材料和试剂
1. 2 mL 螺旋盖管（Omni International Inc.，目录号：19-628）预装 1 mL 病毒转运培养基（VTM）
2. Corning 2 mL内螺纹聚丙烯低温小瓶，自立式圆底（Corning，目录号：431386）
3. 棉签（ Dynarex ，目录号：4305）
4. PCR管：96孔板格式（Bio-Rad，目录号：HSP9601），带有板密封膜（Bio-Rad，目录号：MSB1001）
5. 病毒运输培养基，按照美国疾病控制和预防中心 (US CDC) 协议 (SOP#: DSR-052-05) 制作。虽然我们使用我们实验室制造的美国 CDC VTM 进行该协议，但作者知道，根据任何给定实验室环境中试剂的可用性，许多其他市售 VTM 有资格被替代。
6. DMEM 中的 HCoV-229E 病毒原液，由细胞培养物制备
HCoV-229E（ATCC，目录号：VR-740）按照制造商对标准 DMEM（Gibco，目录号：11965092）中 MRC-5 细胞（ATCC，目录号：CCL-171）的建议进行培养。接种后 72 小时按照制造商的说明收集细胞培养基，然后用作这些实验的病毒原液。
7. Corning 75 cm 2 U形斜颈细胞培养瓶，带通气盖（Corning，目录号：430641U）
8. Corning PureCoat Amine 6孔组织培养板（Corning，目录号：354721）
9. Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit（New England Biolabs，目录号：E3005S）
10. HCoV-229E N 正向和反向引物组（Integrated DNA Technologies，定制寡核苷酸采购）
a. N基因正向引物：5'-AGGCGCAAGAATTCAGAACCAGAG-3'
b. N基因反向引物：5'-AGCAGGACTCTGATTACGAGAAAG-3'
11. 分子级琼脂糖（Bio-Rad，目录号：161-3101）
12. 溴化乙锭（Bio-Rad，目录号：161-0433）
13. TBE 缓冲液（IBI Scientific，目录号：IB70153）
14. 100 bp分子标尺（Bio-Rad，目录号：1708202）
15. 台盼蓝（Bio-Rad，目录号：1450021）

设备

1. Bead Ruptor Elite（Omni International Inc.，目录号：19-042E）
2. CFX 连接（Bio-Rad，目录号：1855201）
3. Gel Doc EZ 成像系统（Bio-Rad，目录号：1708270）
4. Rainin Classic 手动移液器（ Rainin ，目录号：17008708）
5. ThermoFisher Fresco 17 微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002421）
6. 凝胶电泳室（ BioRad ，目录号：1704487EDU）
7. Thermo Scientific TSX 超低温冰箱（Thermo Fischer Scientific，目录号：09313868）

软件

1. CFX 软件 Bio-Rad CFX Maestro 1.1 版本 4.1.2433.1219
2. EZ Imager Software Image Lab TM版本 6.0.0 build 25

程序

A. HCoV-229E 病毒原液制备和稀释
1. 按照制造商的说明，在 MRC-5 细胞上培养 HCoV-229E 病毒储备，并从细胞上清液中收获病毒。使用该病毒感染 80% 融合的 MRC-5 细胞，这些细胞被镀在 T-75 烧瓶中，感染复数 (MOI) 为 1.6。感染后将受感染的细胞再培养 72 小时，直到观察到大于 70% 的细胞病变效应 (CPE)。收获细胞培养上清液以制造 HCoV-229E 病毒原液，用于这些实验。将收获的上清液以 3,000 × g离心10 分钟，以沉淀溶液中的任何细胞碎片。离心后，将含有病毒的上清液转移到干净的 15 mL 锥形管中进行储存，并丢弃颗粒碎片。
2. 病毒原液纯化后，完成噬菌斑测定以确定起始病毒载量。在该协议中，我们的病毒储备的 HCoV-229E 浓度为 1.2 × 10 6 PFU/mL。通过将病毒原液连续稀释到 MRC-5 细胞上进行斑块测定，这些细胞在 6 孔板中镀到 80% 的汇合度。此过程的起始细胞计数为 2 mL 培养基中的 200,000 个细胞/孔。添加病毒后，在评估斑块形成之前让细胞生长 5 天。
3. 用 10 mL 1.2 × 10 6 PFU/mL 的 HCoV-229E 病毒原液，通过移液器将 1 mL 原液移入 9 mL 病毒转运介质中，逐步稀释 HCoV-229E，将新稀释液倒置 3 次，然后然后将 1 mL 移液到下一管 9 mL 病毒运输介质中。进行此连续稀释，直到获得 1.2 × 10 1 PFU/ mL 的库存。在最后的稀释步骤中，在管的三个倒置之后，移液器 1 mL 的病毒原液并丢弃以保持准确的浓度。该步骤在所有试剂解冻至室温的情况下进行。
4. 将 HCoV-229E 库存稀释液储存在 -80°C 的 2 mL 低温储存瓶中，直到需要，如果在库存稀释生产后 2 小时内未使用。

B. 样本拭子制备
1. 如果当前无法使用，将 HCoV-229E 原液稀释液解冻至 4°C。在室温下进行剩余的拭子制备程序。
2. 将 1 mL 的无菌病毒运输介质 (VTM) 移液器放入干净的 2 mL 螺帽管中。不要丢失这些管子的盖子，因为它们在均质化步骤中是必需的。
3. 一旦 HCoV-229E 原液解冻，通过将棉签浸入 HCoV-229E 稀释液中 5 秒，从每个稀释液中制备用于 PCR 检测的拭子样本，以使其完全饱和，然后将拭子直接放入其中一个预填充液中2 毫升螺旋盖管。
4. 在将棉签保持在 VTM 内的同时折断棉签的柄，并更换 2 mL 管上的螺帽。
5. 重复步骤 B2-B4，直到为每个稀释度创建所需数量的拭子，为 PCR 检测做准备。
注意：我们建议每个浓度至少 5 个拭子用于初步检测限制，一旦确定目标浓度，至少需要额外重复 30 次以确认。

C. 摇床均质化
1. 确保含有 1 mL VTM 和拭子的螺旋盖管密封。将 2 mL 管架放在 Bead Ruptor Elite 上。将螺旋盖管装入 2 mL 托架上，然后拧紧指板，并盖上盖子。
2. 在 4.2 m/s 和室温下均质化 30 s。
3. 由于均质化，管内可能会产生一些泡沫；这个是正常的。为减轻试管中的任何泡沫，请将它们从 Bead Ruptor Elite 中取出，并在微量离心机中以高达 10,000 × g的速度旋转试管，时间不超过 15 秒。

D. 逆转录定量PCR
1. 准备 RT-qPCR HCoV-229E N Primer Mastermix ，如配方部分所述。
2. 使用 Luna 通用一步 RT-qPCR 试剂盒制备 RT-qPCR 混合物，如下表（表 1）中所述。

表 1. 用于 RT-qPCR 的 Luna 通用一步法 RT-qPCR 混合物
试剂每次反应的体积
Luna 通用一步反应混合物 (2 × ) 10 µL
Luna WarmStart ® RT 酶混合物 (20 × ) 1 µL
正向引物 (5 µM) 1.25 µL
反向引物 (5 µM) 1.25 µL
模板 RNA 1 µL
无核酸酶水 5.5 µL

3. 为纯化的 HCoV-229E RNA 的阳性对照、均质化的 HCoV-229E 的未知样品和使用 DPEC 和无 HCoV-229E RNA 的阴性对照准备 PCR 板。
4. 将 1 μL 样品（阳性、未知或阴性）装入每个孔中，如上表所示。
5. 用封板膜封住 PCR 板。
6. 将板放入 CFX Connect 并使用以下循环参数运行 RT-qPCR：
a. 55°C 30 分钟
b. 95°C 1 分钟
c. 95°C 15 秒和 56°C 30 秒的 44 个循环
d. 保持在 4°C 用于进一步处理

E. 扩增子确认
1. 使用 TBE 缓冲液和 5 μL 的 10 mg/mL 溴化乙锭库存制备 2% 琼脂糖凝胶，用于扩增子可视化。可以使用 15 孔和 8 孔梳，以创建足够大的孔以容纳 20 µL 体积的样品。在这里，我们选择在凝胶中使用 15 孔梳，因为我们试图可视化大量样品。
2. 在 RT-qPCR（1:1 混合物）之后，将 20 μL 的台盼蓝装入 20 μL 的可疑扩增子中。
3. 将 20 μL 的扩增子/台盼混合物装入 2% 琼脂糖凝胶的每个井中，将 3 μL 的 100 bp 分子标尺在 12 μL 的台盼蓝中装入其中一个井中。
4. 在 125 V 下运行凝胶约 1 小时，或直到条带充分分离。
5. 使用 Gel Doc EZ Imager System 可视化凝胶，以观察扩增子产物与梯子相比的大小。 EZ Imager 软件设置为标准溴化乙锭曝光设置，并针对凝胶成像的条带强度进行设置。这允许在 308 bp 处识别 N 基因混合物的目标扩增子大小。

数据分析

根据美国疾控中心和世界卫生组织 (WHO) 的建议，在 PCR 检测中 Ct 值小于 40 ( Bustin ) 的冠状病毒相关疾病的检测应视为阳性。等。 , 2020 和 Cheng等人, 2020)。虽然这些建议是针对 SARS-CoV-2 检测提出的，但我们也采用它们作为我们方案中 HCoV-229E 阳性检测的适当截止值。当使用 Ct < 40 作为 RT-qPCR 的截止值时，我们仍然想通过凝胶可视化确认是否存在适当的扩增子大小 (308 bp)，因为使用了具有二聚体潜力的标准核苷酸引物假阳性。通过 RT-qPCR 检测，我们能够自信地确认样本中存在 HCoV-229E。
支持本文所述检测研究的体外限制的数据可从《病毒学杂志》（Morehouse等人，2020 年）的开放获取中获得。此外，介绍该方法对 SARS-CoV-2 检测的临床验证的手稿也可通过 PLOS ONE 开放获取（Morehouse等人，2021 年）。

笔记

虽然该协议是使用针对 HCoV-229E 的 N 基因的传统核苷酸引物组完成的，但可以将传统引物替换为荧光探针。如果使用探针代替引物，则还需要将 RT-qPCR 试剂盒更改为与荧光探针兼容的试剂盒。此外，如果使用探针，则不需要在 RT-qPCR 后在琼脂糖凝胶上进行扩增子可视化，因为使用荧光淬灭系统时引物自结合或二聚化的风险最小。

致谢

作者要感谢 Omni International Inc 的 Karl Jahn 和 Pete Tortorelli为我们开发此方法的工作提供的组织和财务支持。此外，我们要感谢 Rachel Nash 和 Leah Proctor 对我们研究工作的持续鼓励，特别感谢他们在 COVID-19 大流行初期为支持我们在这个项目上的工作所做的牺牲。
作者要承认，该协议已改编自 Morehouse等人以前的工作。 (2020) 题为“A new two-step, direct-to-PCR method for virus detection off swabs using human coronavirus 229E” ，于 2020 年 8 月 25 日发表在Virology Journal上 ( doi : 10.1186/s12985-020-01405-y)。

利益争夺

ZPM、CMP 和 RJN 是 Omni International, A PerkinElmer Company 持有的描述该方法的专利的发明人，但在该技术的直接商业化过程中没有个人经济利益可披露。 CMP、GLR 和 RJN 都是 Omni International Inc, A PerkinElmer Company 的全职员工，GLR 和 RJN 在公司业绩中没有个人经济利益。 CMP 是 PerkinElmer 的股东，在公司业绩中持有个人经济利益。 ZPM 与 PerkinElmer 旗下公司 Omni International 有咨询关系，并且在公司业绩中不持有个人经济利益。 ZPM 和 RJN 还与 Jeevan Biosciences LLC 有关联，该公司不参与本手稿中描述的工作。

伦理

此处描述的方案中没有使用人类受试者、患者样本或动物受试者，因此不需要 IUCAUC 或 IRB 批准。

参考

1. Elnifro ，EM， Ashshi ，AM，Cooper，RJ 和Klapper ，PE（2000 年）。多重 PCR：在诊断病毒学中的优化和应用。临床微生物学第 13(4) 版：559-570。
2. Bustin , SA 和 Nolan, T. (2020)。 SARS-CoV-2 的 RT-qPCR 测试：引物。诠释 J Mol Sci 21（8）。
3. Morehouse, ZP, Proctor, CM, Ryan, GL 和 Nash, RJ (2020)。一种新的两步直接 PCR 方法，用于使用人类冠状病毒 229E 检测拭子上的病毒。病毒学杂志17 （1）：129。
4. Morehouse, ZP, Samikwa , L., Proctor, CM, Meleke , H., Kamdolozi , M., Ryan, GL, Chaima, D., Ho, A., Nash, RJ 和 Nyirenda, TS (2021)。利用机械均质化验证直接 PCR COVID-19 检测方案：减少准确检测所需资源的模型。公共科学图书馆一号16(8)：e0256316。
5. Cheng, MP, Papenburg , J., Desjardins, M., Kanjilal , S., Quach, C., Libman , M., Dittrich, S. 和Yansouni , CP (2020)。严重急性呼吸综合征相关冠状病毒 2 的诊断测试：叙述性评论。 Ann Intern Med 172（11）：726-734。