材料和试剂
1.1.5 毫升管
2.大口径过滤的 1,000 µL 移液器吸头（ Thermo Fisher Scientific，目录号：2079G ）
3.35 mm组织培养处理的培养皿（SPL Life Sciences，目录号：20060）
4.无菌细胞过滤器，40 µm 尼龙网（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363547）
5.磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010023）
6.细胞解离酶， TrypLE Express（ Thermo Fisher Scientific，目录号：12605028）
7.台盼蓝溶液，0.4%（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
8.高级 DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号： 12491015 )
9.Ham's F-12 Nutrient Mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：11765054）
10.青霉素-链霉素，100 × （Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
11.胎牛血清（FBS）-美国来源，热灭活（ Denville Scientific，目录号：FB5001-H）
12.纤连蛋白，人蛋白质，血浆（Thermo Fisher Scientific，目录号：33016015）
13.Bouin固定剂（ Polysciences ，目录号：16045）
14.氢氧化铵溶液，28 - 30%（Sigma-Aldrich，目录号：221228）
15.新蓝，8GX（Sigma-Aldrich，目录号：A3157）
16.冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092-2.5L）
17.盐酸胍（Sigma-Aldrich，目录号： G3272）
18.纤连蛋白原液（1 mg/mL）（见配方）
19.10% FBS/Advanced DMEM 中的 100 µg/mL 纤连蛋白（参见配方）
20.10% FBS/Advanced DMEM 中的 10 µg/mL 纤连蛋白（参见食谱）
21.Advanced DMEM/Ham's F-12 中的 4% FBS（见食谱）
22.阿新蓝染色的溶液 A （参见配方）
23.阿新蓝染色的溶液 B （参见配方）
24.1 mg/mL阿新蓝溶液（见配方）
25.6M盐酸胍（见配方）

设备

1.Dumont #5 镊子，尖端尺寸 0.10 × 0.06 mm（ Roboz ，目录号：RS-5045），高压灭菌
2.Dumont #7 镊子，尖端尺寸 0.17 × 0.10 mm（ Roboz ，目录号：RS-5047），高压灭菌
3.显微解剖剪刀，3.5”直（ Roboz ，目录号：RS-5910），高压灭菌
4.立体显微镜，任何品牌（例如，Leica M165-FC）
5.离心机（热 Sorval Legend Micro 21)
6.II级A/B3生物安全柜
7.CO 2培养箱，NAPCO SERIES 8000DH
8.Varioskan闪光光谱扫描多模阅读器（Thermo Scientific）

程序

A.细胞分离

1.将 12 mL 的 PBS 倒入冰上 10 厘米的盘子中。
2.将 TrypLE预热至 37 °C 。
3.机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方法对怀孕的小鼠 (E10.5) 实施安乐死，例如吸入 CO 2然后进行开胸手术。
4.收获子宫并将其放入冰冷的 PBS 中（图 1）。
5.从子宫中收获胚胎并将它们保存在冰冷的 PBS 中（图 1，视频 1）。
6.隔离 BA1（图 2，视频 2），并将它们放入 1.5 mL 管中，并带有 100 μL 的冰冷 PBS（一个 BA1 到管中）。
7.100 度离心机 × g和室温 (RT) 5 分钟。
8.去除上清液，然后将预热的 100 μL TrypLE添加到 1.5 mL 管中。
9.在 37 °C 下孵育5-10分钟。使用宽孔 1,000 µL 吸头轻轻上下移液器。
10.在高级 DMEM 中添加 900 μL 的 10% FBS，然后轻轻移液5-10次。
11.以 100 × g和 RT 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
12.用 500 μL 的 PBS 重新悬浮细胞。
13.以 100 × g和 RT 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
14.用 150 μL 的 PBS 重新悬浮。
15.通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞。
16.将 10 μL 的细胞悬浮液放入 1.5 mL 管中，并与 10 μL 的台盼蓝混合，以评估细胞活力。

图 1. 从怀孕的老鼠身上收获胚胎。
（A-C）。用CO 2对怀孕的小鼠实施安乐死。用剪刀剪开皮肤，通过将消化道向前推，露出带有胚胎的子宫（箭头）。 (D)。用一把剪刀按照虚线箭头（从上到下）切割子宫。 (E)。按照箭头插入镊子，将子宫壁与胚胎分开。（F-I）。胚胎被小心地从胎盘、卵黄囊和羊膜中取出。比例尺：1 毫米。

视频 1. 从子宫中收获一个 E10.5 胚胎。
胚胎位于孤立子宫的浅红色区域（图 1E，上半部分），胎盘位于深红色区域（图 1E，下半部分）。镊子将小心地从分离的子宫的切割部位之一插入。将仔细去除子宫壁以收获带有卵黄囊的胚胎。随后，将取出卵黄囊和羊膜，如图 1H - I所示。

图 2. 从胚胎中收获第一个鳃弓。
（一种）。胚胎分为头部和躯干。如箭头所示，在 BA1 和 BA2 之间插入镊子。 (B, C)。用镊子将 BA1 从 MA 中分离出来，如 B 中的箭头所示，并将分离的 BA1 转移到 1.5 ml 管中。嘛;上颌弓，BA1；第一鳃弓，BA2；第二鳃弓。比例尺：1 毫米。

视频 2。从胚胎中收获 BA1。
用镊子轻轻压下胚胎的躯干，在BA1和BA2之间插入另一根镊子。然后用镊子轻轻按下头部，将BA1与头部分开。

B.微量培养

1.在高级 DMEM 中用 10% FBS 稀释纤连蛋白原液，制备 100 μg/mL 纤连蛋白溶液。
2.用 100 μg/mL 纤连蛋白溶液（5 × 10 5 个细胞/100 μL）重新悬浮细胞。
3.将 20 μL 的细胞播种到 35 mm 的盘子上。
4.在 37 °C 下孵育1.5 小时，使它们能够很好地附着。
5.在高级 DMEM 中添加 1 mL 的高级 DMEM，包括 10 μg/mL 纤连蛋白和 10% FBS。
6.在 37 °C 下孵育24 小时。
7.移除介质，然后在高级 DMEM/Ham 的 F-12 中添加 2 mL 的 4% FBS。
8.培养5天。
9.阿尔新蓝染色（图 3 和 C 部分）测量软骨形成分化，并建立qRT -PCR 以确定软骨形成标记基因的水平，例如 Sox9 和 2 型胶原蛋白（Yang等人，2021）。

体外原发性颅 NCC 的观察。
（一种）。显示了从 BA1 收获的原发性颅 NCC。来自 BA1 的颅 NCC 的形态接近于 O9-1 细胞 (Ishii et al ., 2012)，一种神经嵴干细胞系。（乙）。来自对照和 caAcvr1 的颅 NCC 的微量培养；进行了P0-Cre小鼠胚胎。细胞用阿尔新蓝染色。刻度条 (A) 100 µm 和 (B) 1 mm。

C.微量培养的阿新蓝染色

1.微量培养中吸出培养基。
2.用 1mL Bouin 的固定剂固定15 分钟。
3.用溶液 A 洗涤（参见配方）。
4.用溶液 B 洗涤（参见配方）。
5.用 2 mL 的 1 mg/mL阿尔新蓝在 3% 乙酸（见食谱）中染色 1 小时。
6.双蒸水 (ddH 2 O)洗掉染料四次。
7.保持在 2 mL 的ddH 2 O中。
8.拍照。
9.2 O洗掉染料。
10.通过在 RT 下用 1 mL 的 6 M 盐酸胍（见食谱）孵育培养物来提取染料。
11.595处的光密度，例如Thermo Scientific Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reade 。

笔记

1.为避免细胞死亡，胚胎/细胞应保持在冰上，直到它们被播种。
2.如果细胞活力低于 70 – 80%，请考虑使用死细胞去除试剂盒去除死细胞，例如美天旎死细胞去除试剂盒（美天旎生物技术，目录号：130-090-101）。
3.当细胞在 35 mm 培养皿上播种时，应保持液滴保持高密度细胞区域。培养 1.5 小时后，细胞应附着在 35 mm 培养皿上。小心添加高级 DMEM，包括纤连蛋白。
4.当天用于微量培养。但是，它们最多可以传代 3 次，分离后的总培养时间为 10 天。

食谱

1.纤连蛋白原液 (1 mg/m L )
1毫克纤连蛋白
1毫升PBS

2.10% FBS/Advanced DMEM 中的 100 µg/mL 纤连蛋白
60 µ L纤连蛋白原液
540 µL 10% FBS/高级 DMEM

3.10% FBS/Advanced DMEM 中的 10 µg/mL 纤连蛋白
100 µL 纤连蛋白原液
1 mL 10% FBS/高级 DMEM

4.高级 DMEM/Ham 的 F-12 中 4% FBS
48 毫升高级 DMEM
48 毫升 Ham 的 F-12
4 毫升胎牛血清

5.阿新蓝染色的溶液 A
将 0.5 mL 氢氧化铵溶液加入 500 mL 70% 乙醇中

6.阿新蓝染色的溶液 B
将 25 mL 的冰醋酸加入 70% 乙醇中，使最终体积为 500 mL。

7.1 mg/mL阿新蓝溶液
ddH 2 O中加入 0.6 mL 的冰醋酸，使最终体积为 20 mL。然后加入 20 毫克阿新蓝8GX。

8.6M盐酸胍
在 100 mL 的ddH 2 O中溶解 57.3 g 盐酸胍。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 ( R01DE020843 至 YM 和R01DE025897至 YK ) 、国际骨化纤维发育不良协会 (至 YM) 和中国国家自然科学基金 (31500788 至 JY) 的资助。我们感谢 W. Benton Swanson 博士的批判性阅读。该协议源自原始研究论文，Yang等人，增强 BMP 信号通过抑制自噬 b-连环蛋白降解使颅神经嵴细胞进入软骨形成命运。科学信号 14（665）：eaaz9368。（DOI：10.1126/scisignal.aaz9368）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均已获得密歇根大学 (#PRO00009613) 和德克萨斯大学 (AWC-18-0137) 的机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

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