材料和试剂

1.50 mL 含有异型囊或 akinetes 的蓝藻液体培养物
2.移液器吸头（10 µL、200 µL、1,000 µL）（LTS、RAININ、Mettler Toledo. Gießen ）
3.1.5 mL 微量离心管
4.50 毫升锥形管
5.软石墨铅笔
6.30 厘米尺
7.纸胶带（遮蔽胶带）
8.甲醇≥99.9% (HPLC 级) (Sigma, Merck, Darmstadt)
9.氯仿（HPLC 级）（Roth, Karlsruhe）
10.涂有硅胶的铝板（ Macherey -Nagel，目录号：818033）
11.乙酸（Sigma、默克、达姆施塔特）
12.MilliQ水
13.25％硫酸（H 2 SO 4 ）（Carl Roth；目录号：0967.1）

设备

1.移液器( P1000 、P200、P20 和 P10) (RAININ, Mettler Toledo)
2.100 毫升锥形瓶
3.50 毫升玻璃烧杯
4.离心机：
微量离心管的离心机( Eppendorf, 5417C)
锥形管的离心机（Eppendorf，Centrifuge 5804 R）
5.Vortex Genie ® 2（ Scientific Industries, Inc.，目录号：6235684 ）
6.通风柜
7.电吹风
8.用于 TLC 板开发的培养箱或烘箱（可以是达到所需温度180°C的任何培养箱）
9.平板扫描仪（例如，EPSON Perfection V550 Photo）
10.TLC 显影室（ Macherey -Nagel GmbH & Co. KG，目录号：9003500）
11.带锥形瓶的 TLC 喷雾器（例如，DWK Life Sciences Kimble TM Kontes TM试剂喷雾器头）

软件

1.扫描仪软件（例如，EP SON Scan）

程序

A.细胞培养
3 - （仅具有营养细胞的细丝）和不存在 NO 3 - （含有异质细胞的细丝）的情况下生长的蓝藻培养物，或被诱导形成 akinetes 的培养物（Perez等人，2016 年）。

B.薄层色谱 (TLC)
第 1 天。样品制备
1.取 3 × 1 mL 的每种培养物，并按照所述估计叶绿素a浓度（Zavřel等人，2015 年）。
注意：要在 TLC 板中获得良好的可见脂质模式，样品应包含 20 – 50 µg Chl a。
2.将估计的培养体积在 3,000 × g和室温 (RT) 下离心 10 分钟（细胞在等量的Chl下沉淀每个样本中的数量）。
3.将 30 mL 的甲醇：氯仿(1:1) 添加到颗粒中，并用涡旋混合器充分混合。此步骤将导致脂质的提取。
注意：使用有机溶剂时，请始终在通风橱下工作。
4.3,000 离心机 × g 10 分钟，然后将上清液转移到 50 mL 玻璃烧瓶中。
5.让它在通风橱下蒸发过夜。您可以通过施加氮气蒸汽流来加速蒸发。如果需要进行详细分析，例如通过高效液相色谱与质谱联用 (HPLC-MS) 对不同糖脂种类进行精确识别和定量，这将是必要的。

第 2 天
1.样品采集
a.的干燥提取物中加入 200 μL 氯仿，通过移液溶解颗粒，收集脂质并转移到 1.5 mL 微量离心管中。再重复一次此步骤以收集烧瓶中的所有提取物（此步骤应快速完成，因为氯仿蒸发得非常快）。
b.让样品在通风橱中干燥，直到管中剩余 20-40 µL 的体积。
2.显影室的准备
a.在进行实验之前，始终用甲醇预洗腔室。
b.混合溶剂（氯仿：甲醇：乙酸酸：水），比例为23:4:2.7:1 （170 mL 氯仿、30 mL 甲醇、20 mL 乙酸和 7.4 mL MilliQ水）。
c.盖上盖子并用纸胶带密封水箱。不要移动腔室。
d.在使用溶剂系统（溶剂混合物）之前，用它平衡腔室 1 小时。
3.样品的发现和 TLC 的开发
注意：这可以在腔室平衡时完成。
a.使用软铅笔，在 2 cm 处标记原点线（您将发现样品的线）和在 15 cm 处标记显影线（预定的溶剂前沿高度）从 TLC 板的底部。
笔记：
i.始终戴上手套处理 TLC 板。即使戴着手套也不要触摸板的表面。
ii.仅标记 TLC 板的外边缘，因为铅笔可能会干扰样品和溶剂。
b.使用微量移液器 (P20) 在原点线上点 5–10 μL 的样品，彼此之间的距离至少为 1 厘米。
c.斑点后，使用吹风机以低热模式吹干斑点。
d.重复步骤 b。和 c。直到整个样品用完并干燥。
e.快速将 TLC 板放入腔室中，以防止溶剂蒸气从腔室中洗脱。
f.让样品运行直到它们到达开发线（~1.5 小时）。
g.将盘子从腔室中取出，在通风橱下晾干 10-20 分钟（不要使用吹风机）。
注意：始终从腔室中取出剩余的溶剂并将其转移到有机废物中。
h.当盘子完全干燥后，用 TLC 喷雾器从通风柜下 5-10 厘米的距离喷洒整个盘子H 2 SO 4 ( 25%)（靠近盘子喷洒可能会混淆结果）。
注意：使用实验室围裙、手套和外科口罩。
i.让盘子在通风橱下干燥一小段时间（2-5 分钟）。
j.将板放入180°C的烤箱中60-120 秒（直到看到条带）。
k.使用平板扫描仪记录结果（参见图 2）。

数据分析

变曲霉(1-3) 和点状猪笼草(4-6)不同细胞提取物的脂质提取物薄层色谱图。
(1, 4) 用硝酸盐生长的营养细丝。 (2, 5) 含有在没有硝酸盐的情况下生长的细丝的异胞。 (3) 弱光诱导的运动，或 (6) 磷酸盐饥饿 2 个月。蓝色箭头表示一种异囊特异性糖脂（HG 26 -二醇）。红色箭头表示A. variabilis动植物提取物中的未知脂质。图改编自 Perez等人。（ 2018 年）。

致谢

该协议是Nichols 和 Wood (1968)和Winkenbach等人描述的方法的改编版本。（1972 年）。
RG 和 RP 得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）的赠款 GRK1708 的支持。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考

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2.Fan, Q.、Huang, G.、 Lechno-Yossef , S.、Wolk, CP、Kaneko, T. 和 Tabata, S. (2005)。鱼腥藻中包膜糖脂合成和沉积所需的成簇基因。菌株 PCC 7120。摩尔微生物58（1）：227-243。
3.Fay, P. (1992)。蓝藻固氮的氧关系。微生物第 56(2) 版：340-373。
4.Fiedler, G.、Arnold, M.、 Hannus , S. 和 Maldener, I. (1998)。 DevBCA 出口商对于蓝藻鱼腥藻的异质囊的包膜形成至关重要。菌株 PCC 7120。摩尔微生物27（6）：1193-1202。
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9.Nichols, BW 和 Wood, BJB (1968)。新的糖脂，特异于固氮蓝绿藻。自然217（5130）：767-768。
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15.Zavřel , T., Sinetova , MA 和Červený , J. (2015)。蓝藻中叶绿素a和类胡萝卜素浓度的测量。生物协议5(9)：e1467。