材料和试剂

1.1.5 mL微量离心管，无菌（ Sarstedt ，目录号：72.690.01）
2.0.5 – 10 µL 超长、100–1,250 µL 超长、10–100 µL 过滤移液器吸头（ Biozym ，目录号：VT0200、770600；Eppendorf，目录号：30.077.547）
3.QIAamp ® DNA Mini Kit（Qiagen，目录号：51304）
4.无水乙醇（Merck，目录号：1.00983.2500），不要使用变性酒精
5.不含 DNase 和 RNase 的水（Promega，目录号：P1193）
6.LightCycler ®毛细管 20 µL（Roche，目录号：4929292001）
7.LightCycler ® Fast Start DNA Master HybProbe （Roche，目录号：12239272001）
8.引物和杂交探针（TIB Molbiol GmbH；表 1）
9.底漆重组和储存（工作库存准备说明）。
10.EDTA 血液样本

表 1. 针对小亚基 18S rRNA 基因的 157–165 bp 片段的引物和 FRET 探针，用于检测和同时区分相应的疟原虫物种。
寡核苷酸顺序
血浆1a _

血浆2a _

恶意软件b

MalLC640 b
5' - GTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA-3 '

5' - AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA-3 '

5 ' -CTTTCATCCAACACCTAGTCGGC；
3 '标记荧光素

5 ' -TAGTTTATGGTTAAGATTACGACGGT;
5 '标记，LC red 640，3 '磷酸化
引物 Plasmo 1 和Plasmo 2 由 Rougemont等人出版。 (2004)
b FRET探针MalFL和 MalLC640 由 Schneider等人发表。 (2021)

设备

1.0.5–10 µL、10–100 µL 和 100–1,000 µL 微量移液器（Eppendorf，目录号：3123000020、3123000047、3123000063）
2.ThermoMixer （用于 1.5 mL 管的 Eppendorf ThermoMixer C + Smart Block；Eppendorf，目录号：5382000015，EPS360000036）
3.微量离心机（热 Scientific TM ， Pico TM 21 微量离心机，目录号：75002415）
4.LightCycler ® Instrument 2.0（Roche，目录号：03531414001）
5.LightCycler ®适配器（Roche，目录号：11909312001）
6.Vortex（Vortex-Genie 2，Sigma-Aldrich，目录号：Z258423）

程序

引物储备溶液的制备和 FRET-qPCR 设置分别在不同的生物安全柜中进行。
DNA 提取应在干净的工作台上进行，该工作台仅用于 DNA 提取，并配有一套单独的移液器，仅用于此目的。此外，使用防气溶胶移液器吸头可防止假阳性结果。在 DNA 提取和 FRET-qPCR 设置期间，应多次更换手套，以避免不同（有时为高阳性）样品之间的交叉污染。在 PCR 反应完成后从循环仪中取出毛细管时，请注意不要损坏毛细管！含有阳性样品的破损毛细管有携带污染的风险，必须仔细清洁，并更换手套！此外，在 FastStart DNA Master HybProbe混合液中，dTTP 被dUTP取代，从而允许使用尿嘧啶-N-糖基化酶 (UNG) 作为额外的残留预防措施。

A.人体血液样本
我们推荐含有乙二胺四乙酸 (EDTA) 的试管以防止血液凝固。与肝素（也用作抗凝剂）相比，EDTA 不抑制 PCR，并且经常用于血液学和分子诊断。必须始终佩戴手套，因为人体血液样本可能具有传染性。此外，应佩戴护目镜，以尽量减少在气溶胶产生、飞溅或其他意外溢出时感染的机会。室温下的邮政运输不应超过 48 小时。然后，血样应储存在 4°C 下，第二天应进行 DNA 提取。或者，将血液样本储存在 -20°C 直到可以提取 DNA。

B.DNA 提取（ QIAamp DNA Mini 试剂盒）
试剂盒内容： QIAamp Mini Spin Columns、2mL 收集管、Buffer AL、Buffer AW1（浓缩液）、Buffer AW2（浓缩液）、Buffer AE、Proteinase K。所有组分在室温下（15- 25℃）。
所有离心步骤均在室温(15–25°C) 下进行。短暂离心意味着以最大速度 5-10 秒；这足以从盖子中去除液体，并将内容物收集在管底部。
1.如瓶子上所示，将无水乙醇添加到缓冲液 AW1 和 AW2 中。
2.将 20 μL 的蛋白酶 K 移入 1.5 mL 微量离心管的底部。
3.添加 200 µL EDTA 血液（在移取 200 µL 之前将试管倒置几次！）
4.加入 200 μL 缓冲液 AL，涡旋15 秒混合。
注意：不要将蛋白酶 K 直接添加到 Buffer AL 中。
5.在ThermoMixer中孵育，在 56°C 下摇动 10 分钟。
6.短暂离心管子，从盖子上去除液滴。
7.加入 200 μL 的无水乙醇，涡旋 15 s，并短暂离心管。
8.小心地将混合物 (620 µL) 涂在QIAamp Mini 旋转柱上（在 2 mL 收集管中）。关闭盖子并在 ≥6,000 × g下离心1 分钟。将离心柱放入新的 2 mL 收集管中，并丢弃含有滤液的管。
9.加入 500 µL 缓冲液 AW1，并在 ≥6,000 × g下离心1 分钟。
10.丢弃滤液和收集管。
11.将离心柱放入新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL Buffer AW2，以 14,000 × g离心3 分钟。
12.丢弃滤液和收集管。
13.将离心柱放入新的 2 mL 收集管（未提供）中，并以 14,000 × g离心1 分钟，以消除可能的 Buffer AW2 残留。
14.将旋转柱放入干净的 1.5 mL 微量离心管中，加入 100 μL AE 缓冲液，室温孵育5 分钟。以≥6,000 × g离心1 分钟，从离心柱中洗脱纯化的 DNA。
15.将 DNA 储存在 4°C 直到 qPCR 设置（在 4°C 下稳定数周，或在 -20°C 冷冻时稳定 5 年）。

C.FRET-qPCR
1.准备引物和探针原液（参见工作原液制备说明）。
2.LightCycler ® Fast Start DNA Master HybProbe试剂盒储存在 -25–-15°C：试剂盒内容：小瓶 1a ( LightCycler ® Fast Start Enzym )、小瓶 1b ( LightCycler ® Fast Start 反应混合物)、小瓶 2 (MgCl 2 stock溶液，25 mM）和小瓶 3（H 2 O，PCR 级）。
3.所有离心步骤均在室温(15–25°C) 下进行。短暂离心意味着以最大速度 5-10 秒；这足以从盖子中去除液体，并将内容物收集在管底部。
4.准备LightCycler ® Fast Start DNA Master HybProbe （10 ×浓缩）：解冻一个小瓶 1a 和一个小瓶 1b。
5.短暂离心小瓶 1b 和一个小瓶 1a（酶）。
6.从小瓶 1b 中吸取 60 µL 到小瓶 1a 中，上下吹打 5 次轻轻混匀。不要涡旋！
7.用提供的新标签标记小瓶 1a（红帽），现在是小瓶 1。添加日期；该试剂可在 4°C 下稳定 7 天。
8.解冻并混合小瓶 2 和小瓶 3，直到所有冷冻部分消失。简要离心表 2 中列出的所有管。

表 2. FRET-qPCR 混合物制备
试剂一次反应的体积 (µL)
水，PCR 级（小瓶 3）
MgCl 2储备溶液，25 mM（小瓶 2）
血浆1 (20 µM)
等离子2 (20 µM)
MalFL (4 µM)
MalLC640 (4 µM)
FastStart DNA Master HybProbe （小瓶 1）6.6
2.4
1.0
1.0
1.0
1.0
2.0
总容积15.0

9.如表 2 中所述，为所需的反应数量加上一个额外的反应准备 FRET-qPCR 主混合物。
10.通过上下移液小心混合所有试剂。不要涡旋混合主混合物！
11.短暂离心 FRET-qPCR 主混合物。
12.将预冷的冷却块从冰箱中取出，并将所需数量的毛细管放入预冷的离心机适配器中。将阴性对照置于位置 1（PCR 级水），将阳性对照置于位置 2（恶性疟原虫DNA），然后是样品。
13.吸取 15 μL 的混合物到每个预冷的LightCycler毛细管中。
14.添加 5 μL 的 DNA 模板，或分别控制。
15.添加 DNA 后立即用塞子密封每个毛细管（避免错误）。
16.将适配器（包含毛细管）放入标准台式微量离心机中。
17.以 700 × g (3,000 rpm) 的速度离心8 秒。
18.将毛细管转移到LightCycler Instrument 的样品转盘中。
19.如表 3 中所述循环样品。

表 3. LightCycler ® 2.0 系统 FRET-qPCR 协议
将表中未列出的所有协议参数设置为“0”。
分析模式循环目标温度a保持时间采集模式b
没有1变性
95°C
10 分钟
没有
没有10骑自行车（触地得分）
95°C
69–58°C
斜率 =5°C/秒
72°C
5 秒
10 秒

15 秒
没有
单身的

没有

量化
35量化
95°C
58°C
斜率 =5°C/秒
72°C
5 秒
10 秒

15 秒
没有
单身的

没有
熔化曲线1熔化曲线
95°C
50°C
70°C
斜率 =0.2°C/秒20 秒
20 秒
0

没有
没有
连续

没有1冷却
40°C
30 秒
没有
a温度转变速率/斜率是 20°C/秒，除非另有说明。
b默认通道 640 nm。

数据分析

LightCycler ®软件版本 4.05 或更高版本
1.使用对照进行定性检测分析。
2.毛细管 1 被定义为阴性对照，不含 DNA 。
3.毛细管 2 定义为阳性对照（恶性疟原虫DNA）。
4.如果其中一个控制未能按预期运行，则软件认为未知的样品反应不可靠：“无效”。如果控制按预期执行，未知样品的结果将在组合列中显示为“阳性”或“阴性”。
5.软件会自动为每个阳性样本（包括阳性对照）生成 Cp 值。
6.要执行熔化温度分析，请从分析工具栏中选择 Tm 调用。在熔解峰显示中，熔解峰和计算的 Tm 值会显示出来，必须加以控制。只有当软件无法正确计算 Tm 值时，才应使用熔化峰图表中的手动 Tm 滑块手动调整到峰值最大值。（解链温度的差异取决于错配的类型、探针序列内的错配位置以及与错配直接相邻的碱基对）。根据 FRET-qPCR 中的 Tm 值，将样本分配给恶性疟原虫(Tm 63.5–66°C)、疟疾疟原虫( Tm 63.0–63.5°C) 、卵形疟原虫(Tm 58–60°C ) ) 和间日疟原虫/诺氏疟原虫(Tm 56–57.5°C) 分别（图 1）。
7.基于 Tm 值的疟疾物种分化（间日疟原虫、卵形疟原虫、疟原虫和恶性疟原虫）（ Schneider等人，2021）。

图 1. 基于 Tm 值的物种分化。
恶性疟原虫（红色）、疟疾疟原虫（绿色）、卵形疟原虫（淡紫色）和间日疟原虫（灰色）的实时 PCR 后扩增子的熔解曲线（Schneider等人，2021）。

工作库存准备说明
为引物和探针制备储备溶液。
1.冻干的寡核苷酸应在室温或 4°C 下避光储存。溶解前不要冷冻它们！它们在室温下稳定至少一年。
2.在安全柜中打开之前，短暂离心冻干引物Plasmo 1 和Plasmo 2（精确到 5 nmol/管）和探针MalFL和 MalLC640（精确到 1 nmol/管）。
3.在每管中加入 250 μL 的分子级水。
4.短暂涡旋，将管子在室温下放置在安全柜中 30 分钟。同时，轻轻混合试管数次，避免阳光直射。
5.短暂离心并制备等分试样，将它们储存在-20°C。
6.解冻一组等分试样后，轻轻混合四管，旋转，并使其远离过度光照。将解冻的引物和探针储存在 4°C，避免多次冻融循环。溶解的等分试样的保质期在 4°C 下至少为 3 个月，在 -20°C 下至少为 1 年。

安全
佩戴手套和护目镜，以尽量减少感染机会。

致谢

该协议源自我们之前的工作 (Schneider et al ., 2021)。这项工作得到了奥地利维也纳医科大学的支持。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

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2.Farcas , GA, Zhong, KJ, Mazzulli , T. 和 Kain, KC (2004)。评估用于疟疾诊断的 RealArt Malaria LC 实时 PCR 测定。临床微生物杂志 42（2）：636-638。
3.Haanshuus , CG, Morch , K., Blomberg, B., Strom, GEA, Langeland , N., Hanevik , K. 和Mohn , SC (2019)。评估疟疾实时 PCR 方法和应用，重点关注低水平寄生虫血症。公共科学图书馆一号14（7）：e0218982。
4.Kim, JY, Goo, YK, Ji, SY, Shin, HI, Han, ET, Hong, Y., Chung, DI, Cho, SH 和 Lee, WJ (2014)。在大韩民国使用现场样本诊断间日疟的实时 PCR 技术的发展和有效性。公共科学图书馆一号9(8)：e105871。
5.Perandin , F., Manca , N., Calderaro , A., Piccolo, G., Galati, L., Ricci, L., Medici, MC, Arcangeletti , MC, Snounou , G., Dettori , G. and Chezzi , C.（2004 年）。开发用于检测恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫的实时 PCR 检测方法，用于常规临床诊断。临床微生物杂志 42（3）：1214-1219。
6.Rougemont, M., Van Saanen, M., Sahli , R., Hinrikson , HP, Bille , J. 和Jaton , K. (2004)。通过基于 18S rRNA 基因亚基和物种特异性实时 PCR 测定法检测人类血液中的四种疟原虫。临床微生物杂志 42（12）：5636-5643。
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8.Schneider, R.、Lamien-Meda, A.、Auer, H.、Wiedermann-Schmidt, U.、Chiodini, PL 和 Walochnik, J. (2021)。验证一种用于同时定量检测和鉴别人类疟原虫寄生虫的新型 FRET 实时 PCR 测定。公共科学图书馆一号16(6)：e0252887。
9.Veron , V.、Simon, S. 和 Carme, B. (2009)。人类血液样本中恶性疟原虫、间日疟原虫和疟疾疟原虫的多重实时 PCR 检测。 Exp Parasitol 121（4）：346-351。
10.Yin, J.、Li, M.、Yan, H. 和 Zhou, S.（2018 年）。中国疟疾诊断参考实验室网络基于PCR的疟疾诊断方法思考[J]. Biosci趋势12（5）：510-514。