材料和试剂

1. 1.5 mL微量离心管（ Axygen ，目录号： MCT-150-C）
2. MgCl 2 （BBI Life Sciences，目录号：A601336-0500）
3. HEPES（BBI Life Sciences，目录号：A600264-0250）
4. KOH（ Sangon ，目录号：A610441）
5. NaCl（Sigma，目录号：S9625）
6. DTT（VETEC，目录号：V900830）
7. 纯化的 DCL3 蛋白（在 150 mM NaCl、5 mM MgCl 2 、2 mM DTT 和 50 mM HEPES-KOH，pH 8.0的缓冲液中自行制备）
8. RNA寡核苷酸（Takara）
9. 尿素（Sigma，目录号：U1250）
10. 40％丙烯酰胺/ b is-丙烯酰胺溶液（19：1）（ Sangon ，目录号：B546012-0500）
11. N，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（ Amresco ，目录号：M146）
12. 过硫酸铵（APS）（ Amresco ，目录号：M133）
13. 硼酸（Energy Chemical，目录号：A060316）
14. Tris 底座（VETER，目录号：WXBD5491V）
15. EDTA（ Sangon ，目录号：E671001）
16. DEPC水（ Sangon ，目录号：B501005）
17. 2 × RNA凝胶加载缓冲液（ Sangon ，目录号：B300596）
18. SYBR TM Gold（Invitrogen，目录号：S11494）
19. RNA标记（Takara，目录号：3416）
20. RNaseZap （Invitrogen，目录号：AM9780）
21. 反应缓冲液 (50 mL)（参见配方）
22. 10× TBE（1 L）（见食谱）
23. 变性凝胶混合物（500 mL）（参见食谱）
24. 运行缓冲液 (1 L)（参见配方）

设备

1. 20 cm × 20 cm 玻璃板（北京六一仪器，定制设计）
2. 1-mm 厚垫片（北京六益仪器，定制设计）
3. 凝胶密封胶带
4. 凝胶梳（北京六一仪器，定制设计）
5. 活页夹
6. 高温干浴（ Yooning ，目录号：YN-GO2-156）
7. 离心机（Eppendorf，Centrifuge 5424R）
8. 高压电泳系统（BIO-RAD、 PowerPac TM HV 电源）
9. 凝胶电泳室（ Beijingliuyi ，目录号： DYCZ-22A）
10. 多功能成像仪（GE Healthcare， Amersham Imager 600）
11. Orbital Shaker（ Yooning ，目录号： CS-200）

软件

1. ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij )
2. 起源 7.0 ( http://www.originlab.com )

程序

A. 切割反应（见图 1）
1. 使用 Bac-to-Bac 系统 (Invitrogen) 在昆虫细胞系 sf9 中表达重组可溶性 N 末端链球菌标记 AtDCL3，并通过 Strep (IBA Life Science)、Mono-Q (GE Healthcare) 和Superdex G200 色谱柱 (GE Healthcare)，如所述 (Wang et al. , 2021)。
2. 将纯化的蛋白质缓冲液改为150 mM NaCl、5 mM MgCl 2 、2 mM DTT 和 50 mM HEPES-KOH，pH 8.0，浓缩至 1 mg/mL，分装至 10 – 20 μL /管，液体冷冻氮气，-80℃保存。在切割反应之前，将含有冷冻蛋白质的管置于冰上 30 分钟，以使蛋白质融化。
3. 将 30-nt 引导ssRNA (5'-phos-AACAAGCGAAUGAGUCAUUCAUCCUAAGUC) 和 31-nt 补体ssRNA (GACUUAGGAUGAAUGACUCAUUCGCUUGUUC) 混合在一个管中，摩尔比为 1:1，在水中。通过将混合物加热到 95°C，将两个ssRNA退火成 dsRNA ，在高温干浴 1 分钟。将试管置于室温下缓慢冷却。根据不同的 Dicers 和实验设计，RNA 长度和序列会相应变化。
4. 分别在 10 μL 反应缓冲液（盖子上）中制备 0.01 nmol dsRNA，在 40 μL反应缓冲液（在管中）中制备 0.003 nmol 蛋白质（蛋白质和 RNA 的比例可能因不同酶而异）。
5. 同时轻轻旋转所有试管，混合蛋白质和 RNA，同时启动反应。
6. 将混合物放入 37°C 的培养箱中 5 分钟。根据不同的酶和实验目的，反应时间可以设置为 1 分钟到几个小时。
7. 添加 50 µL 的 2 × RNA 加载缓冲液到管盖。然后，同时旋转所有试管，将上样缓冲液转移到反应混合物中，同时停止反应。
8. 将样品加热至 94°C 5 分钟，然后迅速将其转移到冰上 10 分钟。
9. Eppendorf旋转冰冷的样品管 5424R在 13,500 × g和 4 °C 下离心1 分钟。
10. 每个实验应重复 3 次。

图 1. 切割反应和样品制备的工作流程

B. 尿素 PAGE 凝胶的制备（Adachi 和 Yu，2014；Green 和 Sambrook，2021；Rio等人，2010；Summer等人，2009）。
1. RNaseZap处理凝胶板，然后用不含 RNase 的水清洗。
2. 将较大的玻璃板放在工作台顶部，并在两侧布置 1 mm 垫片，而不是玻璃板的顶部和底部。盖上第二块玻璃板，用 1 mm 垫片组装 20 × 20 cm 凝胶板。
3. 用凝胶密封胶带密封凝胶板的三张幻灯片，形成厚度为 1 mm 的密封狭缝（更长和更薄的凝胶导致更好的分辨率）。
4. 用八个或九个粘合剂（每侧三个，底部两个或三个）夹住板的两侧，将凝胶板和垫片夹在一起。
5. 在 50 mL 管中制备 34.65 mL 的 15% 丙烯酰胺凝胶混合物（见配方）。
6. 将 350 μL 的 APS 添加到 50 mL 管中，并快速小心地混合溶液，以防止气泡。
7. 将 10 μL 的 TEMED 添加到 50 mL 管中，并快速小心地混合溶液，以防止气泡。
8. 将混合物倒入狭缝中（注意：避免气泡），插入 26 孔梳子，等待 30 分钟，让凝胶聚合。
9. 取下梳子和胶带，将凝胶板安装到凝胶运行装置上。将 0.5 × TBE 添加到上部和下部水库中。将铝板夹在凝胶板的正面。
10. 在 5 W 下预运行凝胶 60 分钟，以平衡和预热凝胶。

C. 运行凝胶
1. 用注射器针头用 0.5 × TBE彻底冲洗孔，直到它们尽可能清澈。
2. 将样品装入井中。
3. 的一致功率运行凝胶 3.5-4小时。

D. 可视化 SYBR Gold 染色的 RNA
1. 从凝胶运行装置中取出凝胶板。使用金属刮刀将顶部玻璃板从凝胶上撬开。
2. 在一个盒子里加水。小心地将凝胶翻转到水面。将凝胶转移到盒子中，使用水力，通过摇晃盒子。
3. 从盒子中取出水，然后将 30 mL 的 0.5 × TBE 添加到盒子中，以浸没凝胶。
4. 在暗室中将 3 μL 的 10,000× SYBR Gold 添加到盒子中，并在振动筛上以 50 rpm 的速度摇动凝胶 40 分钟。
5. 用不含 RNase 的水清洗凝胶。
6. 将凝胶放在多功能成像仪的荧光板上，以 302 nm 的波长可视化 RNA。凝胶图像可以 .tiff 格式存储。

E. 通过 ImageJ 计算切割活动（见图2 ）（Wang等人，2021）
1. 从网站https://imagej.nih.gov/ij下载 ImageJ 程序。
2. 转到“文件”选项卡，单击“打开”将凝胶图像加载到 ImageJ，并反转背景和条带，这将显示图像为黑色背景和白色条带。
3. 转到“分析”选项卡，单击“设置测量值”，选中“积分密度”框，然后单击“确定”。
4. 测量没有任何条带的背景的原始综合密度 (RID)，因为它存在于可以包围最大条带的矩形内。
5. 分别测量所有目标波段。然后将生成的数据文件保存为 Excel 电子表格。
6. 每个波段的每个相对 RID 值是通过用测量的背景 RID 减去测量的 RID 值来计算的。

图 2. ImageJ 处理的工作流程

第 1 步，将凝胶图像加载到 ImageJ 程序中。第 2 步，反转背景和波段。泳道 1-6 代表六个样本。带 1 显示的是没有任何带的矩形圆圈，用作背景区域。这个矩形应该足够大以包围最大的带。带 2-7 是未被切割的底物。 Band 8 – 13 是对应样品的切割产品。第 3 步，将数据保存为 Excel 文件。每个样本波段的相对 RID 值计算为波段的测量 RID 值减去波段“1”的测量背景 RID 值。
每个样品的切割活性由面板下部波段的相对 RID 的切割活性除以同一面板的下部和上部波段之和，然后乘以 100。此工作流程仅代表一个单次处理。应进行三个重复的实验。应计算一个样品的三个重复的标准偏差 (SD) 值。

F. Origin 7.0 中的统计分析
1. 准备 Origin 7.0 程序 ( http://www.originlab.com )。
2. 输入三个实验的感兴趣的计算值复制到 Origin 程序中。
3. 进入“统计”选项卡，点击“假设检验” -“两个样本t检验”，分析两个样本之间的差异。
4. 输入与特定样本相关的不同P值，将P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001、P < 0.0001的值分别标记为“﹡”、“﹡﹡”、“﹡﹡﹡”、“﹡﹡” ﹡﹡”。
5. 进入“列”表，分别“设置”为“样品名称”、“平均值”、“SD”、“﹡”，分别对应“X”、“Y”、“Y误差”、“标签” .
6. 进入“Plot”选项卡，点击“Column/Bar/Pie”，绘制相应的统计条形图（图3）。

体外切割检测结果示例。
x 轴表示不同的样品，y 轴显示切割比率的平均值，误差条表示 SD。样品2-6的切割活性低于样品1，差异显着。

笔记

这些程序中使用的所有水都是不含 RNase 的水。每一步都应防止RNase污染。
SYBR Gold 染色剂应避光保存。

食谱

1. 反应缓冲液（50 毫升）
试剂最终浓度数量
氯化钠 (5 M) 150 毫米 1.5 毫升
HEPES-KOH (1 M, pH 8.0) 50毫米 2.5 毫升
氯化镁2 (1 M) 5毫米 0.25 毫升
数码地面电视 (1M) 2毫米 0.1 毫升
去离子水不适用 45.65 毫升

2. 10 × TBE（1升）
试剂最终浓度数量
三碱基 890 毫米 108 克
乙二胺四乙酸 20毫米 6克
硼酸 890 毫米 55 克
去离子水无/一总共加到 1 L

3. 变性凝胶混合物 (500 mL)
试剂最终浓度数量
1 0 × TBE 1 × 50 毫升
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1) 15% 187.5 毫升
尿素 8M 240.24 克
去离子水无/一总共添加至 500 mL

4. 运行缓冲液 (1 L)
试剂最终浓度数量
10 × TBE 0.5 × 50 毫升
去离子水 - 950 毫升

致谢

该工作得到了国家重点研发计划（2016YFA0503200）、深圳市科技计划（JCYJ20200109110403829和KQTD20190929173906742）、南方科技大学（G02226301）、广东省高等学校植物细胞工厂分子设计重点实验室（2019KSYS006）的支持研究团队基金(2016ZT06S172) 到 SL NIH (R35GM130272) 到 SEJSEJ 是霍华德休斯医学研究所的研究员。这里介绍的协议改编自 Summer等人的协议。（2009）；彼得罗夫等人。（2013）；足立等人。（2014）；格林等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

1. Adachi, H. 和 Yu, YT (2014)。使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的 RNA 产物。 Curr Protoc Mol Biol 105：第 4 单元 20。
2. Borges, F. 和 Martienssen, RA (2015)。植物中不断扩大的小 RNA 世界。 Nat Rev Mol Cell Biol 16（12）：727-741。
3. Chen, HM, Chen, LT, Patel, K., Li, YH, Baulcombe, DC 和 Wu, SH (2010)。 22 个核苷酸的 RNA 在植物中触发次级 siRNA 生物发生。 Proc Natl Acad Sci USA 107（34）：15269-15274。
4. Dodd, DW 和 Hudson, RH (2007)。通过变性 PAGE 分析和纯化肽核酸。电泳28(21): 3884-3889。
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6. Fukudome, A.、Kanaya, A.、Egami, M.、Nakazawa, Y.、Hiraguri, A.、Moriyama, H. 和 Fukuhara, T.（2011 年）。 DRB4（一种 dsRNA 结合蛋白）对拟南芥 Dicer-like 4 的体外dsRNA 切割活性的特殊要求。 RNA 17（4）：750-760。
7. Gassmann, M.、Grenacher, B.、Rohde, B. 和 Vogel, J. (2009)。量化蛋白质印迹：密度测定的陷阱。电泳30（11）：1845-1855。
8. Green, MR 和 Sambrook, J. (2021)。根据大小分离 RNA：通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶进行 RNA 电泳。冷泉港协议2021(1)。 doi：10.1101/pdb.prot101766。
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16. Tuma, RS, Beaudet, MP, Jin, X., Jones, LJ, Cheung, CY, Yue, S. 和 Singer, VL (1999)。 SYBR Gold 核酸凝胶染料的表征：一种优化用于 300 nm 紫外透射仪的染料。肛门生物化学268（2）：278-288。
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