材料和试剂

醋酸，冰醋酸，ACS 级（Fisher Scientific，目录号：A38C-212）
琼脂糖粉（Research Products International，目录号：A20090-500.0）
抑肽酶（Fisher Scientific，目录号：BP250310）
BRD4 抗体（内部；描述于 Wu等人，2006 和 2016 年）
α -Cre抗体（Millipore，目录号：69050-3）
直接 PCR 裂解反应（尾）溶液（ Viagen ，目录号：102-T）
DNA Ladder，1 kb Plus（Thermo Scientific， GeneRuler ，目录号：SM1333）
干冰
耳标（National Band and Tag Company，目录号：1005-1P）
ECL 检测试剂：
West Femto化学发光底物（Thermo Scientific， SuperSignal TM ，目录号：PI34095）
ECL HRP 底物（ Advansta ， WesternBright ® ，目录号：K-12045）
印迹检测试剂（Millipore-Sigma，ECL TM ，目录号：GERPN2209）
溴化乙锭，分子生物学级（Sigma，目录号：E7637-5G）
乙醇，200 Proof（ Pharmco ，目录号：111000200）
乙二胺四乙酸钠盐（EDTA，Research Products International，目录号：E57020-500.0）
过滤纸：
纯纤维素色谱纸（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：05-714-4）
厚印迹滤纸，预切，7.5 × 10 cm（Bio-Rad，目录号：1703932）
凝胶上样染料，紫色，6 × （New England BioLabs Inc.，目录号：B7024S）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
异丙醇（2-丙醇，Fisher Scientific，目录号：A416-4）
标签胶带，自粘（Fisher Scientific，目录号：1590110R）
亮肽素（Fisher Scientific，目录号：50-114-6410）
液氮
甲醇（ Pharmco ，目录号：339000000）
小鼠（见表 1）

表 1. 本协议中使用的小鼠品系。

微量离心管，1.5 mL，高压灭菌（USA Scientific，目录号：1415-2500）
硝酸纤维素膜，支撑，0.2 mm（Fisher Scientific， Cytiva 阿默舍姆_ Protran TM ，目录号：45-004-017）
NP-40（Thomas Scientific，目录号：C953H73）
PCR 引物 (Sigma-Aldrich)

表 2. 用于鼠尾 PCR 反应的引物。
指出了数据库、核苷酸序列和预期的 PCR 大小。

PCR 管，圆顶带盖，0.2 mL，8 条（Phenix Research Products，目录号：MPX-445）
胃蛋白酶抑制剂A（Fisher Scientific，目录号：501146412）
苯甲基磺酰氟（PMSF， Sigma，目录号：P7626）
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma，目录号：P5726）
磷酸盐缓冲液 (PBS)， pH 7.4
塑料食品包装（Kirkland Signature，目录号：208721）
预染蛋白标准品：
双色标准（Bio-Rad，Precision Plus Protein TM ，目录号：1610374）
Duo Pre-Stained Protein Ladder（Li-Cor Biosciences Inc.，Chameleon ® ，目录号：92860000）
Multicolor Broad Range Protein Ladder（ ThermoFisher ， Spectra TM ，目录号：26634）
蛋白质测定染料浓缩物（Bio-Rad，目录号：500-0006）
蛋白质凝胶，4–20%，15 孔，15 µL（Bio-Rad，Mini-PROTEAN ® TGX Stain- Free TM ，目录号：4568096 ）
与辣根过氧化物酶 (HRP) 或荧光偶联的抗兔抗体：
山羊抗兔IgG二抗（Southern Biotechnology，目录号：OB4050-05）
抗兔IgG，800 4 × PEG缀合物（Cell Signaling Technology， DyLight TM ，目录号：5151）
Reactive Brown 10，实用级（Sigma-Aldrich，目录号：R0385-25G）
脱脂奶粉（雀巢公司、康乃馨® ）
氯化钠（NaCl，Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
脱氧胆酸钠（Fisher Scientific，目录号：BP349-100）
十二烷基硫酸钠（SDS，Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
氢氧化钠颗粒，ACS级（Fisher Scientific，目录号：S318-3）
锡箔（Reynolds Wrap，目录号：2866C）
组织均质管，2 mL（ Bertin Corp.， CKMix ，目录号：P000918LYSK0A.0）
Tris Base（Research Products International，目录号：T60040-5000.0）
α -β-微管蛋白（H-235）抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-9104）
Tween 20（Research Products International，目录号：P20370）
Universal SYBR® Green Supermix ，2 × （Bio-Rad， SsoAdvanced TM ，目录号：1725274 ）
水 (Milli-Q ® )
水，无核酸酶（ Ambion ，目录号：AM9937）
X 射线胶片（Fisher Scientific， Cytiva 阿默舍姆_ Hyperfilm TM ECL，目录号：45-001-508）
1 × SDS-PAGE 缓冲液（见配方）
1 ×湿转移缓冲液（见配方）
20 × TBS-T 缓冲液（见配方）
EDTA，0.5 M，pH 8.0（见配方）
乙醇，70%（见食谱）
溴化乙锭溶液，5 mg/mL（见配方）
mRIPA缓冲液，400 mM（见配方）
PCR 引物工作溶液，5 µM（参见配方）
蛋白酶 K 溶液，20 mg/mL（参见食谱）
Tris-Acetate-EDTA 缓冲液，1 × ，pH 8.3（TAE，参见配方）

设备

AC 成像系统 (Ultra-Violet Products Ltd., BioSpectrum TM )
分析天平（Mettler Toledo，目录号：PG5002-S）
离心机（Beckman Coulter， Allegra TM X-22R，目录号：392187）

离心机（Eppendorf，5424，目录号：EP-022620401）

耳标涂抹器，不锈钢（Braintree Scientific，目录号：EP1005S1）
电极电源线，黑色和红色（Bio-Rad，Sub- Cell TM GT）
冰柜，-20°C 和 -80°C
凝胶梳，15 孔，固定高度，0.75 厚度（Bio-Rad，Sub- Cell TM GT，目录号：1704445）
凝胶电泳槽（Bio-Rad，DNA Sub- Cell TM ）
荧光或化学发光凝胶成像系统：
Odyssey 红外成像系统 (Li-Cor Biosciences Inc., 9120)
桌面胶片处理器（柯尼卡美能达，型号：SRX-101A）
Gel Trey，UV-透明，15 × 25 cm（Bio-Rad，Sub- Cell TM GT，目录号：1704419）
均质器（ Bertin Corp.，PreCellys ® Evolution，目录号：P000062-PEVO0-A）
磁力搅拌棒，八角形（The Lab Depot，SpinBar ® ，目录号：58948-171-EA）
带热板的磁力搅拌器（Fisher Scientific， IsoTemp TM ，目录号：11-100-49SH）
微波（肯莫尔）
鼠标解剖工具
pH 计（Fisher Scientific， Fisherbrand TM Accumet Basic 和BioBasic TM ，目录号：13-636-AB15）
电源（Bio-Rad、 PowerPac 200）
冰箱，4°C
滚筒（Bio-Rad，目录号：1651279）
Sonic Dismembrator （Fisher Scientific， FisherBrand TM ，目录号：FB120）
用于迷你预制凝胶的 Tetra 垂直电泳槽（Bio-Rad，Mini-PROTEAN ® ，目录号：1658005）
热循环仪（Bio-Rad，T100 TM热循环仪）
镊子（Fisher Scientific， Fisherbrand TM ，目录号：12-000-123）
Vortexer（Scientific Industries Inc.，Vortex-Genie 2 – 6560，目录号：SI-0236）
水浴（Fisher Scientific， IsoTemp 220 TM ，目录号：15-462-20）
湿蛋白转移仪（Bio-Rad，Mini Trans-Blot Module，目录号：1703935）

软件

Adobe Photoshop 2020（版本 21.2.4）
ImageJ（1.53 版）

Li-Cor 图像工作室（5.2 版）
Microsoft Office 专业增强版 (Excel)
Microsoft Office 专业增强版 (PowerPoint)
UVP VisionWorksLS图像采集和分析软件（7.0.1 版）

程序

第一部分：基因分型程序

小鼠尾组织采集 - 第 0 天

具备基本水平的鼠标操作和饲养能力（例如，擦伤、处理和约束、性别鉴定、鼠标耳标等）。
根据您所在机构伦理委员会关于动物实验的规定，在出生后 2-3 周左右开始对小鼠进行基因分型。

图 4。由于物理连接的 K14-Agouti盒， MMTV-Cre 小鼠具有浅黄色毛皮颜色，该盒编码 131-aa 蛋白调节褐黑素（黄色色素）产生（Hustad，1995）。

决定对哪些小鼠进行基因分型。注意：在此过程中提到的所有基因都观察到典型的孟德尔遗传。因此，如果父母的基因型已知，则使用Punnett 方格来预测每个育种对的任何潜在后代的基因型。不是来自基因纯合的父母的小鼠通常需要进行基因分型，除了MMTV-Cre后代，由于K14-Agouti ，当与 B6-WT 背景中的小鼠杂交时表现出“黄色”皮毛与MMTV-Cre基因共同遗传的转基因 (Yuan et al. , 2011)。因此，这些小鼠可以仅根据其皮毛的颜色进行视觉选择（图 4）。

图 5. Mo使用尾部组织采集。
(A)微型剪刀、镊子和耳标涂抹器。 (B)止血粉。 (C)标记的 PCR 管。 (D)带有耳标的约束和磨损鼠标。 (E)典型鼠标尾巴的长度。 (F)老鼠尾巴剪断。 (G) 2 毫米小鼠尾巴组织样本的长度。 (H)用止血粉覆盖的老鼠尾巴。 (I)收获的小鼠尾尖样本。

标记小鼠，如果尚未标记（图 5A 和 5D）。
用每个相应鼠标的标签号标记一组 PCR 管（图 5C）。
约束和磨损鼠标（图 5D）。
使用锋利的手术剪刀，剪断大约 2 毫米的尾巴（图 5A、5E-5G）。

在小鼠尾巴的末端涂抹止血粉以减少出血（图 5B 和 5H）。
将鼠标放回笼子。
使用镊子将剪尾直接放入相应的 PCR 管中（图 5I）。
用异丙醇对手术剪刀进行消毒。
对所有需要进行基因分型的小鼠重复上述步骤。
如果不立即裂解，请将小鼠尾巴样本置于 4°C；如果超过一天，请将它们在 -20°C 下储存长达六个月（避免多次冻融循环）。

准备 Lys是反应工作溶液 - 第 1 天

每个 0.2 mL PCR 管需要70 µL含有 0.4 mg/mL 蛋白酶 K（见配方）的 Direct PCR Lysis Reaction (Tail) 溶液（见下面的步骤 C1）。
所有尾样本所需的直接 PCR 裂解反应溶液 (Lysis Rxn Sol.)的总量。
例如，70 µL × 8个样品 = 560 µL 直接 PCR 裂解反应溶液

每 1 mL Direct PCR Lysis Reaction 溶液，需要 20 µL 蛋白酶 K 溶液。根据直接 PCR 裂解反应溶液的总量计算所需的蛋白酶 K 溶液的总量。

例如., (560 µL Lysis Rxn Sol.)((1 mL Lysis Rxn Sol.)/(1000 µL Lysis Rxn Sol.))((20 µL Proteinase K Sol.)/(1 mL Lysis Rxn Sol.))=11.2 µL of Proteinase K Sol.
将上述计算的蛋白酶 K 溶液总量添加到 Direct PCR Lysis Reaction 溶液的总量中，以制备 Lysis Reaction Working solution 。
例如，560 µL Lysis Reaction Sol。 + 11.2 µL 蛋白酶 K Sol。 = 571.2 µL 裂解反应工作溶液。

裂解尾尖组织——第 1 天

将大约 70 μL 的裂解反应工作溶液添加到每个剪断的小鼠尾巴中。
将热循环仪中的每个样品在 55°C 下孵育 12 小时（步骤 1），然后在 85°C 下孵育 45 分钟（步骤 2），然后保持在 4°C 或 12°C（取决于特定的 PCR 机器，步骤 3)。

处理粗组织裂解物——第 2 天

将样品从热循环仪中取出，并通过以 123 × g离心1 分钟来沉淀任何剩余的碎片。
用每只鼠标的标签号标记一组新的 1.5 mL 微量离心管。
将粗裂解物转移到标记的微量离心管中。

如果不立即使用，将裂解物在 4°C 下最多保存一周，或在 -20°C 下最多保存六个月。

引物选择——第 2 天

确定对每只小鼠进行基因分型所需的 PCR 样本总数。
需要对哪些小鼠进行基因分型，请参阅A2 节。这些标准还将规定哪些基因需要通过 PCR 确认。
一般来说，不是来自纯合基因的父母的小鼠需要进行基因分型以确定该基因的存在；有“黄色”皮毛的老鼠例外，表明存在MMTV-Cre 基因（见图 4 ；Yuan等人，2011）。
为了正确确定BRD4-L和BRD4-S转基因的接合性（如果父母双方都不是hBRD4同种型的纯合子，并且后代可能是BRD4转基因等位基因的杂合子），使用BRD4-L或-S引物对用于确认敲入，然后使用Rosa26引物对通过另一次 PCR 进一步验证。 Rosa26 PCR结果解读如下：
对于具有纯合hBRD4-L/L 的小鼠， hBRD4-S/S，或杂合hBRD4-L/S ，当使用Rosa26引物对时，琼脂糖凝胶中不会出现Rosa26 DNA 条带（图 3B， Rosa26凝胶）。
对于没有BRD4- KI 的小鼠或具有一个BRD4转基因副本的杂合Rosa26小鼠，当使用Rosa26引物对时， Rosa26 PCR 带将出现在琼脂糖凝胶中（图 3B， Rosa26凝胶）。
可选的BRD4-Pan引物对可用于确认/排除任一 BRD4转基因的存在，以及Rosa26引物对（图 3B， hBRD4 - Pan凝胶）。
使用MMTV- PyMT引物对（参考文献 18）的PCR始终包括在内，以确认MMTV- PyMT基因的存在，因为我们所有的PyMT育种者都只携带一份MMTV- PyMT 基因（图 3B， MMTV - PyMT凝胶）。
每个 PCR 引物对都需要包含具有已知基因型的阳性和阴性对照样品。

主混合溶液制备 - 第 2 天

所有引物的 Master Mix 溶液是 7.5 µL 2 × SYBR ® Green mix、1.5 µL 各自 PCR 引物工作溶液（浓度为 5 µM；参见配方）和 5 µL 无核酸酶水的混合物，用于每个 PCR管中总体积为 14 μL 的 Master Mix 溶液（表 3）。

表 3. 样本小鼠基因分型矩阵说明了一种组织对几种不同类型的转基因小鼠进行基因分型所需的 PCR 管总数的方法。

在本例中，对 8 只转基因小鼠进行基因分型。绿色字体表示 PCR 管是可选的。

计算制备每种主混合液所需的每种试剂的量，如表 3所示。请记住要考虑增加大约10-30%的溶液体积以获得误差范围。
为了帮助组织和样本计算，在 Microsoft Excel 中设置了一个鼠标基因分型 Excel 电子表格，如表 4 所示， PCR Master Mix 计算如表 5 所示。

表 4.小鼠基因分型矩阵电子表格。

表 5.用于样本计算的 PCR Master Mix 电子表格。

试剂所需的量，并在推进前验证所有试剂的数量是否充足。
准备每个 Master Mix 解决方案。
矩阵中的相应管号标记一组新的 PCR 管（表 3）。
对于每个底漆组，在每个 PCR 管底部添加 1 μL 的粗裂解液，然后添加 14 μL 的 Master Mix 溶液。这种添加顺序有助于区分添加的样本和未添加的样本。
对所有其他引物组重复相同的步骤。
将任何剩余的粗裂解物在 -20°C 下储存长达六个月。

在室温 (RT) 下，在 Allegra X-22R 离心机中以 123 × g离心样品 1 分钟。

聚合酶链式反应 (PCR) – 第 2 天

对于BRD4转基因检测，将 PCR 协议设置为 94°C 3 分钟（步骤 1）、94°C 10 秒（步骤 2）、60°C 30 秒（步骤 3）和 72°C 30 秒（第四步）。重复步骤 2-4 35 个循环。在 72°C 下完成方案序列 3 分钟，然后在 4–12°C 下保持。

BRD4转基因扩增的PCR 管加载到热循环仪中。
按 Run，当仪器提示时将 PCR 体积设置为 15 µL，然后按 OK。
步骤G1中所述设置的另一个热循环仪对其他样品执行 PCR ，但重复步骤 2-4 40个循环。
此 PCR 过程大约需要 1.5 小时才能完成。
如果不立即使用，请将完成的 PCR 样品在 4°C 下放置长达一周，或在 -20°C 下放置长达六个月。

准备琼脂糖凝胶溶液 - 第 3 天

称取约 3.0 g 琼脂糖，将其添加到 200 mL 的 1 × TAE 缓冲液（pH 8.3，参见配方）中，搅拌制成 1.5% 的琼脂糖溶液。

在微波炉中加热溶液约 3 分钟，或直到琼脂糖完全溶解。
在琼脂糖溶液中加入 15 – 20 µL 的 5 mg/mL溴化乙锭溶液（参见配方）。
让溶液在室温下搅拌至微温。

凝胶铸造 - 第 3 天

使用胶带覆盖凝胶浇铸托盘的末端，确保密封外边缘。
将四个 15 孔梳子（总共 60 个孔）均匀地放入凝胶浇注托盘中。
将所有 1.5% 的凝胶溶液倒入凝胶浇注托盘中 - 足以使溶液达到距底部0.6 – 0.8 厘米的高度。
去除任何气泡并均匀分布液体。
凝胶大约需要 20-25 分钟才能凝固。

凝胶加载 - 第 3 天

从凝胶浇铸托盘的每一侧取下胶带，并将托盘放入电泳槽中。
取下凝胶浇铸梳并将凝胶浸入 1 × TAE 缓冲液 (pH 8.3) 中。如果不立即使用，请将凝胶板放入 1 × TAE 缓冲液中（参见配方），并在 4°C 下储存。
冰箱中取出 PCR 样品，在每个样品中加入 3 μL 的 6 ×凝胶上样染料。
分组加载样本，每个样本在开始泳道中使用 1 kb Plus DNA 梯，在每个 PCR 引物组的最后两个泳道中使用阳性和阴性对照。在每个引物组后跳过一口井并开始加载以下一组样品。通常， 8 µL DNA ladder 和10 µL每个 PCR 样品足以在凝胶中产生显着条带；然而，这个数量可能会因产生的 PCR 产物的数量而异。
加载样品后，将黑色/阴极 (-) 和红色/阳极 (+) 电缆连接到电泳槽，并打开电源。凝胶中的电流从阴极流向阳极（黑红色）——与 DNA 样品通过凝胶迁移的方向相同。注意不要切换电极电源线。
将电压 (V) 设置为150 伏- 安培数 (A) 将变为2.00 A - 让凝胶运行 30-45 分钟，或直到上样缓冲液中的两种染料完全分离。

凝胶成像——第 3 天

将凝胶从凝胶浇注托盘中取出并将其浸入蒸馏水中。
打开BioSpectrum AC 图像系统（如果尚未打开）。
打开装置并用 70% 乙醇清洁玻璃（参见食谱）。
将凝胶放在凝胶扫描仪的表面并关上门。
启动VisionWorks程序并登录。
在“照明”选项卡下，将透照装置转到紫外光上。
按采集和预览。
在 Lighting 选项卡下，调整 Zoom 和 Focus 以锐化图像。
在相机选项卡下，调整曝光时间（分钟和秒）以更改图像的强度。
按捕获以获取图像。
在编辑选项卡下，旋转图像。
按对齐进一步调整角度，然后裁剪图像。
单击文件并另存为。
使用以下格式保存图像：DD MM YY, Initials, Mouse Genotyping Gel #。

凝胶处理——第 3 天

由于溴化乙锭的毒性，任何含有这种化学物质的凝胶都应丢弃在经过批准的废物容器中。

凝胶处理——第 3 天

使用 Adobe Photoshop

在 Adobe Photoshop 中打开扫描的图像。在图像面板下，单击图像旋转以正确定位图像。对于 180 度，单击 180°。对于特定角度，单击任意。
正确定位后，单击图像选项卡，然后单击模式；并单击灰度。
将出现一个带有忽略更改的弹出框，因此单击放弃。
在右侧窗格中，单击调整并选择反转。
通过单击亮度/对比度在调整面板下切换图像的对比度和亮度。
将图像另存为JPEG 或 TIFF 文件。
微软PowerPoint
将 Adobe Photoshop 中的黑白凝胶图像放入 PowerPoint 中，并用鼠标基因分型矩阵中的正确 PCR 管编号标记凝胶通道（表 3）。
它们对应的分子量标记 (M) 。

凝胶解读——第 4 天

请参阅图 3B作为正确波段识别的指南。
矩阵（表 3）中列出的每个 PCR 管的结果。
记录每只老鼠的基因型。

用于蛋白质印迹的肿瘤解剖和组织处理
肿瘤解剖

安乐死荷瘤小鼠（图 6A 和 6B）。收集额外的尾部组织用于备份基因分型，并储存在 -20°C。
在小鼠腹部顶部做一个 5 毫米的水平切口，使用微型剪刀刺穿小鼠的皮肤（图 6C）。
将切口下方的皮肤拉到尾部以暴露腹盆腔（图 6D）。
肿瘤将位于腹膜周围的脂肪垫组织中（图 6E）。
从乳腺脂肪垫 #4 和 #5 中取出肿瘤，注意不要带走任何周围组织（图 6F）。

现在将剩余的皮肤拉到颅骨主切口上方，直到露出整个胸腔（图 6G）。
肿瘤将位于附着在皮瓣后侧的脂肪垫组织中（图 6H、I 和 J）。
分别从乳腺脂肪垫 #3、#2 和 #1 中取出肿瘤，注意不要带走任何周围组织（图 6K）。

使用分析天平记录所有乳腺脂肪垫肿瘤的单个肿瘤重量和总肿瘤重量（参见图 6K）。
将每个肿瘤放入标记的微量离心管中（带有鼠标标签号、乳腺脂肪垫位置、日期和样本类型）。如果肿瘤太大而无法放入微量离心管中，请将其切成碎片并放入管中。
将样品微量离心管浸入液氮中以快速冷冻样品，并将其储存在-80°C。

图 6.小鼠乳腺PyMT肿瘤采集。
(A) CO 2安乐死系统。 (B)带有乳腺脂肪垫 #1–5 标记的安乐死小鼠。 (C)切口位于中线的鼠标。 (D)中线切口下方有皮瓣的小鼠从尾部拉出以露出腹膜。 (E)腹盆腔肿瘤。 (F)从乳腺脂肪垫 #4 和 #5收获PyMT肿瘤。 (G)中线切口上方有皮瓣的小鼠在颅骨上拉动以露出胸腔。 (H)鼠标上部解剖右侧暴露以显示乳腺脂肪垫肿瘤#1-3。（一）鼠标上部解剖左侧暴露以显示乳腺脂肪垫肿瘤#1 和#2。 (J)鼠标上部解剖最左侧暴露以显示乳腺脂肪垫肿瘤#2 和#3。 (K)收获的总乳腺脂肪垫肿瘤。缩写：MFP，乳腺脂肪垫； L, 左; R，对。

肿瘤处理

将冷冻样品从 -80°C 中取出，放入干冰中。
将冷冻组织转移到CKMix组织匀浆管 (2 mL ) 中，并添加mRIPA (400 mM) 缓冲液（参见配方-对正确分离 BRD4 与染色质很重要）。

均质化肿瘤组织 PreCellys Evolution 组织均质器。
打开PreCellys Evolution 组织均质器。
在机器顶部装满干冰并盖上盖子。
转到主屏幕并选择软协议（具有以下规格：管体积 – 2 mL；旋转速度 – 5,800 rpm；循环 – 2 × 15 s；暂停 – 30 s；冷冻– 开启；温度 – 4°C；和模式 – 自动）、开始，然后按 OK。

确保样品完全均质化（即，液体中没有可见的大肿瘤块）。如果没有，请再次运行软协议。
完成后，将盖子打开一半，让干冰在冷却室中蒸发，然后关闭机器。
将样品放在冰上。
将样品转移到一组带标签的 1.5 mL 微量离心管中。从每个均质样品中取出尽可能多的液体。

在 20,000 × g和 4°C 下将样品离心 30 分钟。
离心后，将至少 50 μL 的上清液转移到第二组标记的管中。根据需要制作额外的 50 – 100 µL 等分试样。
为每个肿瘤样本保留一份样本以确定蛋白质浓度，将剩余的样本等分试样快速冷冻在液氮中，并将它们储存在 -80°C。
执行 Bradford 测定以测量每个样品等分试样的近似蛋白质浓度。为此，根据制造商的说明，从 Bio-Rad 蛋白质检测染料浓缩试剂 (5 × ) 中制备 1 ×溶液。

对于 Bradford 测定校准曲线，使用 1 × Bradford 染料制备 BSA 蛋白标准品。

蛋白质印迹程序
制备 25 – 50 µg蛋白质样品，来自任一细胞系（参见前面步骤 B9中的肿瘤处理部分注释）或已使用mRIPA (400 mM) 缓冲液均质化的PyMT肿瘤。对于正常组织，内源性 BRD4-S 检测需要约50 µg 蛋白质样品。
浇注 8% SDS-PAGE凝胶，或使用 4–20% 预制梯度凝胶。
加载 5–10 µL 的 5 mg/mL 蛋白质样品和预染色标准（通常为 5 µL，取决于公司来源）。
进行凝胶电泳。使用内部 8% 凝胶时，从 100V 开始，然后在预染色标准液进入分离凝胶后增加到200V 。按照制造商的说明运行预制凝胶。
×湿转移缓冲液（参见配方）冷却至 4°C（重要）。
使用 Bio-Rad Mini Trans-Blot Module进行湿转印：
组装蛋白质转移装置时，注意不要在 1 × Wet Transfer 缓冲液中产生气泡，因为这些气泡会干扰蛋白质转移并可能阻止蛋白质完全转移。
将传送带盒放在其透明的一侧。
一块薄湿海绵浸入冷的 1 × Wet Transfer 缓冲液中，然后将其放在卡带中间。
接下来，将一张厚滤纸浸入冷的 1 × Wet Transfer 缓冲液中，并将其放在海绵顶部，确保它们尽可能居中。根据需要切割。
使用滚筒去除滤纸上的任何气泡。
将一张浸入冷 1 × Wet Transfer 缓冲液中的硝酸纤维素膜放在滤纸上并去除任何气泡。
将 SDS-PAGE 凝胶放在硝酸纤维素膜的顶部并去除任何气泡。

再铺一层厚滤纸，浸入冷的 1 × Wet Transfer 缓冲液中，去除任何气泡。
最后，将一块浸入冷 1 × Wet Transfer 缓冲液中的薄海绵放在滤纸上，然后合上盒式夹层。
将盒式磁带放入设备中，使盒式磁带的黑色面朝向蛋白质转移装置的黑色面。
对任何后续凝胶重复上述步骤，然后将冰袋放在蛋白质转移装置的黑色一侧。
用任何剩余的冷 1 × Wet Transfer 缓冲液加满蛋白质转移装置，并将装置置于 4°C。
将盖子放在传输装置的顶部并将其连接到电源。
打开电源并将电压设置为 50 V，持续 720 分钟（重要）。
按下运行按钮开始湿蛋白转移。

完成后设备会自动关闭。
从 4°C 中取出转移装置，将每个膜置于用 1x TBS-T 缓冲液（见配方）在室温下稀释的 5% 脱脂牛奶溶液中 10 分钟。

计算每种抗体的量和稀释所需的稀释剂。一抗 BRD4 抗体：抗 BRD4-N（用于检测 BRD4-L 和 BRD4-S）和抗 BRD4-L 抗体的比例为 1:2,000，抗 BRD4-S 抗体的比例为 1:1,000（例如，将 3 μL 的抗 BRD4-N 抗体添加到 6 mL 的 5% 脱脂牛奶中）。
在 4°C 下轻轻摇动将膜在 BRD4 一抗中孵育过夜（或在室温下孵育 2 小时以检测更丰富的 BRD4-L 蛋白）。
过夜孵育后，将印迹从 4°C 中取出，倒出 5% 脱脂牛奶溶液，并用四次去离子水冲洗轻轻去除任何残留的牛奶溶液。
印迹中倒出水，并用 8-16 mL 1 × TBS-T 缓冲液替换（参见配方；确切体积取决于所用腔室/托盘的大小），使膜在液体中自由漂浮.
让印迹在 RT 处晃动 5 分钟。
× TBS-T缓冲液清洗所有印迹，共清洗 3 次。
将印迹放回1 × TBS-T 溶液中的 5%脱脂牛奶中，并以 1:10,000–4,000 稀释度添加二抗（例如，在 6 mL 5% 脱脂牛奶中，添加 0.6 µL 二抗1:10,000 稀释，1.5 µL 二抗用于 1:4,000 稀释）。
在 RT 的轨道摇床上轻轻旋转孵育二级抗体 1 小时。
倒出牛奶，用去离子水清洗四次，然后用四次 1 × TBS-T 冲洗，中间孵育 5 分钟，如步骤 10-13 所述。
在最后一次 TBS-T 洗涤后，用 1 × PBS（pH 7.4 ）替换溶液，因为该溶液与荧光信号更兼容（例如，Li-Cor Odyssey 成像系统）。或者，如果使用由柯尼卡桌面胶片处理器显影的 X 射线胶片进行化学发光检测，则添加 ECL 检测试剂。

BRD4 蛋白异构体检测的代表性图像见图 7。

图 7.Western 印迹显示在来自三个代表性 Cre 表达小鼠的三个 PyMT 肿瘤中条件诱导的人 BRD4-S 过表达。
来自三只没有 Cre 表达的小鼠的 PyMT 肿瘤被包括在内作为对照。蛋白质大小标记（以 kDa 为单位）显示在每个凝胶图像的左侧。

食谱

5 µM PCR 引物工作解决方案
要为每个 Master Mix 溶液制备 PCR 引物工作溶液，如表 3所示，在 180 µL 核酸酶中加入 10 µL 正向 PCR 引物 ( 100 µM)到 10 µL 反向 PCR 引物 ( 100 µM) - 无水，用于每个基因特异性引物对。

0.5 M EDTA (pH 8.0)
对于 1 L 溶液，将 186.1 g EDTA 添加到 800 mL Milli-Q 水中。在磁力搅拌器上剧烈搅拌，并用 NaOH 颗粒将 pH 值调节至 8.0。用 Milli-Q 水将所得溶液调至 1 L。

1 × Tris-Acetate-EDTA (TA E, pH 8.3)缓冲液
对于 20 L 溶液，将 96.8 g Tris 碱、22.84 mL 冰醋酸和 40 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) 加入足量的去离子水中，使最终体积达到 20 L。
对于 1 L 溶液，将 4.84 g Tris 碱、1.14 mL 冰醋酸和 2.0 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) 添加到足够的去离子水中，最终体积为1 L。

5 mg/mL 溴化乙锭
在 200 mL 的高压灭菌/去离子水中加入 1 g 溴化乙锭。将溶液放入锡箔包裹的玻璃容器中以避免光降解，并在 4°C 下储存。

70% 乙醇
对于 1-L 溶液，将 700 mL 乙醇添加到 300 mL Milli-Q 水中。

蛋白酶 K 溶液 (20 mg/mL)
要制备 50 mL 的蛋白酶 K 缓冲液，请将 20 mL 的甘油、0.5 mL 的 1 M Tris（pH 7.5）和 50 μL 的 1 M 氯化钙添加到足够的去离子水中，最终体积为 50 mL。将100 mg蛋白酶 K 粉末（Fisher Scientific，目录号：BP1700-100）溶解在 5 mL 蛋白酶 K 缓冲液中，并将所得溶液以1-mL 等分试样储存在 - 20°C 。

mRIPA (400 mM) 缓冲液
对于 50 mL 的mRIPA （400 mM）溶液，将 2.5 mL 的 1 M Tris-HCl（pH 7.5，最终 50 mM）、4 mL 的 5 M NaCl（最终 0.4 M）、5 mL 的 10% NP 混合在一起-40（最终 1%）、1.25 mL 10% 脱氧胆酸钠（最终 0.25%）、0.1 mL 0.5 M EDTA（最终 1 mM）和蛋白酶抑制剂（由 0.5 µM PMSF、50 µg/mL 亮肽素组成、50 µg/mL Aprotinin、1 µg/mL Pepstatin A 和 500倍稀释的 Sigma 磷酸酶抑制剂混合物 2)。

1 × SDS-PAGE 缓冲液
对于 20 L 溶液，将 60 g Tris 碱、288 g 甘氨酸和 20 g 十二烷基硫酸钠 (SDS) 添加到足够的去离子水中，使最终体积达到 20 L。
对于 1 升溶液，将 3 克 Tris 碱、14.4 克甘氨酸和 1 克 SDS 加入足量的去离子水中，使最终体积达到 1 升。

1 ×湿转印缓冲液
对于 1 L 溶液，将 25 mL 的 1M Tris-HCl (pH 8.0)、14.41 g 甘氨酸、1 g SDS 和 200 mL 甲醇加入足够的去离子水中，最终体积为 1 L。

20 × TBS-T 缓冲液
对于 1 L 溶液，将 200 mL 的 1 M Tris-HCl (pH 8.0)、175.32 g 的 NaCl 和 10 mL 的 100% Tween 20 添加到足够的去离子水中，使最终体积达到 1 L。

致谢

我们感谢Chien -Fei Lee博士在协议开发过程中提供的技术帮助和指导，感谢Claire Chiang 和 William Chiang 对手稿的评论。此处详述的协议主要从Wu等人描述的程序扩展而来。（2020 年）。这项工作得到了 NIH 赠款1RO1CA251698-01和 CPRIT 赠款RP190077的部分支持。

利益争夺

作者没有经济利益冲突。
伦理

随意获取食物和水。所有实验均按照 UTSW 机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的协议 #2017-102140 进行。

参考

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