材料和试剂

A.质粒DNA的制备 1.聚苯乙烯皮氏培养皿，10厘米（Stellar Scientific，目录号：TC-WB-7452）
2.pJCX4载体（Addgene，目录号：170756）
3.NEBNext高保真2×PCR主混合（新英格兰生物实验室，目录号：M0541L）
4.SYBR安全DNA凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：S33102）
5.Tris基地（费希尔科学公司，目录号：BP152-500）
6.冰醋酸（微孔西格玛，目录号：A6283-1L）
7.乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：15576028）
8.核仁自旋凝胶和PCR清洗，用于凝胶提取和PCR清洗的微型试剂盒（MachereyNagel，目录号：740609.50）

9.核仁自旋质粒，质粒DNA迷你试剂盒（Macherey Nagel，目录号：740588.50）
10.高保真限制性内切酶（新英格兰生物实验室）
11.SeaKem金琼脂糖（Lonza，目录号：50152）
12.快速结扎套件（新英格兰生物实验室，目录号：M2200S）
13.XL-10金活性细胞（安捷伦，目录号：200317）
14.LB琼脂（赛默飞世尔科学公司，目录号：22700025）
15.单硫酸卡那霉素（金生物技术，目录号：K-120-5）
16.PureLink HiPure质粒过滤器Maxiprep试剂盒（赛默飞世尔科学公司，Invitrogen，目录号：K210017）
17.0.5 M EDTA（参见配方）
18.50×三醋酸盐EDTA（TAE）（见配方）
19.1×TAE（见配方）
20.1%琼脂糖凝胶和SYBR安全DNA凝胶染色（见配方）

B.在Expi293F细胞中的表达 1.125 mL和500 mL聚碳酸酯一次性无菌通气盖锥形摇瓶（TriForest Labware，目录号：FPC0125S和FPC0500S）
2.15毫升和50毫升锥形管（Fisher Scientific，Falcon，目录号：14-959-53A和14-432-22）
3.10毫升血清学移液管（康宁，目录号：357551）
4.500毫升离心瓶（康宁，目录号：CLS431123-6EA）
5.Expi293F表达系统试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，Gibco，目录号：A14635）
6.Expi293F电池（赛默飞世尔科技有限公司，Gibco，目录号：A14527）
7.Expi293F表达培养基（赛默飞世尔科技有限公司，Gibco，目录号：A1435102）
8.Opti MEM还原血清培养基（赛默飞世尔科学有限公司，Gibco，目录号：31985070）
9.PEI MAX，转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（Polysciences，目录号：24765-1）
10.杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）（赛默飞世尔科技，目录号：MT21031CV）
11.1 mg/mL PEI转染试剂（见配方）

C.肠肽标记蛋白的纯化 1.50毫升带瓶盖的聚碳酸酯瓶（贝克曼·库尔特，目录号：361693）
2.几丁质亲和树脂（新英格兰生物实验室，目录号：S6651S）
3.KONTES色谱柔性柱（Avantor，VWR，目录号：KT420401-2510）
4.HEPES（黄金生物技术，目录号：H-400-1）
5.氯化钠（NaCl）（热科学，目录号：J21618-A9）
6.DL-二硫苏糖醇（DTT）（黄金生物技术，目录号：DTT100）

7.苯甲基磺酰氟（PMSF）（金生物技术，目录号：P-470-25）
8.β-巯基乙醇（βME）（圣克鲁斯生物技术公司，目录号：sc-202966）
9.腺苷-5'-三磷酸（ATP）（金生物技术，目录号：A-081-1）
10.考马斯亮蓝R-250（金色生物技术，目录号：C-461-5）
11.甲醇（Ibis Scientific，目录号：MX0486-1）
12.醋酸（Ibis科学公司，目录号：CP-M1010S）
13.12%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad，目录号：4561046）
14.丙烯酰胺凝胶考马斯染色溶液（见配方）
15.溶解缓冲液（见配方）
16.ATP洗涤缓冲液（见配方）
17.Intein卵裂缓冲液（见配方）

设备

A.质粒DNA的制备 1.PTC-200热循环机（MJ研究公司，目录号：MJ-G200）
2.水平电泳系统（Fisherbrand，目录号：FB-SBR-2025）
3.Eppendorf台式离心机（Eppendorf，目录号：EP-5415D）
4.水浴（托马斯科学公司，洪堡，目录号：1196X13）
5.帝国III 37°C培养箱（实验室系列，目录号：305）
6.QIArack（Qiagen，目录号：19015）

B.在Expi293F细胞中的表达 1.Isotemp二氧化碳培养箱（Fisherbrand，目录号：11-676-604）
2.耐二氧化碳轨道振动筛（赛默科学公司，目录号：88881101）
3.生物安全柜（Fisher Scientific，目录号：13-261-222）
4.冷冻台式离心机（贝克曼库尔特，型号：Allegra X-15R）

C.肠肽标记蛋白的纯化 1.Donce玻璃活塞均质器（VWR，Kontes玻璃，目录号：KT885300-0040）
2.Beckman Avanti J-20-I离心机（Beckman Coulter，目录号：8043-30-1169）
3.JA25。50转子（贝克曼库尔特，目录号：363055）
4.蠕动泵（Bio-Rad，目录号：7318140）
5.SDS-PAGE凝胶运行仪（Bio-Rad，目录号：1658025FC）

程序

A.质粒DNA的制备 1.设计PCR引物，扩增目的基因，并将其插入基因的多克隆位点（MCS）

质粒pJCX4（图1A）。根据设计指南（图1B），每个底漆上都有一个5'的突出部分。

图1。将目标基因克隆到载体pJCX4的说明。
（A）哺乳动物细胞表达载体pJCX4表达盒的示意图，包括插入靶基因的多克隆位点的限制性内切酶图谱。每个限制性内切酶的识别位点以灰色突出显示，消化位点以洋红色线条表示。（B）两个正向（5’）和反向（3’）引物设计的示例，用于扩增插入载体pJCX4的目标基因。带下划线的序列是限制性内切酶的识别位点。请注意，包括识别位点之前的三个碱基，以确保有效的酶切割。在这两个5'引物中，Kozak一致序列GCCACC遵循限制性内切酶位点。NNN表示目标基因的核苷酸序列。在3'引物中，需要限制性内切酶位点后面的碱基，以确保与肠肽的精确连接。不要在3'引物的退火区域包含终止密码子。

2.混合以下成分进行PCR反应。50μL PCR反应体积：
a、 25μL NEBNext 2×PCR主混合物 b、 1μL靶基因模板DNA（1-10 ng DNA） c、 2.5μL前向底漆，10μM（最终浓度=0.5μM） d、 2.5μL反向底漆，10μM（最终浓度=0.5μM） e、 19μL ddH2O 3.在热循环器中进行PCR反应
a、初始变性（30秒，98摄氏度） b、变性（10秒，98摄氏度）
c、退火（30秒，52-65摄氏度） d、延长（25秒/千字节，72摄氏度）重复步骤b-d 30个循环。 e、最终延伸（2分钟，72°C） 4.PCR产物在1%琼脂糖凝胶上以SYBR-Safe在80 V水平电泳系统中运行20分钟。
5.从凝胶中提取PCR产物条带，并按照制造商的方案，使用核仁自旋凝胶和PCR清洗试剂盒回收DNA。以25μL的体积洗脱回收的PCR产物。
6.用PCR引物悬置中包含的限制性内切酶消化回收的PCR产物。
30 μL反应体积：
a、 25μL回收的PCR产物，约1μg DNA b、 1μL高保真酶1（结合在前向引物的5'突出部分） c、 1μL高保真酶2（结合在反向引物的5'突出部分） d、 3μL 10×缓冲液（如果使用NEB高保真酶，则使用CutSmart缓冲液）在37°C的水浴中培养1小时。 7.用PCR产物引物悬挑上的相同限制性内切酶消化质粒pJCX4。
30 μL反应体积：
a、可变体积质粒pJCX4（1μg DNA） b、 1μL高保真酶1 c、 1μL高保真酶2 d、 3μL 10×缓冲液（如果使用NEB高保真酶，则使用CutSmart缓冲液） e、总体积达30μL的ddH2O在37°C的水浴中培养1小时。 8.将消化后的质粒在1%琼脂糖凝胶上运行20分钟，SYBR在80 V下安全。从凝胶中提取质粒带，并按照制造商的方案，使用核仁自旋凝胶和PCR清洗试剂盒回收DNA。以20μL的体积洗脱消化的质粒DNA。
9.按照制造商的方案，使用核仁自旋凝胶和PCR清洗试剂盒回收消化的PCR产品。以20μL的体积洗脱消化的质粒DNA。
10.使用2:8的质粒插入比，混合以下组分进行连接反应。20μL反应体积：
a、 10μL快速连接酶2×缓冲液 b、 8μL经消化的PCR产物 c、 2μL消化质粒 d、 1μL快速连接酶在25°C的水浴中培养10分钟。
11.按照制造商的指示，将5μL连接混合物转化为XL-10金活性细胞

协议在含有50µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上接种200μL转化，并在37°C培养箱中培养12-18小时。
12.刮取单个菌落的一半，以接种含有50µg/mL卡那霉素的5 mL LB培养物，并在37°C下搅拌（220 rpm）的培养箱中生长12–18 h。在平板上指示用于接种的培养物，并将LB琼脂平板储存在4°C下。
13.按照制造商的方案，使用核仁自旋质粒miniprep试剂盒从培养物中分离质粒DNA。
14.通过使用CMV for（正向）和Mxe rev（反向）测序引物进行Sanger测序，确认质粒中目标基因的存在和位置。引物序列见表1。

表1。用于验证目标基因插入pJCX4 MCS的引物

引物名称
引物序列
巨细胞病毒
5'-CGCAAATGGCGGTAGGGCGTG
Mxe版本
5'-GATTGCATGCGCGGTCAGG

15.从LB琼脂平板上，使用经序列验证包含目标基因的相同菌落，接种含有50µg/mL卡那霉素的100 mL LB培养物。
16.按照制造商的协议，使用PureLink HiPure质粒过滤器Maxiprep试剂盒和QIArack从培养物中分离质粒DNA。
注：miniprep和maxiprep试剂盒均用于从细菌培养物中分离质粒DNA。
一旦质粒序列得到验证，就会使用maxiprep来产生转染Expi293F细胞所需的大量DNA。

B.在Expi293F细胞中的表达 1.按照制造商关于Expi293F表达系统试剂盒的协议解冻、建立和培养细胞。在37°C的温度下，在带有8%CO2增湿空气的培养箱中，在轨道振动筛（125 rpm）上，在Expi293F培养基和无菌通气盖Erlenmeyer摇瓶中培养细胞。选择时不需要抗生素。
2.在无菌通气盖锥形摇瓶中以2.5×106个细胞/毫升的密度制备培养物进行转染。我们通常转染250毫升培养物。将培养物放在37°C、8%CO2的培养箱中，以最大限度地保持健康。
3.在25°C条件下，将5mL Opti MEM等分放入无菌柜下的两个15mL锥形管中。
4.在Opti MEM的一个锥形管中，每1mL Expi293F培养物添加1µg来自maxiprep的纯质粒DNA进行转染。
5.在Opti MEM的另一个锥形管中，每1mL Expi293F培养液中加入3µL 1mg/mL聚乙烯亚胺（PEI）进行转染。
6.将DNA和PEI混合物在25°C的无菌柜下分别培养5分钟，然后将两种混合物混合到一个15毫升的锥形管中，再培养25分钟。

7.将Expi293F培养物短时间转移到橱柜下，添加DNA和PEI混合物，然后将其返回培养箱中培养48至72小时，这是针对每种蛋白质进行的优化。为了优化生长时间，进行小规模纯化或Western blot以验证转染后不同时间的蛋白质表达水平（Figute 2）。
8.通过在4000×g和4°C下离心10分钟来收获细胞。为了清洗残余培养基，使用血清学移液管在4°C下将细胞颗粒重新悬浮在10 mL PBS中，转移到50 mL锥形管中，然后通过离心再次将细胞颗粒化。在-80°C下储存，直至净化。

图2。Expi293F转染示意图。
纯质粒DNA和聚乙烯亚胺（PEI）分别在Opti-MEM培养基中培养5分钟，然后结合并再培养25分钟。将DNA和PEI混合物以2.5×106细胞/mL的密度倒入Expi293F培养基中，转染后培养48至72小时。

C.肠肽标记蛋白的纯化 1.在纯化当天制备新鲜的裂解缓冲液（见配方），并在4°C下储存。
2.用几丁质亲和树脂制备柔性柱，方法是将约15毫升制造商的树脂混合物移液到柱中，然后将树脂底部填充，使储存溶液排干。填充树脂的体积应为7–10毫升。
3.通过10柱体积的裂解缓冲液使几丁质亲和柱达到平衡。对于该步骤和所有后续步骤，通过重力或蠕动泵以1 mL/min的速率流动。
4.在25°C水浴中解冻含有转染的Expi293F细胞颗粒的锥形管。
5.通过使用血清学移液管上下移液，将细胞重新放置在相当于细胞颗粒体积两倍的溶解缓冲液中。
6.使用紧密配合的活塞，用Dunce玻璃活塞均质器20次溶解细胞。使用均质器溶解细胞时，避免引入气泡。
7.将裂解液转移到离心管中，并在20000×g和4°C下离心20分钟进行澄清。

8.将澄清的裂解液装入平衡的几丁质亲和柱。
9.用20柱体积的裂解缓冲液清洗色谱柱。
10.用10柱体积的ATP洗涤缓冲液洗涤色谱柱（见配方）。ATP有助于去除与目标蛋白结合的不需要的伴侣蛋白。
11.从树脂中去除多余的缓冲液，然后添加相当于树脂体积两倍的intein裂解缓冲液（参见配方）。轻轻搅拌树脂，使裂解缓冲液均匀分布。
12.将树脂在25°C的intein裂解缓冲液中培养24小时。
13.通过从几丁质柱中排出液体来洗脱裂解的目标蛋白。蛋白质的储存取决于每种蛋白质的稳定性。通常，蛋白质可以在冰上储存几天，也可以在-80°C的冰箱中长期储存。

D.例子本文描述的程序已在我们实验室用于几种蛋白质的表达纯化。一个例子是原肌球蛋白（Tpm），它是一种平行卷曲的螺旋蛋白，对称地结合在肌动蛋白丝的每一侧，形成一个由头到尾相互作用的Tpm分子组成的长绳状聚合物。Tpm的头尾相互作用取决于其Nand和C端的完整性，以及天然N端乙酰化（Heald和Hitchcock DeGregori，1988；Maytum等人，2000；Palm等人，2003），它还受其他形式的PTM的影响，例如磷酸化（Rao等人，2009年；Lehman等人，2015年；Palani等人，2019年；Rajan等人，2019年）。关于Tpm的许多生化研究都依赖于细菌中表达的蛋白质，这些蛋白质使用了氨基间乙酰化模拟物，正如我们所示（Carman等人，2021年），不能准确解释某些Tpm亚型的天然PTM。这里描述的表达系统使我们首次获得完全天然的Tpm蛋白质，不含来自标签的额外氨基酸，并具有天然的PTM，例如N端乙酰化（图3）。

图3。SDS-PAGE分析Tpm3。1使用此处描述的方法获得。

E.考虑因素如果目标蛋白不能耐受25°C下的培养，则可在4°C下进行肠肽自切割；然而，为了实现完全卵裂，孵化时间可能会更长（48到72小时）。使用这种方法，我们可能无法成功地获得含有二硫键的蛋白质，而使用这种方法可能无法获得含有二硫键的蛋白质。

数据分析

蛋白质的表达和纯化可通过SDS-PAGE进行分析。丙烯酰胺凝胶（12%）可装载10μL蛋白质样品，并在200 V下运行50分钟。可通过考马斯染色和去染色（见配方）观察蛋白质条带。

食谱

1.0.5 M EDTA
a、向80毫升ddH2O中加入18.61克EDTA，并用磁力搅拌器搅拌。 b、使用氢氧化钠颗粒将pH值调节至8.0。在溶液接近pH值8.0之前，EDTA不会完全溶解。 c、通过0.22μm真空膜进行高压灭菌或无菌过滤。 2.50×TAE
242 Tris基的g
57.1毫升冰醋酸100毫升0.5 M EDTA，pH值8.0 ddH2O至1升
在25°C下储存。
3.1×TAE
20 50×TAE毫升
ddH2O在25°C下最多可储存1L。
4.1%琼脂糖凝胶与SYBR安全DNA凝胶染色
a、向250毫升烧杯中加入0.5克琼脂糖，并在50毫升1×TAE中悬浮。 b、微波加热30秒，直到溶液澄清。避免让溶液在烧杯边缘沸腾。 c、让溶液冷却至约50°c。向溶液中添加5 mL 1000×SYBR安全DNA凝胶染色剂，并旋转混合。 d、将琼脂糖溶液倒入凝胶注模设备中，使其凝固。 5.1 mg/mL PEI转染试剂

a、向烧杯中加入100 mg PEI-MAX，并悬浮在90 mL ddH2O中。用搅拌棒搅拌。 b、加入几滴盐酸，直到pH值<2.0。 c、盖上烧杯顶部并搅拌，直到粉末完全溶解。 d、加入几滴氢氧化钠，直到pH值为7.0。 e、将溶液转移到100毫升刻度瓶中，并添加ddH2O至100毫升。 f、通过0.22μm真空膜进行无菌过滤。在无菌柜下等分放入1.5毫升的Eppendorf试管中，并在4°C下储存。 6.丙烯酰胺凝胶考马斯染色溶液40%甲醇（v/v）
10%醋酸（v/v）
1 考马斯亮蓝R-250
7.40%甲醇（v/v）丙烯酰胺凝胶的去污溶液
10%醋酸
8.裂解缓冲液
20 mM HEPES pH值7.5
500 氯化钠
1 毫米DTT
1 甲基苯磺酰氟（PMSF）
9.ATP洗涤缓冲液
20 mM HEPES pH值7.5
200 氯化钠
5 mMgCl2
5 mM ATP
10.内肽裂解缓冲液20 mM HEPES pH 7.5 200 mM NaCl
50 β-巯基乙醇（βME）

致谢

该方案改编自最近发表的一项研究(卡曼等, 2021这项工作由国立卫生研究院资助的R01 GM07391和RM1 GM1365 11RD和P.J.C.的BravaTnk家庭基金会资助。

竞争利益

作者声明没有相互竞争的利益。

工具书类

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