材料和试剂
1.移液器，0.5 – 10 μL ，10–100 μL和 100–1,000 μL （Eppendorf，目录号：13-684-251）
2.移液器吸头，0.1–10 μL 、1–300 μL和 200–1,000 μL （Fisher Scientific， SureOne TM 微点移液器吸头，目录号：02-707-441、02-707-410、02-707-407 ）
3.Eppendorf Safe-Lock Tubes，1.5 mL（Eppendorf，目录号：022363204）
4.Falcom 15 mL 和 50 mL 锥形离心管（Fisher Scientific，目录号：05-527-90、14-959-49A ）
5.KimTech Science KimWipes （Kimberly-Clark，目录号：06-666）
6.真空过滤器（Millipore，目录号：SCGVU01RE）
7.云母片（Electron Microscopy Sciences，目录号：71856-01-10）
8.Malvern zeta 电位 c毛细管细胞和塑料盖（Malvern，目录号：DTS 1070）
9.Falcon 8孔细胞培养载玻片（Corning，目录号：354108、354118 ）
10.VWR 微型盖玻片（VWR，目录号：48382-138）
11.指甲油（电子显微镜科学，目录号：72180）
12.MEDI-FIRST 镜片清洁毛巾（ Safetec of America，目录号：81586 ）
13.Countess 细胞计数室载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10283）
14.聚乙烯醇（PVA，87-90% 水解；Sigma-Aldrich，目录号：P8136-250G）
15.丙交酯：乙交酯（75:25）（PLGA），分子量（MW）66000-107000（Sigma-Aldrich，目录号：P1941-5g）
16.PLA-PEG（PEG MW 5000 和 PLA MW 10000）（NSP-功能聚合物和共聚物，目录号：DL-5k-10k）
17.PLA-PEG-FA（PEG MW 5000 和 PLA MW 10000）（NSP-功能聚合物和共聚物，目录号：11440-10k-5000）
18.磷酸盐缓冲盐水（PBS，Corning，目录号：21-040-CV）
19.1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate（ Dil ， Thermofisher ，目录号：D282）
20.甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：67-56-1）
21.丙酮（EMD，目录号：AX0115P-1）
22.二氯甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：32222-1L）
23.HEPES缓冲液pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：F7876）
24.分光光度计比色皿，聚苯乙烯（ Sigma-Aldrich，目录号：C5677-100EA）
25.RPMI 1640 细胞培养基（Corning，目录号：10-040-CV）
26.胎牛血清（Atlanta Biologics，目录号：S11150H）
27.StemPro Accutase Cell解离试剂（Life Technologies，目录号：A11105-01）
28.青霉素链霉素溶液（Life Technologies，目录号：15070-063）
29.台盼蓝染色剂0.4％（Life Technology，目录号：T10282）
30.鬼笔环肽、异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记 (Sigma-Aldrich, P5282-.1MG)
31.DAPI（ SouthernBiotech ，目录号：0100-20 ）
32.完全培养基（见食谱）
33.FITC染色溶液（见配方）

设备

1.Milli-Q净水系统（Millipore-Sigma，型号：优势A10）
2.电子天平（OHAUS，型号：explorer125）
3.Vortexer （科学工业，型号：200-SI0236）
4.Digital Probe Sonifier （必能信，型号：450 Digital Sonifier ）
5.基准加热板和磁力搅拌器（康宁，型号：PC-6200）
6.旋转蒸发仪（Buchi，型号：R-210）
7.真空泵（Buchi，型号：V-700）
8.离心机（Thermo Fisher Scientific，型号： Sorvalis ST16R）
9.超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K）
10.超声波清洗机（Branson，型号：3510R-MTH）
11.Zetasizer （马尔文，型号：Nano-ZS90）
12.原子力显微镜（ Nanosurf ，型号： CoreAFM ）
13.细胞培养箱（ Thermofisher Scientific，型号：II 系列水套）
14.细胞计数器（Life Technology，型号：Countess 3）
15.Olympus 荧光显微镜（Olympus，型号：BX63 带 DP-25 相机）
16.Keyence 显微镜（Keyence，型号：BZ-X700 系列）

程序

A.Dil标记的PLGA/PLA-PEG-FA纳米颗粒的制备
注意：此程序应避免强光。
1.制备 2.5%聚乙烯醇 ( PVA) 溶液。在室温（25 ° C ）下使用磁性搅拌棒搅拌溶液过夜，并通过 0.2 μm 真空过滤器过滤（图 1a）。
2.称重 75 mg PLGA，并将其添加到 10 mL 玻璃瓶中。
3.添加 5 mL 的二氯甲烷 (DCM) 以溶解 PLGA。
4.将 100 μL的Dil （丙酮中的 1 mg/mL）加入上述溶液并混合。用铝箔盖住瓶子以避免直接照明。
5.将 25 mL 的 2.5% w/v PVA 水溶液转移到 250 mL 烧瓶中。
6.将装有 PVA 水溶液的烧瓶置于冰浴中。
7.将超声探头（直径 4 mm）插入烧瓶中，直到它被 PVA 水溶液浸没（图 1b-1c）。
8.启动探头超声波发生器30 秒（三次），在冰浴上对 PVA 溶液进行超声处理。同时，使用玻璃吸管将 DCM 溶液（含有Dil和 PLGA）逐滴加入 PVA 溶液中，在超声处理过程中形成水包油乳液。
9.称量 15 mg PLA-PEG 和 10 mg PLA-PEG-FA，并将它们放入 10 mL 玻璃瓶中。
10.加入200 μL 的 DCM ，以溶解PLA-PEG/PLA-PEG-FA 混合物。
11.在磁力搅拌下，将 PLA-PEG/PLA-PEG-FA 溶液逐滴添加到乳液中（在步骤 8 中制备）。
12.将溶液转移到 100 mL 玻璃烧瓶中；添加一个干净的搅拌棒，将玻璃烧瓶放在搅拌板上，调整速度和温度（25 °C ），并搅拌（500 rpm）过夜以减少 DCM 溶剂（图 1d）。用铝箔盖住瓶子以避免直接照明，并在铝箔上使用针打孔让 DCM 蒸发。

图 1. Dil标记的 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒的制备。
a) 过滤 PVA 溶液； b)浸入声波探头； c) 调整探头位置； d) 搅拌乳化的纳米颗粒悬浮液。

13.将溶液转移到梨形玻璃瓶中，在 40°C 下用旋转蒸发器蒸发溶液 2 小时，以去除 DCM 溶剂残留物（图 2a）。
14.将所有混合物转移到离心管中（图 2b），并在2,795 × g和4°C 下离心15 分钟（图 2c）。丢弃托盘（去除微小颗粒）。
15.将上清液转移到 70 mL 超速离心管中，以25,155 × g和 4°C 离心上清液45 分钟（图 2d）。弃去上清液。
16.慢慢向管中加入去离子水，避免干扰颗粒，然后吸出水。重复此步骤 3 次，轻轻清洗沉淀。
17.添加去离子水并吸管悬浮液，以检索纳米粒子。
18.冻干悬浮液以获得干粉（~20 毫克）。

图 2. Dil标记的 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒的制备。
旋转蒸发去除 DCM ； b) 将悬浮液进行离心； c) 2,795 × g离心 15 分钟后样品的目测； d) 25,155 × g后样品的视觉效果超速离心 45 分钟。

B.Dil标记的 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒的表征
测量粒径和 zeta 电位
在室温下使用 Malvern Zetasizer Nano ZS90 Apparatus [Malvern Instruments, Malvern, UK]测定 NP 的粒径和 zeta 电位。
1.将 NP 悬浮在 PBS 溶液中（图 3a）； NPs 的近似浓度为 10–100 µg/ mL。
2.将 1.5 mL 的纳米颗粒悬浮液添加到比色皿中。
3.用塑料盖盖住比色杯。
4.将比色皿插入 Malvern Zetasizer中，并设置参数以测量尺寸。
5.小心地将 0.8 mL 的纳米颗粒悬浮液添加到毛细管细胞中（图 3b）。
6.用塑料盖盖住毛细管电池。
7.将电池插入 zeta 电位分析仪的腔室（图 3c）。
8.设置参数以测量表面 zeta 电位。
笔记：
a.使用室温 PBS 进行精确的尺寸测量。
b.尺寸测量后，可以使用相同的溶液测量 zeta 电位。

图 3. Dil标记的 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒的表征。
a) 通过向粉末中加入水来重构纳米颗粒； b) 将纳米颗粒悬浮液添加到比色皿中； c) 将比色皿插入zetasizer以测量尺寸和 zeta 电位； d) 在刚剥落的云母片中加入一滴纳米粒子悬浮液； e) 覆盖片材并使其在室温下干燥； f) 将板材放在 AFM 平台上。

获取原子力显微镜 (AFM) 图像
1.准备一张刚去皮的云母片。
2.~2.5 μL的 PLGA/PLA-PEG-FA NP（悬浮在水中）沉积到云母片上（图 3d）。
3.在室温下干燥样品 30 分钟（图 3e）。
4.μ L蒸馏水轻轻冲洗云母片。
5.再次在室温下干燥样品 30 分钟。
6.将云母片放在 AFM 舞台上（图 3f）。
7.× 5 μ m的面积和 2 – 50 nm 的高度扫描样品。
8.典型的 AFM 图片可以在图 5b 中找到。

C.CT-26 摄取 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米粒子
复活 CT-26 细胞
1.在水浴中将培养基加热至 37°C；将加热的培养基 (RPMI 1640, 15 mL) 转移到 75 cm 2细胞培养瓶中。
2.从液态 N 2罐中恢复 CT-26 细胞。解冻细胞并将细胞悬浮液加入培养瓶中。
3.2的湿润气氛中于 37°C 培养烧瓶。
4.24 小时后，更换培养基并等待结肠 26 细胞在 75 厘米2烧瓶中生长至 75% 汇合。
5.在 8 孔板中传代细胞。在每口井中加入 1 mL 的培养基（包含约 75,000 个细胞）。
6.继续培养细胞，直到它们达到 75% 融合（图 4b）。
7.在 PBS 悬浮液 (0.1 毫克/毫升) 中制备 NP。
8.在 8 孔板中加入 20 μL的 NP - PBS 悬浮液（图 4a）。
9.2小时后，吸出培养基，用 0.5 mL 的 PBS 清洗板，并用 0.25 mL 的冰冷甲醇固定细胞 15 分钟（在 4 °C 下）。
10.吸出甲醇并用冰冷的 PBS 洗涤 3 次（每次 0.25 mL）。加入 100 μL FITC溶液，室温孵育板 30 分钟。
11.吸出 FITC 并擦干盘子。
12.添加±0.3 mL 的 DAPI和指甲油以密封板（图 4c）。让盘子在黑暗和寒冷的地方干燥 2 小时。
13.将幻灯片放在小孢子阶段 (图 4d), 并使用荧光显微镜对样品进行成像。

图 4. Dil标记的PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒的 CT-26 摄取。
a) 将纳米颗粒 PBS 悬浮液添加到 8 孔细胞培养板中； b) 在反光显微镜下观察贴壁细胞的成像 (40 × )； c) 准备好的用于荧光显微镜分析的载玻片； d) 将载玻片放置在显微镜载物台上。

数据分析

1.动态光散射分析表明，水合纳米颗粒的直径约为 170.5 ± 52.87 nm，多分散指数 (PDI) 为 0.096 （图 5a）。
2.纳米粒子的 Zeta 电位从-18.1 到 -18.6 mV不等（图 5c）。
3.AFM 图像显示Dil标记的 PLGA/PLA-PEG-FA 纳米颗粒是具有球形形状的纳米尺寸颗粒（图 5b）。

图 5. 纳米粒子的尺寸、zeta 电位和形态分析。
a) 纳米粒子的尺寸分布； b) 纳米粒子的 AFM 照片 c) 纳米粒子的 zeta 电位。不同颜色的线代表相同制剂的 3 个读数。

4.荧光显微镜照片表明，结肠上皮细胞在孵育 2 小时后吸收 NP（图 6）。

图 6. Dil标记的纳米颗粒的细胞摄取的荧光显微镜分析。
a)具有代表性的荧光显微镜照片。 b -d）放大的照片代表在细胞质中内化的纳米颗粒。

笔记

1.使用超声探头时，请使用大烧瓶并将其放在冰浴上，以防止局部过热。
2.避免用超声探头接触瓶底，以免造成瓶子磨损和可能破裂。

食谱

1.完全培养基
Colon-26 的完整培养基是RPMI 1640，辅以青霉素 (100 U/mL)、链霉素 (100 µg/mL) 和热灭活胎牛血清 (10%)。
2.FITC染色液
溶解 0.1 mg鬼笔环肽、异硫氰酸荧光素。

致谢

这项工作得到了退伍军人事务部的支持，赠款编号BX002526以及国家糖尿病、消化和肾脏健康研究所（RO1-DK-071594 至 DM）。 D. Merlin 是退伍军人事务部高级研究职业科学家奖 ( BX004476) 的获得者。这项工作是从张等人改编和修改的。（2018 年）。克罗恩病和结肠炎杂志，2017，217-229。

利益争夺

作者声明工作中没有利益冲突。

参考

1.Sindeeva，OA，Prikhozhdenko，ES，Schurov，I.，Sedykh，N.，Goriainov，S.，Karamyan，A.，Mordovina，EA，Inozemtseva，OA，Kudryavtseva，V.，Shchesnyak，LE ，等。（2021 年）。基于 PLA、PLGA 和 PCL 的气管支架图案化药物洗脱涂层用于减少肉芽形成：体内研究。药剂学13（9）。
2.Tripathi, K. 和 Feuerstein, JD (2019)。溃疡性结肠炎的新发展：管理、治疗和维持的最新证据。毒品背景8：212572。
3.Yang, C.、Zhang, M.、Lama, S.、Wang, L. 和 Merlin, D. (2020)。将 6-姜烯酚及其代谢物 M2 和 M13 输送到结肠以治疗溃疡性结肠炎的基于天然脂质纳米颗粒的治疗方法。 J 控制版本323：293-310。
4.Zhang, M.、Xu, C.、Liu, D.、Han, MK、Wang, L. 和 Merlin, D. (2018)。在溃疡性结肠炎的小鼠模型中，口服载有生姜活性化合物 6-姜烯酚的纳米颗粒可减轻溃疡性结肠炎并促进伤口愈合。 J Crohns结肠炎12（2）：217-229。
5.Zhao, H.、Wu, F.、Cai, Y.、Chen, Y.、Wei, L.、Liu, Z. 和 Yuan, W.（2013 年）。载有rlL-2的缓释葡聚糖/PLGA-PLA核/壳微球瘤内递送的局部抗肿瘤作用。国际医药杂志 450（1-2）：235-240。