 TMLC 线的开发。（2020 年）。经美国加州大学旧金山分校病理学系 Stephen Nishimura 的 MTA 批准提供。
25. 重组人α v β 8 、 α v β 6和α v β 3胞外域。经美国加州大学旧金山分校病理学系 Stephen Nishimura 的 MTA 批准提供。 Campbell等人描述了这些试剂的开发和纯化。（2020 年）。
26. MACS分离缓冲液（ Miltenyi ，目录号：130-091-221）
27. EZ- Link TM 磺基-NHS-LC-生物素（ ThermoFisher Scientific，目录号：21335）
28. 抗HA抗体（ Genscript ，目录号：A01244-100）
29. 抗潜伏期相关肽（LAP）抗体，克隆AF246（R&D Systems，目录号：AF-246-NA）
30. TMLC 基础培养基（见配方）
31. 5 mg/mL Blasticidin -HCl 原液（见配方）
32. 50 mg/mL G418 硫酸盐储备溶液（参见配方）
33. 10 mg/mL 嘌呤霉素二盐酸盐原液（见配方）
34. 20 μg /mL 重组人 TGF-β1 原液（见配方）
35. 1 μg /mL α v β 3或 α v β 8胞外域涂层溶液（参见配方）
36. 1 μ g /mL 抗 LAP 涂层溶液（见配方）
37. 1% BSA 封闭溶液（见配方）
38. 1 ×荧光素酶细胞裂解缓冲液（参见配方）
39. 1 ×荧光素酶检测缓冲液（参见配方）

设备

1. 37 °C加湿培养箱，5% CO 2
2. Jouan C4i 台式离心机或同等设备，用于旋转 15 – 50 m L管（Thermo Scientific，型号： Jouan C4i）
3. 流式细胞仪（BD Biosciences，型号：LSR II）
4. 细胞分选仪（BD Biosciences，型号：FACS ARIA II）
5. 荧光素酶测定读板器（Promega，型号： Glomax Explorer）
6. Luna 自动细胞计数器或同等产品（Luna，型号：L10001-LG）
7. Hoefer RED ROCKER 摇摆平台或同等产品（Hoefer Scientific Instruments）

软件

1. GraphPad 棱镜 9 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )

程序

A. 维持稳定的 TMLC 报告细胞系
注意：对于所有细胞培养步骤，请使用无菌过滤器吸头和无菌管（参见材料和试剂）。
1. 补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% 两性霉素 B的DMEM（4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）的 T75 烧瓶（或等效物）中培养 TMLC 细胞。荧光素酶TGF-β报告盒，还用 1 mg/m L G418 补充培养基。
使用以下抗生素选择标记培养表达L-TGF-β1或 GARP各种成分的 TMLC 细胞（另见配方部分）：
• TMLC L-TGF-β1或TMLC L-TGF-β1 (R249A)：具有 1 mg/m L G418 和 10 μ g /m L嘌呤霉素的 TMLC 基础培养基。
• TMLC L-TGF-β1/GARP或TMLC L-TGF-β1(R249A)/GARP ：TMLC基础培养基，含1mg/mL G418、10 μ g /m L嘌呤霉素和 2 0 μ g /m L 杀稻瘟素。
2. 当 70 – 90% 汇合时，使用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 在 37 °C 下分离 TMLC 细胞2 分钟。应使用至少等体积的基础培养基灭活胰蛋白酶。
3. 每周两次以 1:20 的密度传代培养细胞。常规细胞培养不需要旋转和洗涤细胞。在准备功能测定时，在没有抗生素选择的情况下，将 70 – 90% 的汇合细胞以 1:5 的密度传代培养 48 小时。
注意：我们注意到如果允许达到汇合，TMLC 细胞的性能会显着降低。有关细胞系维护和质量控制的更多信息，请参阅注释部分中的“重现性注释”和“细胞系 QC 部分”。
4. × 10 6 个细胞/mL的密度冷冻保存 TMLC 细胞（冷却速度：每分钟 1°C，至 -80°C。转移细胞1 周内转入液氮储存）。

B. 检测板的制备
注意：对于转移所有试剂，我们建议使用无菌过滤移液器吸头和无菌管（参见材料和试剂）。
1. 制备重组人 α v β 8胞外域和阴性对照的储备溶液，包括 BSA、α v β 3 （不激活 TGF-β）和抗 LAP，浓度为 1 μg / mL磷酸盐缓冲盐水（ PBS）补充有 1 mM Ca 2+和 1 mM Mg 2+ （参见食谱部分）。
注意：抗 LAP 与 L-TGF-β1 结合，因此用于控制 α v β 8可能具有的结合和随后的细胞粘附影响，以及其促进 TGF-β 活化的能力。
2. 如图 1C 所示，将板溶液放在immulon 4 HBX 96 孔板上（50 μL /孔就足够了），并用透明板密封剂盖住板。在 37 °C的摇摆平台上孵育1 小时。
3. μL的 PBS清洗细胞两次，并使用多通道移液器和试剂容器在 PBS 溶液中用 1% BSA 封闭孔。在室温下孵育测定板 1 小时。
注意：在检测开始日期前，板可以在 4 °C下储存长达 48 小时。但是，为了重现性，建议在同一天使用这些板。

C. 细胞系制备和细胞接种
1. 在 TGF-β 活化测定前48小时，以 1:5 的密度拆分 70 – 90% 的汇合 TMLC 线。在这个阶段，仅在 TMLC 基础培养基中培养细胞。
注意：为了继续使用细胞系，还要在相关的重选培养基中保留一些细胞。
2. 在检测当天，使用如上所述的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 分离细胞。
笔记：细胞不应汇合。
3. 使用等体积的 TMLC 基础培养基灭活胰蛋白酶，并将细胞悬浮液转移到标记的 15 mL Falcon 管中。
4. 400 × g离心沉淀细胞悬液 5分钟。离心后，通过温和涡旋5 秒吸出上清液并在 TMLC 基础培养基中重悬细胞。使用 LUNA 细胞计数器或同等设备计数活细胞。
5. 在连续 3 倍稀释系列中准备标准曲线，从 16 ng/mL* rTGF -β1 开始，使用多通道移液器在基础培养基中进行（这可以在测定板内执行，参见图 1C）。测定板中标准的最终体积应为 100 μL 。
注意：*为清楚起见，当随后将等体积的 TMLC 细胞悬液添加到每个孔中时，这会将每个标准稀释 50%，与图 1C 中描述的稀释系列相匹配。标准曲线对于控制 TMLC 细胞系之间 TGF-β 敏感性的差异至关重要。
6. 稀释至 1.5 × 10 5 个细胞/mL 的浓度，然后使用多通道移液器和试剂容器将100 μL细胞悬液/孔接种到immulon 4 HBX 96 孔检测板上（图 1C-D) 中显示了检测板格式的示例。
注意：虽然 TMLC 细胞不易结块，但建议在将细胞从试剂容器转移到检测板之前上下移液 3 次。
7. 用Aeraseal板盖盖板，并在标准细胞培养条件下（37 °C， 5% CO 2 ，在加湿的细胞培养箱中）孵育 16 – 18 小时。
注意：为了测定重现性，确保实验重复之间的孵育时间一致。

D. 分析开发
1. 确保荧光素酶检测裂解缓冲液、荧光素酶检测缓冲液和 PBS 在检测开发前平衡至室温。
2. 使用多通道真空歧管通过吸入介质来准备细胞裂解。使用多通道移液器和试剂容器，立即用 300 μ L的 PBS 清洗细胞两次。从这一点来看，没有必要保持无菌技术。
注意：TMLC 细胞牢固地粘附在培养塑料上，所有抽吸步骤都可以使用真空歧管进行以提高效率。
3. 在 100 μL荧光素酶测定裂解缓冲液中裂解细胞，并在室温下在摇摆平台上孵育 30 分钟。
注意：为减少板内变异性，不建议手动刮孔。
4. 将 80 μ L的裂解物从immulon 4 HBX 板的每个孔中转移到 96 孔细胞培养白板 (Costar 3917) 中。
5. 使用Glomax Explorer (Promega) 记录荧光素酶活性，设置如下：
荧光素酶测定缓冲液的注射量（100 μ L ），等待 2 秒，积分（10）间隔（0.3 秒）。

E. 数据分析和预期结果
1. rLU值中减去记录在 BSA 控制井中的原始相对光单位 ( rLU ) 数据。这允许去除每个细胞系的背景信号。
注意：由于细胞系之间背景读数的差异，减去每个细胞系的 BSA 对照数据很重要。
2. β治疗的标准曲线进行插值，转换背景减去rLU数据以表示每毫升活性 TGF-β 纳克（图2B ）。
注意：这可以更准确地比较不同 TMLC 系之间的 TGF- β信号量，因为它还可以控制观察到的 TGF- β敏感性差异。
3. 使用GraphPad prism 7 或更高版本呈现数据，如图 2D 所示。

图 1.评估重组 α v β 8胞外域从可释放和不可释放形式的 L-TGF- β1促进细胞内在 TGF- β信号传导的能力的分析设计。
A. TMLC TGF- β报告细胞的卡通描绘。 TMLC 是水貂上皮细胞的稳定克隆，过表达与荧光素酶报告盒融合的 PAI-1 启动子序列（Abe等人，1994）。 TMLC 细胞表达高水平的 TGF- β Rs，其能够在与成熟 TGF- β结合时启动 TGF- β信号传导。在 TGF- β信号传导的下游， pSMAD驱动荧光素酶的表达，并且可以在细胞裂解和使用荧光素酶测定缓冲液（含有 D-荧光素底物）评估荧光素酶活性后报告TGF- β信号传导。为了建立细胞内在的 TGF- β信号模型，我们过表达衔接分子 GARP 和/或 L-TGF- β1 ，或不可释放形式 (R249A)。 B. TMLC L-TGF- β 1/GARP 细胞在固定化 α v β 8胞外域培养物中的卡通描绘。在这种情况下，将 TMLC L-TGF- β 1/GARP 细胞（或对照）铺板到固定的整联蛋白胞外域（或对照底物）上，然后测量细胞的荧光素酶活性。 C.评估 α v β 8是否可以支持细胞内在 TGF- β活化的测定形式。如测定程序部分所述，将包括 BSA 蛋白（绿色）、α v β 3胞外域（红色）和抗 LAP（黄色）在内的阴性对照与 α v β 8胞外域（紫色）一起固定。然后将 TMLC WT、单独的 TMLC GARP 和单独的 TMLC L-TGF- β1对照细胞一式三份接种到各种底物上，以便将它们与 TMLC L-TGF- β1 /GARP 测试中产生的信号进行比较细胞。 D.评估 α v β 8促进不可释放 TGF- β的细胞内在 TGF- β信号传导的能力的测定形式。在这里，该测定被修改为包括单独的 TMLC L-TGF- β1 、单独的 TMLC L-TGF- β1 (R249A) 和 TMLC L-TGF- β1 /GARP 的对照，以便可以将它们与TMLC L-TGF- β1 (R249A)/GARP 细胞中产生的信号。在所有情况下，使用已知浓度的重组人 TGF- β1 （3 倍连续稀释，从 8 ng/mL）处理的每种细胞类型的独特标准曲线，以便 TGF- β反应可以在细胞系，数据可以表示为TGF- β1信号的浓度 (ng/mL) (Abe et al. , 1994; Campbell et al. , 2020) 。

图 2.与图1D相同准备的检测板的原始数据和数据分析工作流程示例。
A.分析开发后的相对光单位 ( rLU ) 读数。数据以热图格式显示（红色为高rLU值，蓝色为低值）。 B.为本试验中使用的所有四种 TMLC 系制备了已知rTGF - β1浓度的标准曲线，以便定量分析 TGF- β信号传导和细胞系之间TGF- β敏感性的标准化。 C.在从每个样品中减去 BSA 对照孔后，A 中的数据以图形格式显示。 D.然后，通过从 (B) 中所示的各个标准曲线进行插值，将减去 BSA 背景的 rLU数据转换为每个细胞系的 ng/mL TGF- β信号传导。具有多个技术重复的数据集以平均值±标准偏差 (SD) 的形式呈现。

笔记

支持观察
在这些试验的开发过程中，我们试图评估成熟的 TGF- β在被整合素激活后是否从 TMLC L-TGF- β1 /GARP 细胞的表面释放。我们采取了两种方法来解决这个问题。首先，我们保留了本协议中进行的化验中的条件培养基，并将它们重新镀到新的 TMLC WT 细胞上。这使我们能够评估在每种测定条件下释放的成熟 TGF- β的浓度。其次，我们使用可渗透的transwell细胞培养插入物进行了上述测定。这使我们能够固定两个TMLC细胞群：一个可以直接附着在整合素上的细胞群，以及一个由可渗透插入物分隔的细胞群，从而可以在整个测定过程中测量 TGF- β的释放。当在这些支持性分析中评估 TMLC TGF- β信号传导时，它可以深入了解在 α v β 8介导的 TGF- β激活后释放的成熟 TGF- β的量（参见Campbell等人，2020；Seed等人。 , 2021) 。

其他检测形式
我们已经成功地用固定的整合素胞外域代替了 α v β 8表达细胞。如果 α v β 8在 α v β 8无效细胞系中异位表达，则通过将 TMLC 细胞与模拟转染细胞一起孵育来减去背景。通过比较乱序短同源核糖核酸 (shRNA) 转导细胞与 ITGB8 shRNA 转导细胞或使用 α v β 8特异性抑制剂来测试表达内源性 α v β 8的细胞系。使用与 TMLC 细胞共培养的α v β 8表达细胞进行测定，将其接种到标准 96 孔培养板（Corning，目录号：3599）上，其中 3 × 10 5整合素表达细胞与 1.5 × 10 5 TMLC 报告基因一起接种细胞（Seed等人，2021）。
整合素 α v β 6还具有激活 TGF-β 的功能，我们发现在这些测定中，α v β 6以与 α v β 8相当的方式支持细胞内在 TGF-β 活化。

再现性注意事项
除了确保所有细胞系都表达相似水平的 L-TGF-β 和/或 GARP，我们建议将 TMLC 细胞系的继代培养限制在 5 次连续 1:20 代，因为这会降低 TGF-β 发生自然变异的机会细胞系之间的记者敏感性。为了维持细胞储备，在每次传代时冷冻多个小瓶是很有用的。如果任何 TMLC 系达到汇合，建议对所有使用的细胞系的新小瓶进行复苏。为了确保结果的准确性，尽可能使用三个技术重复进行检测，因为这些检测中孔间的变异性很常见。在检测开发前立即使用显微镜记录细胞形态也很有用，因为已发现检测之间的形态变化与意想不到的结果相关。因此，我们不建议在 96 孔细胞培养白板中执行所有步骤。

细胞系 QC 分析
为确保细胞系表达一致水平的 L-TGF-β1 和细胞表面衔接蛋白 GARP，应使用流式细胞仪和细胞分选仪对细胞系进行常规筛选和分选。绿色荧光蛋白 (GFP) 用作 L-TGF-β1 表达的替代标记，Anti-LAP（克隆 AF246）用于表征 TGF-β1 细胞表面表达，而抗 HA（克隆5E11D8）用于检测 GARP 表达。对于细胞表面表达的标准化，可以根据 GFP 阳性和细胞表面潜伏期相关肽 (LAP) 阳性对细胞进行分类。在所有情况下，细胞在 MACS 缓冲液中染色，在冰上使用适当的抗体 15 分钟，然后用适当的荧光团偶联抗体进行洗涤和染色。

证明 TMLC GARP/L-TGF- β1 (R249A) 细胞表达不可切割形式的 L-TGF- β1 、L-TGF- β1 (R249A)/GARP 表达或 WT L-TGF- β1 /GARP TMLC使用 EZ- link磺基-NHS 生物素对细胞进行表面生物素化，并使用抗 HA 进行免疫沉淀，在非还原条件下通过 4-12% 梯度十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离，免疫印迹，用链霉亲和素探测HRP，并通过化学发光检测，基本上如所述(Mu et al. ，2002) 。该测定证实了 GARP 与 WT L-TGF-β1、L-TGF-β1(R249A) 的关联，以及 L-TGF-β1(R249A)/GARP TMLC 细胞中成熟 TGFβ1 没有裂解 LAP（本段改编自Campbell等人，2020 年）。

食谱

-μm过滤器对细胞培养中使用的所有试剂进行过滤灭菌：

1. TMLC 基础培养基
440 mL Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)，含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠
50 毫升 FBS 合格
5 mL 100 ×青霉素/链霉素
5 mL 100 ×两性霉素 B
2. 5 毫克/毫升杀稻瘟菌素-HCl原液
将 50 mg Blasticidin -HCl 瓶的内容物溶解在 10 m L细胞培养级 H 2 O 中。在 4°C 下最多储存 2 周（在基础培养基中稀释 1:500）。
3. 50 mg/m L G418 硫酸盐储备溶液
将 1 g G418 硫酸盐瓶的内容物溶解在 20 mL 的细胞培养级 H 2 O 中，并在 4 °C 下避光储存长达 1 个月（在基础培养基中稀释 1:400）。
4. 10 mg/mL 嘌呤霉素二盐酸盐原液
将 10 mg 盐酸嘌呤霉素瓶的内容物溶解在 1 mL 的细胞培养级 H 2 O 中。在 4 °C 下避光储存长达 1 个月（在基础培养基中稀释 1:1,000）。
5. 20 μg / mL重组人 TGF-β1 原液
含有 1 mg/mL 牛血清白蛋白的 100 μL无菌 4 mM HCl 中溶解 2 μg小瓶。将 1:1,250 稀释到 TMLC 基础介质中，以制备 16 ng/mL TGF-β 标准曲线最高剂量。使用 TGF-β 重组培养基对于达到准确的浓度至关重要。
6. 1 μg /m L α v β 3或 α v β 8胞外域涂层溶液
将补充有 1 mM Ca 2+和 1 mM Mg 2+的 PBS 中的重组整合素稀释至 1 μg /mL的工作浓度（参见Campbell等人，2020 年和 Takasaka等人，2018 年，了解有关重组整合素的更多信息）。
7. 1 μ g /m L抗 LAP 涂层溶液
制备 200 μg /mL 抗 LAP 抗体的储备溶液，通过在无菌 PBS 中稀释来克隆 AF246。通过在补充有 1 mM Ca 2+和 1 mM Mg 2+的 PBS 中稀释，制备 1 μg /mL 工作原液（或所需的化学计量当量浓度为 α v β 8 ）。
8. 1% BSA 封闭液
将 1 克 BSA 粉末溶解在 100 mL的细胞培养级 PBS 中，不含钙和镁。
9. 1 ×荧光素酶细胞裂解缓冲液
2 O稀释一份裂解缓冲液，并立即用于细胞裂解。
10. 1 ×荧光素酶检测缓冲液
通过将 1 mL 的 H 2 O 添加到 10 mg D-荧光素中来制备 D-荧光素（这可以储存在 –20 °C并解冻最多五次）。
毫升荧光素酶检测缓冲液中加入 20 μL D-荧光素，制成 1 ×工作溶液 - 始终保护溶液避光。

致谢

这项工作由 NIH 赠款 R01HL134183 资助。我们要感谢哥本哈根大学生物系 Alberto J. Taurozzi 博士提供的有用建议。这些协议改编自 Abe等人。 ( 1999)，谁首先产生了 WT TMLC TGF-β 报告细胞，并在 Campbell等人中使用。 ( 2020) 和 Seed等人。（ 2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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2. Campbell, MG, Cormier, A., Ito, S., Seed, RI, Bondesson , AJ, Lou, J., Marks, JD, Baron, JL, Cheng, Y. 和 Nishimura, SL (2020)。 Cryo-EM 揭示了整合素介导的 TGF-β 激活，而不会从潜在的 TGF-β 中释放出来。单元格180(3)：490-501.e416。
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8. Mu, D.、Cambier, S.、 Fjellbirkeland , L.、Baron, JL、Munger, JS、 Kawakatsu , H.、Sheppard, D.、Broaddus, VC 和 Nishimura, SL (2002)。整联蛋白αvβ8通过TGF- β1的 MT1-MMP 依赖性激活介导上皮稳态。细胞生物学杂志 157（3）：493-507。
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12. Stockis , J., Lienart , S., Colau , D., Collignon, A., Nishimura, SL, Sheppard, D., Coulie , PG 和 Lucas, S. (2017)。用靶向整合素αvβ8的抗体在体内阻断人Tregs的免疫抑制。 Proc Natl Acad Sci USA 114（47）：E10161-E10168。
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