材料和试剂
A. 消耗品
1. 无菌移液器吸头（10 μL 、 100 μL 、1,000 μL 、 5 m L ）
2. 培养皿（60 mm × 15 mm、90 mm ×15 mm）
3. 250 m L锥形瓶
4. 奇迹布
5. 不锈钢实验室刮刀
6. 50 m L Falcon 管
7. 微量离心管（1.5 m L ，2.0 m L ）
8. 200 μL PCR管
9. 20 m L注射器
10. 烧杯（50 毫升， 200毫升）
11. 细菌过滤器（0.45 nm）
12. 封口膜

B. 感受态细胞
1. 大肠杆菌JM109感受态细胞（自制）

C. 质粒
1. pBluescript SK II +( pBS -SK II+)
2. pYF515（由 Fang 和 Tyler 构建，2016 年）（图 1）

图 1. pYF515 载体同时表达 Cas9 基因和 sgRNA。
Cas9和选择标记NPT II的表达由Ham34启动子驱动，sgRNA[包括侧翼核酶、锤头核酶(HH核酶)和HDV核酶]的转录由RPL41启动子驱动。

D. 引物（见表 1）

表 1. 寡核苷酸列表（见补充信息）
引物名称序列 ( 5' → 3' )
139767-sgRNA1-F CTAGCTAGCCCGTCACTGATGAGTCCGTGAGGAC
139767-sgRNA1-R CTAGGGTCTCGAAACCAATGGTGACTACACCGTCAGACGAGCTTACTCGTTTCG
139767-sgRNA2-F CTAGCTAGCTAGTAGCTGATGAGTCCGTGAGGAC
139767-sgRNA2-R CTAGGGTCTCGAAACCCACTAGGTTGCAGTAGTAGGACGAGCTTACTCGTTTCG
139767-up1kb-F CTATAGGGCGAATTGGGTACCGCATTTCCGCAGTTCTCGTC
139767-up1kb-R GTCGCGGTGAGTTCAGGCATCGTCTACCTCCACTACGCG
139767-down1kb-F GTCCGAGGGCAAAGGAATAGACAAGCTACTCTTAGACTTTT
139767-down1kb-R AGGGAACAAAAGCTGGAGCTCAACGCAAGCACTGTCAAAGC
HPH-F ATGCCTGAACTCACCGCGAC
HPH-R CTATTCCTTTGCCCTCGGAC
139767-基因组-F TTTGAAGACAAAAGCGGGCG
139767-基因组-R TACTCGACGATACAGCACGC
139767-overup-F1 GGCCCGTGAATAAAACCCCT
Hph-overup-R1 ACCATCGGCGCAGCTATTT
Hph-overdown-F2 CGGGGATTCCCAATACGAGG
139767-overdown-R2 TAGCGTGTGTCAGATCCACC
M13F GTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC

E. 拉紧
1. 疫霉菌株 P6497
2. 大肠杆菌JM109（ KangTi Life Technology，目录号： KTSM107L)

F. 酶和缓冲液
1. BsaI和 10× Cutsmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：R3733S）
2. NheI （New England Biolabs，目录号：R3131S）
3. T4 DN A 连接酶和 10× T4 DNA 连接酶缓冲液（Takara，目录号：2011A）
4. 2× Phanta ® Max Master Mix（Dye Plus）（ Vazyme ，目录号：P525）
5. TaKaRa Taq TM ,10× PCR Buffer（ Mg 2+ plus）和 dNTP Mixture（Takara，目录号：R001）

G. 套件
1. FastPure ® Gel DNA Extraction Mini Kit（ Vazyme ，目录号：DC301）
2. 克隆快车® ULtra One Step Cloning Kit（ Vazyme ，目录号：C115）
3. FastPure ® Plasmid Mini Kit（ Vazyme ，目录号：DC201-01）
4. DNAsecure 新植物基因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN BIOTECH，目录号：DP320 ）
5. 塔卡拉 MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 （Takara，目录号：9761）

H. 抗生素
1. 氨苄青霉素（最终浓度为 50 mg/mL）（Aladdin，目录号：69-52-3）
2. G418（最终浓度为 50 mg/mL）（ Warbio ，108321-42-2）

I. 媒体（见食谱）
1. Luria-Bertani 琼脂板 + 50 mg/mL 氨苄青霉素
2. Luria-Bertani 液体培养基
3. 10% V8 琼脂板 +50 mg/mL G418
4. 10% V8液体培养基
5. 营养豌豆汤和琼脂培养基（琼脂板和液体）
6. 甘露醇豌豆汤（琼脂板和液体）

J. 试剂
1. V8 蔬菜汁（Campbell Soup Company，目录号：‎051000153159）
2. 冷冻青豆
3. 裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L1412）
4. CELLULYSIN 纤维素酶（Millipore，目录号：9012-54-8）
5. Bacto胰蛋白胨（OXOID，目录号：73049-73-7）
6. 酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：8013-01-2）
7. NaCl（阿拉丁，目录号：7647-14-5）
8. 琼脂（阿拉丁，目录号：9002-18-0）
9. CaCO 3 （ Sangon ，目录号： 471-34-1 ）
10. CaCl 2 （ Sangon ，目录号：10043-52-4）
11. KCl （ Sangon ，目录号：7447-40-7）
12. PEG4000（阿拉丁，目录号：25322-68-3）
13. 生物素（阿拉丁，目录号：58-85-5）
14. 叶酸（阿拉丁，目录号：59-30-3）
15. L-肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：551-72-4）
16. 烟酸（Aladdin，目录号：59-67-6）
17. 吡哆醇-HCl（阿拉丁，目录号：58-56-0）
18. 核黄素（阿拉丁，目录号：83-88-5）
19. 硫胺素-HCl（阿拉丁，目录号：59-43-8）
20. FeC 6 H 5 O 7 ·3H 2 O（ Sangon ，目录号：17217-76-4）
21. ZnSO 4 ·7H 2 O（ Sangon ，目录号：7446-20-0）
22. CuSO 4 ·5H 2 O（ Sangon ，目录号：7758-99-8）
23. MgSO 4 ·H 2 O（ Sangon ，目录号：14567-64-7）
24. H 3 BO 3 （ Phytotech ，目录号：10043-35-3）
25. MoO 3 （ Phytotech ，目录号：1313-27-5）
26. KH 2 PO 4 （ Sangon ，目录号：7778-77-0）
27. K 2 HPO 4 （ Sangon ，目录号：7758-11-4）
28. KNO 3 （阿拉丁，目录号：7757-79-1）
29. D-山梨糖醇（阿拉丁，目录号：50-70-4）
30. D-甘露醇（阿拉丁，目录号：69-65-8）
31. 葡萄糖（阿拉丁，目录号：50-99-7）
32. MgCl 2 ·6H 2 O（金刚石，目录号：7791-18-6）
33. MES（阿拉丁，目录号：4432-31-9）
34. Tris-HCl（金刚石，目录号：1185-53-1）
35. EDTA（ Phytotech ，目录号：60-00-4）
36. 十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）（ Phytotech ，目录号：57-09-0）

K. 解决方案
1. 0.8 M 甘露醇溶液，121°C 高压灭菌 20 分钟
2. 0.5 M CaCl 2溶液，使用 0.45-mm 过滤器消毒
3. 0.5 M KCl溶液，使用 0.45-mm 过滤器消毒
4. Luria-Bertani 培养基（见食谱）
5. 10% V8 琼脂（见食谱）
6. 豌豆汤（见食谱）
7. 营养豌豆汤和琼脂培养基（见食谱）
8. 0.5 M MES-KOH 溶液（见配方）
9. W5 解决方案（参见食谱）
10. MMg溶液（见配方）
11. 酶溶液（见食谱）
12. % PEG 溶液（见配方）
13. 甘露醇豌豆汤（见食谱）
14. 2% CTAB 溶液（见配方）
15. 维生素储备（见食谱）
16. 微量元素（见食谱）

设备

1. 移液器 (Eppendorf)
2. 旋转混合器（Select BioProducts ，型号：SBS550-2）
3. PCR 仪（Bio-Rad，型号： T100 TM )
4. 光学显微镜（徕卡，型号： DM500）
5. 培养箱（25°C）（宁波江南，型号：HWS-1000）
6. 水浴（42°C）（SHELLAB，型号：SWB7-2）
7. 台式离心机（4°C）（ Thermofisher ，型号：ST8）
8. 恒温摇床 (37°C)（Crystal，型号：IS-RSD3）
9. DNA 电泳仪（Bio-Rad，型号： 1704469)

软件

1. sgRNA 设计软件： EuPaGDT ( http://grna.ctegd.uga.edu/ )
2. 序列比对：SeqHunter2 ( https://sourceforge.net/projects/seqhunter2 )

程序

A. 筛选和分析 sgRNA目标
1. 使用EuPaGDT查找目标基因序列中所有合格的 sgRNA。
在“工作名称”栏中输入基因ID，在“RNA引导的核酸酶选择”栏中选择“SpCas9”选项，在“基因组（展开一个类别并选择一个）”栏中选择来自Oomycetes的P. sojae P6497，在“Sequence”栏中输入基因序列，点击“get guide RNA”，即可获取目标序列中所有潜在的sgRNA靶点。
2. 候选 sgRNA 的脱靶分析。
在候选基因的正义链和反义链中找到一个sgRNA靶点，选择候选sgRNA的核心区域（3'端的12 bp种子序列和NGG PAM序列），并与P的基因组序列进行比对.sojae ，使用Seqhunter2中的序列比对工具或在线网络服务器EumicrobeDB ( http://www.eumicrobedb.org )。选择具有良好特异性的 sgRNA 靶标。

B. CRISPR/Cas9质粒的构建
1. sgRNA合成（以Ps139767为例）
a. 引物设计
RIbo + sgRNA+HDV-Ribo的序列如下：
NNNNNN CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC NNNNNN -(N)14
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA
AGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCG
CCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGAC

（以20 bp序列TGACGGTGTAGTCACCATTG为例）
目标片段序列：
5'CTAGCTAGCCCGTCACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCTGACGGTGTAGTCACCATTGGTTTCGAGACCCT AG 3'

聂：
5 ′ … GCTAGC …3 ′
3 ′ … CGATCG … 5 ′
基础：
5 ′ … GGTCTC (N)1 …3 ′
3 ′ … CCAGAG (N)5 … 5 ′
设计的引物是：
F ： 5'CTAGCTAGCCCGTCACTGATGAGTCCGTGAGGAC 3 ' _
R ： 5'CTAGGGTCTCGAAACCAATGGTGACTACACCGTCAGACGAGCTTACTCGTTTCG 3 ' _

b. 克隆 sgRNA。
sgRNA 载体模板是含有 sgRNA 片段的 pYF515。
使用以下方法设置 PCR 扩增反应：
2× Phanta ® Max Master Mix (Dye Plus) 25μL _ _
正向寡核苷酸 (10 µM) 1微升_
反向寡核苷酸 (10 µM) 1微升_
模板 1微升_
将 ddH 2 O 添加到 50微升_

通过 PCR 扩增目标区域 [退火温度 (x) 取决于引物]：
95 ℃ 5分钟 1个周期
95 ℃ 30 秒 32 个周期
x °C 30 秒
72 ℃ 10 秒
72 ℃ 5分钟 1个周期
4 ℃ 抓住 1个周期

2. 酶切 sgRNA 片段。
BsaI 0.5μL _ _
奈尔 0.5μL _ _
10× Cutsmart缓冲区 5微升_
sgRNA片段 20微升_
将 ddH 2 O 添加到 50微升_

3. pYF515 载体的酶消化。
BsaI 4微升_
奈尔 4微升_
10× Cutsmart缓冲区 20微升_
模板 8微克
将 ddH 2 O 添加到 200微升_

4. 采用 MiniBEST DNA Fragment Purification Kit分别纯化消化后的载体和片段。
5. 将 sgRNA 片段连接到pYF515载体。
T4 DNA连接酶 1微升_
10× T4 DNA 连接酶缓冲液 1微升_
线性化向量 1–2微升_
sgRNA片段 7微升_
将其置于 10 – 16°C 下 2 小时。
6. 使用 10 μL的连接产物转化大肠杆菌JM109 感受态细胞（自制）。
7. 使用FastPure Plasmid Mini Kit 提取质粒并将其送去测序使用 M13F 和 M13R 引物。

C. 替代载体的构建。
1. 放大目标基因上游 1 kb 和下游 1 kb 的序列，以及替换片段 HPH。
2. 切割凝胶后，使用FastPure ® Gel D NA Extraction Mini Kit回收片段。
3. 多片段连接。
载体碱基对数] ng (0.03 pmol )
每个片段的最佳使用量 = [0.02× 每个片段的碱基对数] ng (0.03 pmol )
的体积（X、Y 1 、Y 2和 Y 3 ）取决于碱基对的数量及其浓度。
2× ClonExpress混合 5微升_
pBluescript SK II+ 向量，线性化 X μ L
UP-1Kb 片段是1 微升_
Down-1Kb 片段是2 微升_
替换片段是3 微升_
ddH 2 O 至10微升
在 PCR 机中 50°C 放置 15 分钟；直接降到 4 °C 。
4. 使用 10 μL的连接产物转化大肠杆菌JM109 感受态细胞（自制）。
5. 使用FastPure Plasmid Mini Kit 提取质粒并将其送去测序使用 M13F 和 M13R 引物。

D. 大豆大豆原生质体的稳定转化
1. 激活P. sojae ，并在 25°C 的黑暗中培养 3 至 4 天（图 2A）。
2. 使用手术刀从菌落边缘切割 3 × 3 mm 新鲜菌丝体块，并将其添加到含有 50 mL 液体 NPB 的 250 mL Erlenmeyer烧瓶中。每个锥形瓶可以容纳八个菌丝体块。 25°C避光培养2.5-3天，培养期间每半天摇晃一次。三瓶酱油培养物最适合六个 DNA 样本（图 2B）。
3. 打开超净工作台，用紫外线灯消毒 30 分钟。在此期间，称量制备酶溶液所需的酶量，并将 40% PEG 所需的 PEG 放入无菌50 mL 烧杯中。称重过程中使用的工具必须尽可能清洁和无菌。
4. 用绑在 200 m L烧杯上的高压灭菌纱布过滤已培养2.5 至 3 天的酱油菌菌丝，将菌丝块放入 50 m L Falcon 管中，并用约 40 m L的 0.8 M冲洗一次甘露醇。用另一个包裹在 200 mL 烧杯上的无菌纱布再次收集菌丝，将菌丝放入 50 m L Falcon 管中，然后将 35 m L的 0.8 M 甘露醇缓冲液倒在上面。为了用甘露醇充分处理菌丝，将 Falcon 管倒置以完全分离菌丝。用旋转混合器在20 rpm (0.003 × g ) 和室温 (RT) 下摇动和洗涤菌丝 10 分钟。
5. 在此期间，准备酶溶液。将指定体积的每种组分加入到已消毒的 50 m L烧杯中，用移液器吸头搅拌至完全溶解，然后过滤到带有 0.45 nm 细菌过滤器的 50 m L Falcon 管中。
6. 菌丝冲洗10分钟后，收集适量菌丝，加入装有酶溶液的Falcon管中。要完全消化菌丝，请将离心管倒置，并通过在 60 rpm 和 25°C 下离心 40-50 分钟来进行酶水解（图 2C）。
7. 制备 40% PEG 溶液时，加入规定体积的各组分，用移液器吸头搅拌直至完全溶解，用 0.45 nm 细菌过滤器将溶液过滤到 50 m L无菌烧杯中，置于冰上以后使用。
8. 带有两层mira布的 50 m L烧杯过滤菌丝并收集原生质体。使用 50 m L圆底离心管将收集的原生质体置于水平离心机中，以240 × g和4°C 离心 4 分钟。
注意：所有后续操作都需要将原生质体保持在低温（图 2D）。
9. 弃去上清液，加入约10 mL预冷的 W5 溶液轻轻重悬原生质体，然后加入 W5 溶液至 35 mL ，240 × g和 4°C 离心 4 分钟。
10. 弃去上清液，加入约10 mL预冷的W5 溶液，轻轻重悬原生质体。置于冰上 30 分钟，然后在 240 × g和4°C 下离心 4 分钟。
11. 弃上清，根据样品数量加入预冷的MMg溶液重悬原生质体，使原生质体浓度达到2×10 6 / mL。保持在 RT 10 分钟。
12. 将至少 30 μg的转化质粒添加到放置在冰上的几个新的 5 0 m L Falcon 管的底部。
13. 加入 1 mL原生质体，轻轻敲击试管完全混合，然后将样品置于冰上5-10分钟。
14. 添加580微升 PEG 溶液沿管壁向每个 Falcon 管 3 次，总共 1.74 m L PEG 溶液。在添加过程中轻轻旋转 Falcon 管，使 PEG 可以沿管壁流入质粒和原生质体的混合物中。加入总量的 PEG 溶液后，轻轻敲击管子混合均匀，然后放在冰上 20 分钟（图 2E）。
15. 将氨苄青霉素（50 mg/mL）储存液加入甘露醇-豌豆肉汤（PM）培养基中，使氨苄青霉素终浓度为50 μg /mL，搅拌均匀，备用。
16. 加入 2 mL的 PM 培养基，缓慢倒置一次，然后放在冰上 2 分钟。
17. 加入 8 m L的 PM 培养基，缓慢倒置一次，然后放在冰上 2 分钟。
18. 在每个 Falcon 管中加入 10 m L的 PM 介质。将其在 25°C 的倾斜支架中孵育，并在一夜之间再生（图 2F）。
19. 取 5 μL已再生过夜（~14 小时）的培养物，并在显微镜下检查再生。以 430 × g离心 Falcon 管 5 分钟以沉淀再生菌丝（图 2G）。
20. 弃去上清液，在管内留下约 5 mL的液体，轻轻吸管使其悬浮，然后加入 35 mL 含有 25 μg / mL G418的豌豆/0.5 M 甘露醇琼脂培养基。上下混合，倒入培养皿中，吹干水蒸气，25°C避光孵育（图2H）。
21. 2-3天后，新菌丝长出后，盖上15ml含50μg /ml G418的V8琼脂培养基，吹干水汽，25℃避光继续培养（图2I））。
22. 大约经过 3～4天，菌丝体又长出。用密集的菌丝切割单个再生的小菌落，并将它们转移到含有 50 μg /m L G418 f或培养物的 V8 板上。获得的再生菌株最初被认为是敲除突变体，用于后续鉴定和表型分析。

图 2. PEG 介导的酱油转化过程。
(A)在营养豌豆肉汤上培养了一个P. sojae （菌株 P6497）菌落 3-5 天。 (B) 用琼脂塞在烧瓶中接种营养豌豆汤。图像是在接种 3 天后拍摄的。 (C)使用翻转混合器消化大豆菌丝体。 (D) 过滤菌丝并将原生质体收集在带有两层mira布的 50 mL 烧杯中。 (E) 沿着 Falcon 管壁慢慢加入 40% PEG 溶液，让液滴滑到管底。 (F) 以倾斜和静态的方式在 25°C 下孵育原生质体，并让它们再生过夜。 (G) 在显微镜下检查再生菌丝。 (H) 用再生原生质体倒板。 (一)新菌丝长出后，盖上含50 微克/毫升 G418。

E. 敲除突变体的筛选和验证
建议将疫霉转化获得的抗性转化子在含有 G418 的平板上生长 7 天，然后再筛选转化子。提取转化子的基因，然后通过基因组PCR和测序方法筛选和验证敲除突变体。
1. 菌丝体基因组 DNA 粗提 CTAB 方法：
a. 将适量菌丝体刮入2 mL离心管中，加入500 μL 2% CTAB和500 μL氯仿， 37°C摇床1-2小时。
b. × g离心管10 分钟。取上清液 400 μL ，转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 800 μL无水乙醇，混匀，-20°C 降水超过 30 分钟。
c. 16,000 × g离心管10 分钟，弃去上清液，再次离心 2 分钟，然后用移液器完全吸出上清液。
d. 将离心管置于 50°C 的烤箱中 10 – 20 分钟，让乙醇挥发。
e. 用 30 μL ddH 2 O 溶解并储存在 -20°C。
2. 选择：基因组 DNA 的精细提取
使用天根新植物基因组提取试剂盒（DP320-50），按照厂家说明进行操作。
3. 筛选敲除突变体
a. 使用Ps139767基因内部引物139767-genome-F/R进行PCR，验证基因组中是否存在Ps139767序列。选择不含 Ps139767 信号的转化子作为候选敲除突变体。
b. 用引物 139767-overup-F1 在上臂外 1 kb 用 HPH 内部引物 Hph-overup-R1 和 HPH 内部引物 Hph-overdown-F2 用引物 139767-overdown-R2 在下臂外 1kb 进行 PCR，以验证替换片段已成功整合到基因组中的正确位置（图 3）。
c. M13F 和 M13R测序进一步验证 PCR 结果，筛选候选敲除突变体。

设置从候选突变体中提取的基因组 DNA 的 PCR 扩增反应：
dNTP 2微升_
10× PCR 缓冲液（Mg 2+ plus） 2.5微升_
rTaq 0.25微升_
正向寡核苷酸 (10 uM ) 0.25微升_
反向寡核苷酸 (10 uM ) 0.25微升_
模板 1.5微升_
将 ddH 2 O 添加到 25μL _ _
通过 PCR 扩增目标区域 [退火温度 (x) 和延伸时间 (n) 取决于引物]：
95 ℃ 5分钟 1个周期
95 ℃ 30 秒 32 个周期
x °C 30 秒
72 ℃ n 分钟
72 ℃ 5分钟 1个周期
4 ℃ 抓住 1个周期

图 3. 来自 Ps139767 候选转化体的基因组 DNA 分析。

食谱

1. Luria-Bertani 培养基 (1 L)
10 克Bacto胰蛋白胨
5克酵母提取物
10 克氯化钠
1.5% 琼脂（w/v，用于固体培养基）
使用前高压灭菌并在室温下储存。
2. 10% V8 琼脂 (1 L)
100 m L V8 果汁
900 m L ddH 2 O
1克碳酸钙3
1.5% 琼脂（w/v，用于固体培养基）
使用前高压灭菌并在室温下储存。
3. 豌豆汤（1升）
120 克冷冻豌豆
700 毫升ddH 2 O
高压灭菌并收集上清液
4. 维生素原液（300毫升）
10 μ L 0.02 g/m L生物素
10 μ L 0.02 g/m L叶酸
0.012 克 L-肌醇
0.06 克烟酸
0.18 克吡哆醇-HCl
0.015 克核黄素
0.38 克硫胺素-HCl
添加ddH 2 O至 300 m L
过滤除菌，然后在 4°C 下储存（最多 1 年）。
5. 微量元素（400毫升）
0.215克FeC 6 H 5 O 7 ·3H 2 O
0.15g ZnSO 4 ·7H 2 O
0.03 g CuSO 4 ·5H 2 O
0.015g MgSO 4 ·H 2 O
0.01 克 H 3 BO 3
0.007g MoO 3
添加ddH 2 O至 400 m L
过滤除菌，然后在 4°C 下储存（最长 1 年）。
6. 营养豌豆汤和琼脂培养基（1 L）
1.0 克 KH 2 PO 4
1.0 克 K 2 HPO 4
3.0 克硝酸钾3
0.5 克硫酸镁4
0.1 克氯化钙2
2.0 克碳酸钙3
5.0 克 D-山梨糖醇
5.0 克 D-甘露醇
5.0 克葡萄糖
2.0 克酵母提取物
2.0 m L维生素原液（见上面的配方）
2.0 m L微量元素（见上面的配方）
900 m L豌豆汤（见上面的食谱）
2 O调整到 1 L
1% 琼脂（w/v，用于固体培养基）
在 121°C 高压灭菌 20 分钟并在 4°C 下储存。
7. 酶溶液（20 毫升）
10 m L 0.8 M 甘露醇
0.8 m L 0.5 M KCl
0.8 m L的 0.5 M MES
0.4 m L 0.5 M CaCl 2
0.15 g Trichoderma harzianum裂解酶
0.06 克 CELLULYSIN 纤维素酶
8 m L ddH 2 O
8. W5 溶液（250毫升）
0.093 克氯化钾
4.6克CaCl 2 ·2H 2 O
2.25 克氯化钠
7.8 克葡萄糖
添加ddH 2 O至 250 m L
在 121°C 高压灭菌 20 分钟并在 4°C 下储存。
9. 0.5 M MES-KOH 溶液
4.88 克
40 m L ddH 2 O
使用 1 M KOH 将 pH 值调节至 5.7 并过滤灭菌。
10. MMg溶液（250毫升）
18.22 克甘露醇
0.76 g MgCl 2 ·6H 2 O
2 毫升0.5 M MES (pH = 5.7)
添加ddH 2 O至 250 m L
在 121°C 高压灭菌 20 分钟并在 4°C 下储存。
11. 40% PEG 溶液（w/v，31.5 mL，足够 12 个样品）
12 克 PEG4000
7.5 m L 0.8 M 甘露醇
6 m L ddH 2 O
6 m L 0.5 M CaCl 2
过滤除菌并储存在 4°C。
12. 甘露醇豌豆汤（1 L）
91.1 克甘露醇
1.32克CaCl 2 ·2H 2 O
2克碳酸钙3
900 m L豌豆汤（见上面的食谱）
将 ddH 2 O 添加到 1 L
1%细菌琼脂（w/v，用于固体培养基）
13. 2% CTAB 溶液 (800 毫升)
80 m L 1 M Tris-HCl
32 m L 0.5 M EDTA
65.52 克氯化钠
16 克 CTAB
添加 ddH 2 O 至 800 m L
溶解在 65 °C水浴中，使用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 8.0。

致谢

我们感谢Brett Tyler 博士（俄勒冈州立大学，科瓦利斯）为我们提供了 pYF515和pBluescript SK II+ 质粒。这项工作得到了中国现代农业产业技术系统 (CARS-004-PS14) 对 WY 的资助, 中国国家创新研究小组基金对 YW 的资助 (31721004) , 中国博士后科学基金邱敏资助（ 2020M681642 ）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

1. Deveau , H., Garneau, JE 和Moineau , S. (2010)。 CRISPR/ Cas系统及其在噬菌体-细菌相互作用中的作用。 Annu Rev Microbiol 64：475-493。
2. Fang, Y. 和 Tyler, BM (2016)。使用 CRISPR/Cas9有效破坏和替换卵菌大豆疫霉中的效应基因。摩尔植物病理学17（1）：127-139。
3. Garneau, JE, Dupuis, ME, Villion , M., Romero, DA, Barrangou , R., Boyaval , P., Fremaux , C., Horvath, P., Magadan, AH 和Moineau , S. (2010)。 CRISPR/Cas 细菌免疫系统切割噬菌体和质粒 DNA。自然468（7320）：67-71。
4. Horvath, P. 和Barrangou , R. (2010)。 CRISPR/Cas，细菌和古细菌的免疫系统。科学327（5962）：167-170。
5. Hsu, PD, Lander, ES 和 Zhang, F. (2014)。 CRISPR-Cas9在基因组工程中的开发和应用。单元格157（6）：1262-1278。